本發(fā)明涉及生物技術(shù)和核酸藥物領(lǐng)域，具體地，涉及一種優(yōu)化的polya序列結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、mrna疫苗作為新興疫苗，屬于核酸類疫苗，是在第一代減毒活疫苗或滅活疫苗和第二代亞單位疫苗基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的第三代疫苗。與基于dna的基因療法相比，rna不需要進(jìn)入細(xì)胞核即可表達(dá)，因此避免了整合到宿主基因組中產(chǎn)生插入突變的風(fēng)險(xiǎn)。另外，mrna更具設(shè)計(jì)與制造的簡(jiǎn)便性、快速量產(chǎn)性、固有的免疫原性等優(yōu)勢(shì)。mrna疫苗不僅可以用于突發(fā)傳染病，還可以滿足遺傳代謝疾病、腫瘤等重大疾病的防治需要。因此，建立快速、精準(zhǔn)、個(gè)性化的新型rna藥物設(shè)計(jì)和載體研發(fā)平臺(tái)可以更好地滿足市場(chǎng)需求，為人群提供更高效、更便捷的預(yù)防或治療藥物。

2、然而，有幾個(gè)因素限制了合成mrna的臨床適用性，比如mrna在細(xì)胞中的半衰期較短，蛋白質(zhì)生產(chǎn)效率低等問(wèn)題。目前，有一些策略在增加mrna穩(wěn)定性和翻譯效率上證明是可能的。比如使用人工帽類似物、優(yōu)化utr、使用包括化學(xué)修飾的核苷酸：如用2-硫尿苷和5-甲基-胞苷等。

3、與內(nèi)源性mrna一致，體外轉(zhuǎn)錄mrna也包含5個(gè)部分：5'?端帽子（cap）結(jié)構(gòu)、5'?非翻譯區(qū)（5'?utr）、編碼蛋白質(zhì)的開(kāi)放閱讀框（orf）、3'?非翻譯區(qū)（3'?utr）和多聚腺苷酸尾巴（polya），這幾個(gè)部分都會(huì)對(duì)mrna疫苗的穩(wěn)定性和翻譯活性造成一定的影響。

4、在細(xì)胞核內(nèi)，mrna經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生后需要經(jīng)過(guò)一系列加工處理完成末端修飾，除個(gè)別哺乳動(dòng)物組蛋白的轉(zhuǎn)錄本外，幾乎所有真核生物mrna都帶有polya尾。polya尾的添加過(guò)程為在切割位點(diǎn)上游的aauaaa序列和下游富含gu或者u的序列之間發(fā)生核酸內(nèi)切酶切割，產(chǎn)生一個(gè)末端含有3'?oh?的上游序列和一個(gè)末端含有5'?磷酸基因的下游序列，上游序列末端發(fā)生聚腺苷酸化，添加上polya尾巴，下游序列則被降解掉。polya尾巴并不存在于基因中，而是?pre-mrna?3'?末端發(fā)生內(nèi)部切割后聚腺苷酸反應(yīng)的終產(chǎn)物。其長(zhǎng)度變動(dòng)范圍在酵母中約為90個(gè)腺苷酸，在哺乳動(dòng)物中大概為250個(gè)腺苷酸。

5、在mrna體外合成中，添加polya尾巴的方式主要有兩種：酶法合成和共轉(zhuǎn)錄。酶法是通過(guò)源自大腸桿菌的polya聚合酶添加，但反應(yīng)終產(chǎn)物難以確保含有相同長(zhǎng)度的尾巴，得到的是攜帶不同長(zhǎng)度尾巴的mrna混合物，且該酶需要堿性環(huán)境來(lái)發(fā)揮功能，可能導(dǎo)致mrna一定程度的降解。共轉(zhuǎn)錄則是由已經(jīng)存在于模板質(zhì)粒dna或者pcr產(chǎn)物上的polya序列直接轉(zhuǎn)錄形成，其終產(chǎn)物在很大程度上可以保持同質(zhì)性，也能減少工藝步驟、節(jié)省成本。

6、而共轉(zhuǎn)錄加尾仍然存在一個(gè)主要挑戰(zhàn)，同聚序列（如編碼多聚a尾的序列）可在質(zhì)粒dna的細(xì)菌擴(kuò)增期間重組，可能導(dǎo)致尾巴隨著時(shí)間的推移以不可預(yù)測(cè)的方式丟失。因此，質(zhì)粒模板及polya的完整性應(yīng)作為發(fā)酵工藝開(kāi)發(fā)的重要質(zhì)量屬性。

7、因此，本領(lǐng)域亟待開(kāi)發(fā)能夠用于體外轉(zhuǎn)錄大規(guī)模生產(chǎn)模板，具有確定且穩(wěn)定，同時(shí)能提高蛋白編碼區(qū)翻譯效率的polya序列，為制備高質(zhì)量的mrna藥物提供技術(shù)保障。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供能夠用于體外轉(zhuǎn)錄大規(guī)模生產(chǎn)模板，具有確定且穩(wěn)定，同時(shí)能提高蛋白編碼區(qū)翻譯效率的polya序列及其在制備mrna藥物中的應(yīng)用。

2、在本發(fā)明第一方面，提供了一種polya尾部元件，所述polya尾部元件的?5'?端至3'?端結(jié)構(gòu)包括以下元件組成：

3、(a)2~7個(gè)依次連接的x元件，所述x元件各自獨(dú)立地由依次連接的10~70個(gè)連續(xù)的a堿基和1個(gè)非a堿基組成；

4、(b)至少1個(gè)y元件，所述y元件各自獨(dú)立地由依次連接的10~70個(gè)連續(xù)的a堿基和10~30個(gè)連續(xù)的c堿基；和

5、(c)?位于3'?端的1-10個(gè)a堿基；

6、其中，所述非a堿基優(yōu)選t堿基或g堿基。

7、在另一優(yōu)選例中，所述polya尾部元件的5'?端至3'?端序列具有如下所示結(jié)構(gòu)：

8、xn-y-z；

9、其中，n為選自2~7的任一正整數(shù)；

10、x各自獨(dú)立地為由依次連接的10~70個(gè)（較佳地為20~50個(gè)，更佳地為20~40個(gè)）連續(xù)的a堿基和1個(gè)非a堿基（較佳地為t、g或c堿基，更佳地為t或g堿基）組成；

11、y為由依次連接的10~70個(gè)連續(xù)的a堿基和10~30個(gè)連續(xù)的c堿基組成；

12、z為位于3'?端的1-10個(gè)a堿基。

13、在另一優(yōu)選例中，所述z為位于3'?端的1個(gè)a堿基。

14、在另一優(yōu)選例中，所述polya尾部元件的5'?端至3'?端序列具有如下所示結(jié)構(gòu)：

15、x1-x2-x3-y-z；

16、其中，

17、x1為由依次連接的10~19個(gè)（較佳地為15~19個(gè)，更佳地為16~19個(gè)）連續(xù)的a堿基和1個(gè)非a堿基（較佳地為t、g或c堿基，更佳地為t或g堿基）組成；

18、x2為由依次連接的20~40個(gè)（較佳地為25~40個(gè)，更佳地為25~30個(gè)）連續(xù)的a堿基和1個(gè)非a堿基（較佳地為t、g或c堿基，更佳地為t或g堿基）組成；

19、x3為無(wú)或由依次連接的20~50個(gè)（較佳地為25~50個(gè)，更佳地為30~49個(gè)）連續(xù)的a堿基和1個(gè)非a堿基（較佳地為t、g或c堿基，更佳地為g或c堿基）組成；

20、y為各自獨(dú)立地由依次連接的10~70個(gè)連續(xù)的a堿基和10~30個(gè)連續(xù)的c堿基組成；

21、z為位于3'?端的1-10個(gè)a堿基。

22、在另一優(yōu)選例中，所述x1的核苷酸序列為相對(duì)于seq?id?no:1所示序列的第1位至第20位。

23、在另一優(yōu)選例中，所述x2的核苷酸序列為相對(duì)于seq?id?no:1所示序列的第21位至第51位。

24、在另一優(yōu)選例中，所述y的核苷酸序列為相對(duì)于seq?id?no:1所示序列的第52位至第120位。

25、在另一優(yōu)選例中，所述z為位于3'?端的1個(gè)a堿基。

26、在另一優(yōu)選例中，所述polya尾部元件的核苷酸序列長(zhǎng)度為121個(gè)堿基。

27、在另一優(yōu)選例中，所述polya尾部元件用于構(gòu)建mrna轉(zhuǎn)錄模板，提高所述mrna轉(zhuǎn)錄模板轉(zhuǎn)錄得到的mrna中編碼區(qū)的翻譯效率和/或延長(zhǎng)所述mrna的半衰期。

28、在另一優(yōu)選例中，所述polya尾部元件用于構(gòu)建質(zhì)粒dna，提高所述質(zhì)粒dna的傳代穩(wěn)定性，減少所述質(zhì)粒dna在擴(kuò)增時(shí)發(fā)生的重組，維持所述質(zhì)粒dna的polya尾巴長(zhǎng)度。

29、在另一優(yōu)選例中，所述polya尾部元件的核苷酸序列如seq?id?no:?1或seq?idno:2所示，或與seq?id?no:?1或seq?id?no:2所示的核苷酸序列具有≥70%的同源性。

30、在另一優(yōu)選例中，所述polya尾部元件的核苷酸序列包括：與seq?id?no:?1或seqid?no:2所示的核苷酸序列具有≥70%（較佳地≥80%，更佳地≥90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%）的同源性，且具有提高mrna中編碼區(qū)翻譯效率活性的核苷酸序列；或

31、如seq?id?no:?1或seq?id?no:2所示核苷酸序列的5'?端和/或3'?端增加和/或減少1-50個(gè)(較佳地1-30，更佳地1-10個(gè)，更佳地1-5個(gè))核苷酸，且具有提高mrna中編碼區(qū)翻譯效率活性的核苷酸序列。

32、在另一優(yōu)選例中，所述polya尾部元件的核苷酸序列如seq?id?no:?1或seq?idno:2所示。

33、在另一優(yōu)選例中，所述polya尾部元件的核苷酸序列如seq?id?no:?1所示。

34、在本發(fā)明第二方面，提供了一種mrna轉(zhuǎn)錄模板構(gòu)建體，所述構(gòu)建體具有式i結(jié)構(gòu)：

35、z1-z2-z3-z4-z5-z6-z7?(i)

36、式中，

37、z1、z7為無(wú)或酶切位點(diǎn)；

38、z2為無(wú)或啟動(dòng)子元件或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（ires）；

39、z3為5'?utr元件；

40、z4為可替換的編碼區(qū)；

41、z5為3'?utr元件；

42、z6為本發(fā)明第一方面所述polya尾部元件。

43、在另一優(yōu)選例中，所述z1、z7為平末端酶切位點(diǎn)或粘性末端酶切位點(diǎn)。

44、在另一優(yōu)選例中，所述z2為啟動(dòng)子元件，所述啟動(dòng)子選自下組：t7啟動(dòng)子、t3啟動(dòng)子、sp6啟動(dòng)子、cag啟動(dòng)子、ubc啟動(dòng)子、cmv啟動(dòng)子、u6啟動(dòng)子、ef1a啟動(dòng)子、pgk1啟動(dòng)子、tre啟動(dòng)子、ac5啟動(dòng)子、uas啟動(dòng)子、sv40啟動(dòng)子、adh1啟動(dòng)子、camv35s啟動(dòng)子、ubi啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、ptac啟動(dòng)子、pl啟動(dòng)子，或其組合。

45、在另一優(yōu)選例中，所述z2的核苷酸序列如seq?id?no:?9所示。

46、在另一優(yōu)選例中，所述z4為熒光素酶編碼基因或用于預(yù)防和/或治療傳染性疾病、罕見(jiàn)遺傳病、神經(jīng)退行性疾病、視網(wǎng)膜病變、癌癥或腫瘤的蛋白編碼基因。

47、在另一優(yōu)選例中，所述z4選自下組：熒光素酶編碼基因、病原體抗原基因、基因組中的轉(zhuǎn)座子（包括沉默和活躍轉(zhuǎn)座子）、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、蛋白激素、多肽激素、腫瘤相關(guān)抗原（taa）、腫瘤特異性抗原（tsa）、通用腫瘤突變位點(diǎn)抗原、蛋白佐劑、多肽佐劑、核酸佐劑，或其組合。

48、在另一優(yōu)選例中，所述z3的核苷酸序列如seq?id?no:?10所示。

49、在另一優(yōu)選例中，所述z4的核苷酸序列如seq?id?no:?11所示。

50、在另一優(yōu)選例中，所述z5的核苷酸序列如seq?id?no:?12所示。

51、在本發(fā)明第三方面，提供了一種載體，所述載體含有如本發(fā)明第二方面所述的mrna轉(zhuǎn)錄模板構(gòu)建體。

52、在另一優(yōu)選例中，所述載體選自下組：dna、rna、病毒載體、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、其他基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，或其組合；優(yōu)選地，所述載體為質(zhì)粒。

53、在本發(fā)明第四方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有如本發(fā)明第三方面所述的載體。

54、在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。

55、在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞選自下組：大腸桿菌、酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

56、在本發(fā)明第五方面，提供了一種產(chǎn)生用于制備mrna藥物的優(yōu)化mrna的方法，所述方法包括步驟：

57、(i)?在適合的條件下，培養(yǎng)如本發(fā)明第四方面所述的宿主細(xì)胞，從而獲得含有mrna轉(zhuǎn)錄模板構(gòu)建體的載體的培養(yǎng)物；

58、(ii)?從所述培養(yǎng)物中分離和/或回收(i)中所述載體，并酶切線性化為mrna轉(zhuǎn)錄模板；和

59、(iii)?將(ii)中所述mrna轉(zhuǎn)錄模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而獲得所述優(yōu)化mrna。

60、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟(iv)：對(duì)步驟(iii)獲得的優(yōu)化mrna進(jìn)行純化和/或修飾。

61、在本發(fā)明第六方面，提供了一種優(yōu)化mrna，所述優(yōu)化mrna是用如本發(fā)明第五方面所述的方法制備得到的，并且所述優(yōu)化mrna具有式ii所示結(jié)構(gòu)：

62、m1-m2-m3-m4-m5-m6?(ii)

63、式中，

64、m1為5'?端帽子元件；

65、m2為無(wú)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（ires）；

66、m3為5'?utr元件；

67、m4為可替換的編碼區(qū)；

68、m5為3'?utr元件；

69、m6為本發(fā)明第一方面所述polya尾部元件。

70、在另一優(yōu)選例中，所述m4為熒光素酶編碼基因或用于預(yù)防和/或治療傳染性疾病、罕見(jiàn)遺傳病、神經(jīng)退行性疾病、視網(wǎng)膜病變、癌癥或腫瘤的蛋白編碼基因。

71、在另一優(yōu)選例中，所述m4選自下組：熒光素酶編碼基因、病原體抗原基因、基因組中的轉(zhuǎn)座子（包括沉默和活躍轉(zhuǎn)座子）、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、蛋白激素、多肽激素、腫瘤相關(guān)抗原（taa）、腫瘤特異性抗原（tsa）、通用腫瘤突變位點(diǎn)抗原、蛋白佐劑、多肽佐劑、核酸佐劑，或其組合。

72、在本發(fā)明第七方面，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含：

73、(c1)?如本發(fā)明第二方面所述的mrna轉(zhuǎn)錄模板構(gòu)建體，或如本發(fā)明第六方面所述的優(yōu)化mrna作為活性成分；和

74、(c2)?藥學(xué)上可接受的載體。

75、在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物為疫苗組合物。

76、在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物的劑型選自下組：注射劑、凍干劑、霧化吸入劑、涂抹式藥劑。

77、在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物通過(guò)注射施用，即靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、十二指腸內(nèi)或腹膜內(nèi)注射。

78、在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物通過(guò)吸入施用，例如鼻內(nèi)施用。

79、在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物經(jīng)皮施用，例如經(jīng)皮涂抹施用或電極導(dǎo)入給藥。

80、在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物是將所述mrna用陽(yáng)離子脂進(jìn)行包裹所形成的脂質(zhì)納米顆粒，即lnp-mrna。

81、在另一優(yōu)選例中，所述疫苗組合物包括0.01～99.99%的如本發(fā)明第六方面所述的優(yōu)化mrna和0.01～99.99%的藥學(xué)上可接受的載體，所述百分比為占所述疫苗組合物的質(zhì)量百分比。

82、在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物用于制備預(yù)防和/或治療包括（但不限于）傳染性疾病、罕見(jiàn)遺傳病、神經(jīng)退行性疾病、視網(wǎng)膜病變、癌癥或腫瘤的藥物。

83、在本發(fā)明第八方面，提供了一種mrna藥物組合物的制備方法，所述方法包括：將如本發(fā)明第六方面所述的優(yōu)化mrna與藥學(xué)上可接受的載體混合，從而獲得所述mrna藥物組合物。

84、在另一優(yōu)選例中，所述mrna藥物組合物為mrna疫苗組合物。

85、在本發(fā)明第九方面，提供了一種如本發(fā)明第八方面所述的polya尾部元件的用途，用于構(gòu)建mrna轉(zhuǎn)錄模板dna質(zhì)粒，從而提高模板dna質(zhì)粒傳代穩(wěn)定性，和/或提高所述mrna轉(zhuǎn)錄模板轉(zhuǎn)錄得到的mrna中編碼區(qū)的翻譯效率，和/或延長(zhǎng)所述mrna的半衰期。

86、在本發(fā)明第十方面，提供了一種如本發(fā)明第六方面所述的優(yōu)化mrna或如本發(fā)明第七方面所述的藥物組合物的用途，用于制備藥物，所述藥物用于預(yù)防和/或治療傳染性疾病、罕見(jiàn)遺傳病、神經(jīng)退行性疾病、視網(wǎng)膜病變、癌癥或腫瘤。

87、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。