本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)血小板的方法。本說明書是在以下國家研究項目的支持下準(zhǔn)備的。[表1]

背景技術(shù)：

1、將血小板制劑施用至患有手術(shù)或受傷期間的大出血、或與化療之后的血小板減少癥相關(guān)的出血的患者，用于治療和預(yù)防這些癥狀的目的。

2、目前，血小板制劑的生產(chǎn)依賴于來自健康志愿者的獻(xiàn)血。最近，獻(xiàn)血者的數(shù)量減少，并且預(yù)期未來會血液短缺。因此，血小板的穩(wěn)定供應(yīng)是該技術(shù)領(lǐng)域的重要問題。

3、傳統(tǒng)的血小板制劑具有高的細(xì)菌污染的風(fēng)險，這可能會在血小板輸注之后導(dǎo)致嚴(yán)重感染。因此，臨床環(huán)境中對更安全的血小板制劑存在持續(xù)需求。

4、為了滿足該需求，最近已開發(fā)用于從體外培養(yǎng)的巨核細(xì)胞生產(chǎn)血小板的方法。然而，還沒有以高產(chǎn)量獲得血小板，并且該過程不是經(jīng)濟(jì)可行的，需要技術(shù)改進(jìn)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明要解決的問題

2、本發(fā)明的目的是提供用于以高產(chǎn)量生產(chǎn)人造血小板的方法。

3、本發(fā)明的另一個目的是提供用于以高工藝效率(process?efficiency)生產(chǎn)血小板的方法。

4、用于解決問題的方案

5、1.一種用于生產(chǎn)血小板的方法，其包括：(s1)培養(yǎng)多能干細(xì)胞以獲得含有造血干細(xì)胞的培養(yǎng)物；(s2)當(dāng)培養(yǎng)物中含有的細(xì)胞中cd41a-細(xì)胞的數(shù)量為細(xì)胞的總數(shù)的至少15％時，從培養(yǎng)物中獲得懸浮細(xì)胞群；和(s3)在第一培養(yǎng)基中使懸浮細(xì)胞群分化為巨核細(xì)胞。

6、2.根據(jù)上述1的用于生產(chǎn)血小板的方法，其進(jìn)一步包括(s4)在含有血小板生成素的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)巨核細(xì)胞和使巨核細(xì)胞成熟。

7、3.根據(jù)上述1的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中(s1)包括以下步驟：(s1a)在含有g(shù)sk3抑制劑的第三培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞；(s1b)在含有血管內(nèi)皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子的第四培養(yǎng)基中培養(yǎng)在第三培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞；和(s1c)在含有血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、和轉(zhuǎn)化生長因子β信號傳導(dǎo)抑制劑的第五培養(yǎng)基中培養(yǎng)在第四培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞。

8、4.根據(jù)上述1的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中懸浮細(xì)胞群具有總細(xì)胞計數(shù)的50％以下的cd45+細(xì)胞計數(shù)。

9、5.根據(jù)上述1的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中懸浮細(xì)胞群具有總細(xì)胞計數(shù)的45％以上的cd34+細(xì)胞計數(shù)。

10、6.根據(jù)上述1的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中懸浮細(xì)胞群具有總細(xì)胞計數(shù)的85％以下的cd41a-細(xì)胞計數(shù)。

11、7.根據(jù)上述1的用于生產(chǎn)血小板的方法，其進(jìn)一步包括(s0)以2,000至20,000個細(xì)胞/cm2在培養(yǎng)容器的底部接種多能干細(xì)胞。

12、8.根據(jù)上述1的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中培養(yǎng)物進(jìn)一步包含造血祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞祖細(xì)胞。

13、9.根據(jù)上述1的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中第一培養(yǎng)基包含血小板生成素、干細(xì)胞因子、白介素-3、和白介素-6。

14、10.根據(jù)上述1的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中，在(s2)中，當(dāng)培養(yǎng)物中含有的細(xì)胞中cd41a+細(xì)胞的數(shù)量為細(xì)胞的總數(shù)的40至85％時，從培養(yǎng)物中獲得懸浮細(xì)胞群。

15、11.根據(jù)上述1的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中，在(s2)中，當(dāng)培養(yǎng)物中含有的細(xì)胞中cd34+細(xì)胞的數(shù)量為細(xì)胞的總數(shù)的45至80％時，從培養(yǎng)物中獲得懸浮細(xì)胞群。

16、12.根據(jù)上述1的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中，在(s2)中，當(dāng)培養(yǎng)物中含有的細(xì)胞中cd45+細(xì)胞的數(shù)量為細(xì)胞的總數(shù)的1至50％時，從培養(yǎng)物中獲得懸浮細(xì)胞群。

17、13.根據(jù)上述1的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中多能干細(xì)胞為人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

18、14.根據(jù)上述4的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中懸浮細(xì)胞群的cd45+細(xì)胞的比例低于cd41a+細(xì)胞的比例。

19、15.一種用于生產(chǎn)血液制品的方法，其包括將通過上述1至14中任一項的方法生產(chǎn)的血小板與其他血液組分混合的步驟。

20、發(fā)明的效果

21、本發(fā)明的用于生產(chǎn)血小板的方法不需要cd41a+細(xì)胞的分離和純化，這是因為巨核細(xì)胞從含有至少15％?cd41a-細(xì)胞的懸浮細(xì)胞群生產(chǎn)。

22、本發(fā)明的用于生產(chǎn)血小板的方法能夠?qū)崿F(xiàn)快速且經(jīng)濟(jì)的血小板生產(chǎn)，這是因為當(dāng)懸浮細(xì)胞群滿足某些要求時可以進(jìn)行后續(xù)過程。

23、本發(fā)明的用于生產(chǎn)血小板的方法具有優(yōu)異的向巨核細(xì)胞的分化效率和血小板生產(chǎn)效率。

24、本發(fā)明的用于生產(chǎn)血小板的方法簡單，不需要復(fù)雜的設(shè)備，并且就時間和成本而言是有利的。

25、根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的血小板可以由刺激劑(例如，adp(二磷酸腺苷)、膠原蛋白、纖維蛋白原等)激活以增加pac-1和cd62p表達(dá)。這確認(rèn)了本發(fā)明的血小板是具有正常功能的血小板。

26、根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的血小板可以表現(xiàn)出對與血小板減少或功能障礙有關(guān)的疾病的治療或預(yù)防作用。

技術(shù)特征：

1.一種用于生產(chǎn)血小板的方法，其包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)血小板的方法，其進(jìn)一步包括(s4)在含有血小板生成素的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述巨核細(xì)胞和使所述巨核細(xì)胞成熟。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中(s1)包括以下步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中所述懸浮細(xì)胞群具有總細(xì)胞計數(shù)的50％以下的cd45+細(xì)胞計數(shù)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中所述懸浮細(xì)胞群具有總細(xì)胞計數(shù)的45％以上的cd34+細(xì)胞計數(shù)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中所述懸浮細(xì)胞群具有總細(xì)胞計數(shù)的85％以下的cd41a-細(xì)胞計數(shù)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)血小板的方法，其進(jìn)一步包括(s0)以2,000至20,000個細(xì)胞/cm2在培養(yǎng)容器的底部接種所述多能干細(xì)胞。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中所述培養(yǎng)物進(jìn)一步包括造血祖細(xì)胞和巨核細(xì)胞祖細(xì)胞。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中所述第一培養(yǎng)基包含血小板生成素、干細(xì)胞因子、白介素-3、和白介素-6。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中，在(s2)中，當(dāng)所述培養(yǎng)物中含有的細(xì)胞中cd41a+細(xì)胞的數(shù)量為細(xì)胞的總數(shù)的40至85％時，從所述培養(yǎng)物中獲得懸浮細(xì)胞群。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中，在(s2)中，當(dāng)所述培養(yǎng)物中含有的細(xì)胞中cd34+細(xì)胞的數(shù)量為細(xì)胞的總數(shù)的45至80％時，從所述培養(yǎng)物中獲得懸浮細(xì)胞群。

12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中，在(s2)中，當(dāng)所述培養(yǎng)物中含有的細(xì)胞中cd45+細(xì)胞的數(shù)量為細(xì)胞的總數(shù)的1至50％時，從所述培養(yǎng)物中獲得懸浮細(xì)胞群。

13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中所述多能干細(xì)胞為人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

14.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于生產(chǎn)血小板的方法，其中所述懸浮細(xì)胞群的cd45+細(xì)胞的比例低于cd41a+細(xì)胞的比例。

15.一種用于生產(chǎn)血液制品的方法，其包括將通過權(quán)利要求1至14中任一項所述的方法生產(chǎn)的血小板與其他血液組分混合的步驟。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)血小板的方法。本發(fā)明的方法包括以下的步驟：(S1)培養(yǎng)多能干細(xì)胞以獲得含有造血干細(xì)胞的培養(yǎng)物；(S2)當(dāng)培養(yǎng)物中不表達(dá)CD41a的細(xì)胞構(gòu)成總細(xì)胞的至少15％時，從培養(yǎng)物中獲得懸浮細(xì)胞群；和(S3)使懸浮細(xì)胞群分化為巨核細(xì)胞，由此該方法能夠以高產(chǎn)量生產(chǎn)高質(zhì)量血小板。

技術(shù)研發(fā)人員：金恥花,黃致淵
受保護(hù)的技術(shù)使用者：杜塞爾股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/22