本公開涉及分子生物學(xué)，尤其涉及一種酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法及其應(yīng)用、基因克隆方法和基因克隆試劑體系。

背景技術(shù)：

1、在醫(yī)學(xué)和檢測技術(shù)不斷發(fā)展的歷程當(dāng)中，人們逐漸意識(shí)到dna和rna的檢測是實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療的必備工具和關(guān)鍵步驟。通過對(duì)核酸的檢測和分析，研究人員能夠了解到許多遺傳型疾病的致病原理，可以用于區(qū)分癌癥的具體分型，還可以用于感染性疾病的診斷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開的實(shí)施例的目的在于提供一種酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法及其應(yīng)用、基因克隆方法和基因克隆試劑體系，用于保護(hù)酶識(shí)別位點(diǎn)免受限制性內(nèi)切酶的識(shí)別與切割。

2、為達(dá)到上述目的，本公開的實(shí)施例提供了如下技術(shù)方案：

3、一方面，提供一種酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法，該方法包括：設(shè)計(jì)引導(dǎo)序列引導(dǎo)dcas酶覆蓋目標(biāo)基因序列待保護(hù)的酶識(shí)別位點(diǎn)，使得該待保護(hù)的酶識(shí)別位點(diǎn)免受限制性內(nèi)切酶的識(shí)別與切割。

4、上述酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法中，結(jié)合有dcas酶的目標(biāo)基因序列在酶識(shí)別位點(diǎn)處產(chǎn)生空間位阻，當(dāng)限制性內(nèi)切酶對(duì)目標(biāo)基因序列進(jìn)行酶切的時(shí)候，該空間位阻使得限制性內(nèi)切酶無法完成正常的識(shí)別與切割。

5、在一些實(shí)施例中，所述目標(biāo)基因序列包括：相同堿基序列的非目標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)和至少一個(gè)目標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)，待保護(hù)的酶識(shí)別位點(diǎn)復(fù)稱為目標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)。

6、在一些實(shí)施例中，所述目標(biāo)基因序列包括：質(zhì)粒和線性dna片段中的任一種。

7、在一些實(shí)施例中，所述引導(dǎo)序列包括：核苷酸單鏈；所述核苷酸單鏈包括：由5’端至3’端相連接的第一片段和第二片段，其中，所述第一片段用于與所述目標(biāo)基因序列結(jié)合，所述第二片段用于與dcas酶結(jié)合。

8、另一方面，提供一種基因克隆方法，該方法包括：制備核糖核蛋白復(fù)合物溶液、制備樣本溶液以及制備酶切體系，并進(jìn)行酶切。核糖核蛋白復(fù)合物包括：dcas酶和引導(dǎo)序列。樣本包括：目標(biāo)基因序列和所述核糖核蛋白復(fù)合物；其中，所述引導(dǎo)序列引導(dǎo)所述dcas酶覆蓋所述目標(biāo)基因序列待保護(hù)的酶識(shí)別位點(diǎn)。酶切體系包括：限制性內(nèi)切酶和所述樣本，在所述dcas酶的保護(hù)下，使得該待保護(hù)的酶識(shí)別位點(diǎn)免受限制性內(nèi)切酶的識(shí)別與切割。

9、在一些實(shí)施例中，所述目標(biāo)基因序列包括：相同堿基序列的非目標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)和至少一個(gè)目標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)，待保護(hù)的酶識(shí)別位點(diǎn)復(fù)稱為目標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)。在所述酶切步驟中，所述目標(biāo)基因序列的非目標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)被所述限制性內(nèi)切酶識(shí)別并切割。

10、上述基因克隆方法具有與上述一些實(shí)施例中提供的酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法相同的有益技術(shù)效果，在此不再贅述。

11、又一方面，提供一種基因克隆試劑體系，該體系包括：核糖核蛋白復(fù)合物溶液；其中，所述核糖核蛋白復(fù)合物溶液包括：dcas酶溶液和引導(dǎo)序列溶液。在所述dcas酶溶液中，所述dcas酶的濃度范圍為1μmol/l～20μmol/l；所述dcas酶溶液的體積與所述核糖核蛋白復(fù)合物溶液的體積的比值范圍為1:10～3:10。在所述引導(dǎo)序列溶液中，所述引導(dǎo)序列的濃度范圍為2μmol/l～9μmol/l；所述引導(dǎo)序列溶液的體積與所述核糖核蛋白復(fù)合物溶液的體積的比值范圍為1:10～3:10。

12、在一些實(shí)施例中，所述核糖核蛋白復(fù)合物溶液還包括：第一緩沖溶液。所述第一緩沖溶液包括：1000mmol/l～1500mmol/l的nacl，400mmol/l～600mmol/l的tris-hcl，80mmol/l～150mmol/l的mgcl2，800μg/ml～1500μg/ml的重組蛋白，所述第一緩沖溶液的ph取值范圍為7.9～8.1。所述第一緩沖溶液的體積與所述核糖核蛋白復(fù)合物溶液的體積的比值范圍為1:10～3:10。

13、在一些實(shí)施例中，基因克隆試劑體系還包括：樣本溶液。其中，所述樣本溶液包括：所述核糖核蛋白復(fù)合物溶液和目標(biāo)基因序列溶液。所述核糖核蛋白復(fù)合物溶液的體積與所述樣本溶液的體積的比值范圍為3:20～1:2。所述目標(biāo)基因序列的拷貝數(shù)大于或等于103；所述目標(biāo)基因序列溶液的體積與所述樣本溶液的體積的比值范圍為1:20～1:4。

14、在一些實(shí)施例中，所述樣本溶液還包括：第二緩沖溶液。所述第二緩沖溶液包括：

15、1000mmol/l～1500mmol/l的nacl，400mmol/l～600mmol/l的tris-hcl，80mmol/l～150mmol/l的mgcl2，800μg/ml～1500μg/ml的重組蛋白，所述第二緩沖溶液的ph取值范圍為7.9～8.1；所述第二緩沖溶液的體積與所述樣本溶液的體積的比值范圍為1:10～3:10。

16、在一些實(shí)施例中，基因克隆試劑體系還包括：酶切體系。其中，所述酶切體系包括：所述樣本溶液和限制性內(nèi)切酶溶液；所述樣本溶液的體積與所述酶切體系的體積的比值范圍為1:10～1:2。在所述限制性內(nèi)切酶溶液中，所述限制性內(nèi)切酶的濃度范圍為4u/μl～20u/μl。所述限制性內(nèi)切酶溶液的體積與所述酶切體系的體積的比值范圍為1:20～1:10。

17、在一些實(shí)施例中，所述酶切體系還包括：第三緩沖溶液。所述第三緩沖溶液包括：

18、100mmol/l～330mmol/l的tris-hcl，80mmol/l～150mmol/l的mgcl2，

19、660mmol/l～1000mmol/l的kcl，0.5mg/ml～1.5mg/ml的牛血清蛋白；所述第三緩沖溶液的ph取值范圍為7.9～8.5；所述第三緩沖溶液的體積與所述酶切體系的體積的比值范圍為1:10～3:20。

20、上述基因克隆試劑體系具有與上述一些實(shí)施例中提供的酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法相同的有益技術(shù)效果，在此不再贅述。

21、又一方面，提供一種如上述任一實(shí)施例所述的酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法在質(zhì)粒構(gòu)建中的應(yīng)用。

22、又一方面，提供一種如上述任一實(shí)施例所述的酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法在重組文庫構(gòu)建中的應(yīng)用。

23、又一方面，提供一種如上述任一實(shí)施例所述的酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法在rna制藥過程中的質(zhì)粒線性化中的應(yīng)用。

24、上述酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法的應(yīng)用具有與上述一些實(shí)施例中提供的酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法相同的有益技術(shù)效果，在此不再贅述。

技術(shù)特征：

1.一種酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法，其特征在于，包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法，其特征在于，所述目標(biāo)基因序列包括：相同堿基序列的非目標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)和至少一個(gè)目標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)，待保護(hù)的酶識(shí)別位點(diǎn)復(fù)稱為目標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法，其特征在于，所述目標(biāo)基因序列包括：質(zhì)粒和線性dna片段中的任一種。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法，其特征在于，所述引導(dǎo)序列包括：核苷酸單鏈；所述核苷酸單鏈包括：由5’端至3’端相連接的第一片段和第二片段，其中，所述第一片段用于與所述目標(biāo)基因序列結(jié)合，所述第二片段用于與dcas酶結(jié)合。

5.一種基因克隆方法，其特征在于，包括：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因克隆方法，其特征在于，所述目標(biāo)基因序列包括：相同堿基序列的非目標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)和至少一個(gè)目標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)，待保護(hù)的酶識(shí)別位點(diǎn)復(fù)稱為目標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)；

7.一種基因克隆試劑體系，其特征在于，包括：核糖核蛋白復(fù)合物溶液；

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因克隆試劑體系，其特征在于，所述核糖核蛋白復(fù)合物溶液還包括：第一緩沖溶液；

9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的基因克隆試劑體系，其特征在于，還包括：樣本溶液；

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的基因克隆試劑體系，其特征在于，所述樣本溶液還包括：第二緩沖溶液；

11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的基因克隆試劑體系，其特征在于，還包括：酶切體系；

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的基因克隆試劑體系，其特征在于，所述酶切體系還包括：第三緩沖溶液；

13.一種如權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法在質(zhì)粒構(gòu)建中的應(yīng)用。

14.一種如權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法在重組文庫構(gòu)建中的應(yīng)用。

15.一種如權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法在rna制藥過程中的質(zhì)粒線性化中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本公開的實(shí)施例提供了一種酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法及其應(yīng)用、基因克隆方法，涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，用于保護(hù)酶識(shí)別位點(diǎn)免受限制性內(nèi)切酶的識(shí)別與切割。該酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法包括：設(shè)計(jì)引導(dǎo)序列引導(dǎo)dCas酶覆蓋目標(biāo)基因序列待保護(hù)的酶識(shí)別位點(diǎn)，使得該待保護(hù)的酶識(shí)別位點(diǎn)免受限制性內(nèi)切酶的識(shí)別與切割。上述酶識(shí)別位點(diǎn)的保護(hù)方法用于基因克隆。

技術(shù)研發(fā)人員：苑淞,張雅琦
受保護(hù)的技術(shù)使用者：京東方科技集團(tuán)股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/22