本公開提供了用于在支持物上從細(xì)胞樣品捕獲核酸、在支持物上制備文庫分子、擴(kuò)增支持物上的文庫分子以產(chǎn)生核酸模板分子以及分析固定的核酸模板分子，包括對固定的核酸模板分子進(jìn)行檢測和/或測序的組合物和方法。固定的核酸模板分子對應(yīng)于來自細(xì)胞樣品的核酸。固定的核酸模板分子以類似于細(xì)胞樣品中的空間位置的排列在空間上位于支持物上。

背景技術(shù)：

1、由于不同細(xì)胞內(nèi)的各種分析物水平(例如，基因和/或蛋白質(zhì)表達(dá))，受試者的組織內(nèi)的細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)和/或功能上具有差異。細(xì)胞在組織內(nèi)的特定位置(例如，細(xì)胞相對于鄰近細(xì)胞的位置或細(xì)胞相對于組織微環(huán)境的位置)可以影響例如細(xì)胞的形態(tài)、分化、命運(yùn)、活力、增殖、行為和信號傳導(dǎo)以及與組織中其他細(xì)胞的串?dāng)_。

2、先前已經(jīng)使用僅在完整組織或組織的一部分的背景下提供針對少量分析物的數(shù)據(jù)或提供針對單個細(xì)胞的大量分析物數(shù)據(jù)但未能提供關(guān)于單個細(xì)胞在親本生物樣品(例如，組織樣品)中的位置的信息的技術(shù)來研究空間異質(zhì)性。

3、生物樣品內(nèi)分析物的空間分析可能需要確定分析物序列或其互補(bǔ)序列以及空間條形碼的序列或其互補(bǔ)序列，以識別分析物的位置。生物樣品可以放置在固體支持物上，以在進(jìn)行分析以識別或表征樣品內(nèi)的分析物(諸如dna、rna或其他遺傳物質(zhì))時改進(jìn)特異性和效率。需要改進(jìn)支持物上核酸的空間分辨表面捕獲以及下游組裝和測序技術(shù)，其降低獲得空間序列信息所需的組裝、時間和/或計(jì)算要求。本文提供了滿足這種需要的組合物、裝置和方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在一個方面，本公開提供了一種用于制備空間分辨核酸的方法，該方法包括：a)提供支持物，該支持物包括：(i)包含至少一種親水性聚合物的低非特異性結(jié)合涂層，其中該低非特異性結(jié)合涂層具有不超過45度的水接觸角；和(ii)共價拴系至低非特異性結(jié)合涂層的多個固定的表面捕獲引物，其中每個單獨(dú)的表面捕獲引物包含通用表面捕獲引物序列(110)、針對反向測序引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(120)和rna捕獲序列；b)在適合于細(xì)胞樣品保持在經(jīng)涂覆的支持物上的固定位置的條件下將細(xì)胞樣品定位在經(jīng)涂覆的支持物上，破壞細(xì)胞樣品，在適合于保存來自細(xì)胞樣品的rna分子的空間位置信息的條件下釋放細(xì)胞樣品的多個rna分子，以及在適合于使單獨(dú)的rna分子與單獨(dú)的固定的表面捕獲引物雜交以產(chǎn)生多個捕獲引物-rna雙鏈體的條件下收集支持物的多個固定的表面捕獲引物上的多個rna分子，其中每個引物-rna雙鏈體包含與rna分子雜交的固定的表面捕獲引物；c)在適合于延伸固定的表面捕獲引物的3'端的條件下并使用雜交的rna作為模板鏈，在適合于在3'端處產(chǎn)生非模板polyc尾的條件下，在經(jīng)涂覆的支持物上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，由此產(chǎn)生在3'端'處具有非模板polyc尾的多個第一鏈cdna分子，其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)包括多個模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸，其中模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸中的每個模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸包含能夠與第一鏈cdna分子的非模板polyc尾雜交的polyg區(qū)、針對正向測序引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(130)和針對表面釘扎引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(140)；d)從多個第一鏈cdna分子的非模板polyc尾的3'末端并且使用模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸作為模板鏈進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，由此產(chǎn)生多個固定的全長第一鏈cdna，其中每個全長第一鏈cdna包含：通用表面捕獲引物序列(110)；針對反向測序引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(120)；rna捕獲序列；cdna插入?yún)^(qū)；polyc尾區(qū)；針對正向測序引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(130)；以及針對表面釘扎引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(140)；e)移除rna分子，同時保留多個固定的全長第一鏈cdna；f)在適合于使單獨(dú)的環(huán)化寡核苷酸與固定的全長第一鏈cdna雜交的條件下使多個保留的固定的全長第一鏈cdna與多個單鏈環(huán)化寡核苷酸接觸，由此形成具有間隙的單鏈環(huán)狀分子，其中單獨(dú)的單鏈環(huán)化寡核苷酸包含：(i)與針對反向測序引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(120)互補(bǔ)的序列，(ii)與通用表面捕獲引物序列(110)互補(bǔ)的序列，(iii)接頭區(qū)，(iv)與針對表面釘扎引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(140)互補(bǔ)的序列，(v)以及與針對正向測序引物的通用結(jié)合位點(diǎn)(130)互補(bǔ)的序列；g)使用固定的全長第一鏈cdna的polyc尾區(qū)、cdna插入?yún)^(qū)和rna捕獲序列作為模板鏈來進(jìn)行聚合酶催化的延伸反應(yīng)以填充間隙，其中聚合酶催化的延伸反應(yīng)形成具有切口的單鏈環(huán)化分子，并且其中切口通過進(jìn)行酶促連接反應(yīng)而閉合以產(chǎn)生與固定的全長第一鏈cdna雜交的單鏈共價閉合環(huán)狀分子；h)使用固定的全長第一鏈cdna的末端3'端作為起始位點(diǎn)以及共價閉合環(huán)狀分子作為模板鏈進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，由此產(chǎn)生在支持物上空間分辨的多個固定的核酸串聯(lián)體；i)對多個單獨(dú)的固定的核酸串聯(lián)體進(jìn)行測序，其中測序包括單獨(dú)的核酸串聯(lián)體的cdna插入?yún)^(qū)的至少一部分，這些單獨(dú)的核酸串聯(lián)體對應(yīng)于從細(xì)胞樣品洗脫的單獨(dú)的rna分子；以及j)確定單獨(dú)的核酸串聯(lián)體在經(jīng)涂覆的支持物上的位置，這些位置對應(yīng)于從細(xì)胞樣品洗脫的單獨(dú)的rna分子的空間位置。

2、在一些實(shí)施例中，步驟b)的細(xì)胞樣品包括單個細(xì)胞、多個細(xì)胞、組織、器官、生物體或切片的細(xì)胞樣品。在一些實(shí)施例中，步驟b)的細(xì)胞樣品包括新鮮樣品、冷凍樣品、新鮮冷凍樣品或福爾馬林固定的石蠟包埋樣品。

3、在一些實(shí)施例中，步驟c)的多個模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸包括嵌合dna和/或rna寡核苷酸。

4、在一些實(shí)施例中，步驟f)的單鏈環(huán)化寡核苷酸的接頭區(qū)包含用于多重化的至少一個樣品索引序列、用于分子標(biāo)記的至少一個唯一分子索引(umi)序列和/或針對壓實(shí)寡核苷酸的至少一個通用結(jié)合位點(diǎn)。

5、在一些實(shí)施例中，步驟h)的滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)在多個壓實(shí)寡核苷酸的存在下進(jìn)行，其中壓實(shí)寡核苷酸包括單鏈寡核苷酸，這些單鏈寡核苷酸各自在第一遠(yuǎn)側(cè)端處具有與串聯(lián)體分子的一個部分雜交的第一區(qū)并且在第二遠(yuǎn)側(cè)端處具有與同一串聯(lián)體分子的第二部分雜交的第二區(qū)，其中串聯(lián)體分子的第一部分和串聯(lián)體分子的第二部分接近，由此導(dǎo)致串聯(lián)體分子的壓實(shí)以形成dna納米球。

6、在一些實(shí)施例中，步驟i)的測序包括：a.使多個串聯(lián)體分子與多個測序聚合酶和多個核酸測序引物接觸，其中該接觸在適合于形成多個復(fù)合測序聚合酶的條件下進(jìn)行，其中每個復(fù)合測序聚合酶包含結(jié)合至核酸雙鏈體的測序聚合酶，并且其中核酸雙鏈體包含與核酸測序引物雜交的串聯(lián)體分子的一部分；b.使多個復(fù)合測序聚合酶與多個經(jīng)可檢測地標(biāo)記的核苷酸接觸，該多個經(jīng)可檢測地標(biāo)記的核苷酸在2'糖位置或3'糖位置處包含阻斷部分，其中該接觸在適合于將至少一個核苷酸與復(fù)合測序聚合酶中的至少一個復(fù)合測序聚合酶結(jié)合的條件下進(jìn)行，并且其中該條件適合于促進(jìn)聚合酶催化的核苷酸摻入；c.將核苷酸摻入至少一個復(fù)合測序聚合酶的測序引物的3'端；d.檢測經(jīng)摻入的核苷酸并且識別該經(jīng)摻入的核苷酸的核堿基；e.從經(jīng)摻入的核苷酸中移除阻斷部分；以及f.重復(fù)步驟b.至e.至少一次。

7、在一些實(shí)施例中，步驟i)的測序包括：a.使多個串聯(lián)體分子與多個測序聚合酶和多個核酸測序引物接觸，其中該接觸在適合于形成多個復(fù)合測序聚合酶的條件下進(jìn)行，其中每個復(fù)合測序聚合酶包含結(jié)合至核酸雙鏈體的測序聚合酶，并且其中核酸雙鏈體包含與核酸測序引物雜交的串聯(lián)體分子的一部分；b.使多個復(fù)合測序聚合酶與多個核苷酸接觸，該多個核苷酸各自包含附接至磷酸酯鏈的磷酸酯部分的可檢測標(biāo)記，其中該接觸在適合于將至少一個核苷酸與復(fù)合測序聚合酶中的至少一個復(fù)合測序聚合酶結(jié)合的條件下進(jìn)行，并且其中該條件適合于促進(jìn)聚合酶催化的核苷酸摻入；c.將核苷酸摻入至少一個復(fù)合測序聚合酶的測序引物的3'端；d.檢測經(jīng)摻入的核苷酸并且識別該經(jīng)摻入的核苷酸的核堿基；以及e.重復(fù)步驟b.至d.至少一次。

8、在一些實(shí)施例中，步驟i)的測序包括：a.使多個串聯(lián)體分子與多個第一測序聚合酶和多個核酸測序引物接觸，其中該接觸在適合于將多個第一聚合酶與多個核酸模板分子和多個核酸引物結(jié)合的條件下進(jìn)行，由此形成多個第一復(fù)合聚合酶，其中每個第一復(fù)合聚合酶包含結(jié)合至核酸雙鏈體的第一聚合酶，其中核酸雙鏈體包含與核酸引物雜交的核酸模板分子；b.使多個第一復(fù)合聚合酶與多個經(jīng)可檢測地標(biāo)記的多價分子接觸以形成多個多價結(jié)合復(fù)合物，其中多個經(jīng)可檢測地標(biāo)記的多價分子中的單獨(dú)的經(jīng)可檢測地標(biāo)記的多價分子包括附接至多個核苷酸臂的核，并且其中每個核苷酸臂附接至核苷酸單元，其中該接觸在適合于將多價分子的互補(bǔ)核苷酸單元與多個第一復(fù)合聚合酶中的至少兩個第一復(fù)合聚合酶結(jié)合的條件下進(jìn)行，由此形成多個多價結(jié)合復(fù)合物，并且其中該條件適合于抑制互補(bǔ)核苷酸單元摻入到多個多價結(jié)合復(fù)合物的引物中；c.檢測多個多價結(jié)合復(fù)合物；以及d.識別多個多價結(jié)合復(fù)合物中的互補(bǔ)核苷酸單元的核堿基，由此確定核酸模板分子的序列。

9、在一些實(shí)施例中，步驟i)的測序包括：a.通過移除多個第一測序聚合酶及其結(jié)合的多價分子并保留多個核酸雙鏈體來解離多個多價結(jié)合復(fù)合物；b.在適合于將多個第二聚合酶與多個保留的核酸雙鏈體結(jié)合的條件下使步驟e)的多個保留的核酸雙鏈體與多個第二測序聚合酶接觸，由此形成各自包含結(jié)合至核酸雙鏈體的第二聚合酶的多個第二復(fù)合聚合酶；以及c.使多個第二復(fù)合聚合酶與多個核苷酸接觸，其中該接觸在適合于將來自多個核苷酸的互補(bǔ)核苷酸與第二復(fù)合聚合酶中的至少兩個第二復(fù)合聚合酶結(jié)合的條件下進(jìn)行，由此形成多個核苷酸結(jié)合復(fù)合物，并且其中該條件適合于促進(jìn)結(jié)合的互補(bǔ)核苷酸摻入到核苷酸結(jié)合復(fù)合物的引物中。

10、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：d.檢測摻入到核苷酸復(fù)合聚合酶的引物中的互補(bǔ)核苷酸。在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括：d.檢測摻入到核苷酸復(fù)合聚合酶的引物中的互補(bǔ)核苷酸；以及e.識別摻入到核苷酸復(fù)合聚合酶的引物中的互補(bǔ)核苷酸的核堿基。

11、在一些實(shí)施例中，其中步驟b.的使多個第一復(fù)合聚合酶與多個多價分子接觸在抑制聚合酶催化的核苷酸摻入的非催化二價陽離子的存在下進(jìn)行，其中非催化二價陽離子包括鍶、鋇或鈣。

12、在一些實(shí)施例中，多個多價分子中的單獨(dú)的多價分子包含：(a)核；和(b)多個核苷酸臂，該多個核苷酸臂包含：(i)核附接部分，(ii)間隔區(qū)，(iii)接頭和(iv)核苷酸單元，其中核經(jīng)由多個核苷酸臂的核附接部分附接至該多個核苷酸臂，其中間隔區(qū)附接至接頭，并且其中接頭附接至核苷酸單元。

13、在一些實(shí)施例中，接頭包含具有2至6個亞基的脂族鏈或具有2至6個亞基的低聚乙二醇鏈。

14、在一些實(shí)施例中，其中附接至給定核的多個核苷酸臂具有相同類型的核苷酸單元，并且其中這些類型的核苷酸單元包括datp、dgtp、dctp、dttp或dutp。

15、在一些實(shí)施例中，多個多價分子包括一種類型的多價分子，其中多個多價分子中的每個多價分子具有選自由以下項(xiàng)組成的組的相同類型的核苷酸單元：datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。在一些實(shí)施例中，多個多價分子包括兩種或更多種類型的多價分子的任意組合的混合物，每種類型具有選自由以下項(xiàng)組成的組的核苷酸單元：datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。

16、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括形成多個結(jié)合復(fù)合物，包括以下步驟：a)將第一核酸測序引物、第一測序聚合酶和第一多價分子與串聯(lián)體分子的第一部分結(jié)合，由此形成第一結(jié)合復(fù)合物，其中第一多價分子的第一核苷酸單元結(jié)合至第一聚合酶；以及b)將第二核酸測序引物、第二測序聚合酶和第一多價分子與同一串聯(lián)體分子的第二部分結(jié)合，由此形成第二結(jié)合復(fù)合物，其中第一多價分子的第二核苷酸單元與第二聚合酶結(jié)合，其中包括同一多價分子的第一結(jié)合復(fù)合物和第二結(jié)合復(fù)合物形成親合力復(fù)合物。

17、在一些實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括形成親合力復(fù)合物，包括以下步驟：a)使多個第一測序聚合酶和多個核酸測序引物與串聯(lián)體核酸模板分子的不同部分接觸，以在同一串聯(lián)體分子上形成至少第一復(fù)合聚合酶和第二復(fù)合聚合酶；以及b)在適合于將來自多個多價分子的單個多價分子與第一復(fù)合聚合酶和第二復(fù)合聚合酶結(jié)合的條件下，使多個經(jīng)可檢測地標(biāo)記的多價分子與同一串聯(lián)體分子上的至少第一復(fù)合聚合酶和第二復(fù)合聚合酶接觸，其中單個多價分子的至少第一核苷酸單元結(jié)合至第一復(fù)合聚合酶，該第一復(fù)合聚合酶包括與串聯(lián)體分子的第一部分雜交的第一引物，由此形成第一結(jié)合復(fù)合物，并且其中單個多價分子的至少第二核苷酸單元結(jié)合至第二復(fù)合聚合酶，該第二復(fù)合聚合酶包括與串聯(lián)體分子的第二部分雜交的第二引物，由此形成第二結(jié)合復(fù)合物，其中接觸在適合于抑制結(jié)合的第一核苷酸單元和第二核苷酸單元經(jīng)聚合酶催化摻入第一結(jié)合復(fù)合物和第二結(jié)合復(fù)合物中的條件下進(jìn)行，并且其中結(jié)合至同一多價分子的第一結(jié)合復(fù)合物和第二結(jié)合復(fù)合物形成親合力復(fù)合物；c)檢測同一串聯(lián)體分子上的第一結(jié)合復(fù)合物和第二結(jié)合復(fù)合物；以及d)識別第一結(jié)合復(fù)合物中的第一核苷酸單元，由此確定串聯(lián)體分子的第一部分的序列，并且識別第二結(jié)合復(fù)合物中的第二核苷酸單元，由此確定串聯(lián)體分子的第二部分的序列。

18、在一些實(shí)施例中，其中步驟c.的使多個第二復(fù)合聚合酶與多個核苷酸接觸在促進(jìn)聚合酶催化的核苷酸摻入的催化二價陽離子的存在下進(jìn)行，其中催化二價陽離子包括鎂或錳。

19、在一些實(shí)施例中，步驟c.中的多個核苷酸中的單獨(dú)的核苷酸包含芳香族堿基、五碳糖和1至10個磷酸酯基團(tuán)。在一些實(shí)施例中，步驟c.的多個核苷酸包括選自由以下項(xiàng)組成的組的一種類型的核苷酸：datp、dgtp、dctp、dttp和dutp，或包括選自由以下項(xiàng)組成的組的兩種或更多種類型的核苷酸的任意組合的混合物：datp、dgtp、dctp、dttp和dutp。

20、在一些實(shí)施例中，步驟c.中的多個核苷酸中的核苷酸中的至少一個核苷酸用熒光團(tuán)標(biāo)記。在一些實(shí)施例中，步驟c.中的多個核苷酸缺乏熒光團(tuán)標(biāo)記。

21、在一些實(shí)施例中，步驟c.的多個核苷酸中的核苷酸中的至少一個核苷酸包含附接至糖基團(tuán)的3'碳位置的可移除鏈終止部分，其中可移除鏈終止部分包括烷基基團(tuán)、烯基基團(tuán)、炔基基團(tuán)、烯丙基基團(tuán)、芳基基團(tuán)、芐基基團(tuán)、疊氮基基團(tuán)、疊氮基基團(tuán)、o-疊氮甲基基團(tuán)、胺基基團(tuán)、酰胺基基團(tuán)、酮基基團(tuán)、異氰酸酯基團(tuán)、磷酸酯基團(tuán)、硫代基團(tuán)、二硫基團(tuán)、碳酸酯基團(tuán)、脲基團(tuán)或甲硅烷基基團(tuán)，并且其中可移除鏈終止部分可用化學(xué)化合物裂解以在糖基團(tuán)上產(chǎn)生可延伸3'oh部分。