本發(fā)明涉及一種用于分析生物樣本的標(biāo)記(label)，該標(biāo)記包括至少一個適配體。在進(jìn)一步的方面，提供了一種用于分析生物樣本的標(biāo)記物(marker)和試劑盒(reagentkit)，該標(biāo)記物和該試劑盒包括標(biāo)記。

背景技術(shù)：

1、用于熒光顯微技術(shù)的標(biāo)記物通常包括親和試劑(諸如抗體)和附著到親和試劑的標(biāo)記，以便能夠?qū)?biāo)記特異性地附著到生物樣本中的靶標(biāo)分析物。這允許鑒定和/或定位生物樣本中的靶標(biāo)分析物。這些標(biāo)記物和標(biāo)記的普遍使用，例如在循環(huán)染色方法中，帶來提高生產(chǎn)這些標(biāo)記物和標(biāo)記的效率的動力。

2、本領(lǐng)域已知的標(biāo)記和標(biāo)記物的一個特殊問題在于，標(biāo)記或標(biāo)記物的每個部分通常都是單獨(dú)生成的。為了組裝該標(biāo)記或標(biāo)記物，需要組裝單獨(dú)的部分，通常使用特定的化學(xué)方法和接頭，導(dǎo)致生產(chǎn)復(fù)雜。具體而言，由于偶聯(lián)反應(yīng)和隨后的偶聯(lián)產(chǎn)物純化的效率有限，標(biāo)記部分、如熒光染料的偶聯(lián)是一種通常與損失相關(guān)聯(lián)的過程。

3、接頭的使用還會增加標(biāo)記和標(biāo)記物的整體尺寸。當(dāng)使用高分辨率顯微技術(shù)時，這可能尤為不利。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供可以高效生成的用于分析生物樣本的緊湊型標(biāo)記和標(biāo)記物。

2、通過獨(dú)立權(quán)利要求的主題實(shí)現(xiàn)上述目的。在從屬權(quán)利要求和以下描述中定義有利的實(shí)施方案。

3、一方面，本發(fā)明提供了一種用于分析生物樣本的標(biāo)記。所述標(biāo)記包括：具有至少一個適配體的骨架，以及與所述適配體結(jié)合的至少一個標(biāo)記部分。所述適配體被配置為通過其復(fù)雜結(jié)構(gòu)特異性地結(jié)合到至少一個標(biāo)記部分。這使得能夠高效地生成和組裝一種緊湊型標(biāo)記。

4、例如，所述骨架的所述適配體的復(fù)雜結(jié)構(gòu)可以是二級、三級或四級結(jié)構(gòu)，特別是所述適配體的核酸的二級、三級或四級結(jié)構(gòu)。因此，特別地，所述適配體具有二級、三級或四級結(jié)構(gòu)。特別地，由于所述適配體的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，和基于所述適配體與所述標(biāo)記部分之間的分子間力，所述適配體被配置為特異性地結(jié)合到所述標(biāo)記部分。具體地，所述適配體的所述核酸的單獨(dú)、不連續(xù)的核苷酸與所述標(biāo)記部分結(jié)合，而不是所述核酸的序列的連續(xù)核苷酸與所述標(biāo)記部分雜交，尤其是與所述標(biāo)記部分的互補(bǔ)序列雜交。這使得能夠以高特異性與所述標(biāo)記部分結(jié)合。

5、優(yōu)選地，所述骨架包括核酸，特別是基本由核酸組成。這使得能夠高效地生成具有所述適配體的所述骨架。優(yōu)選地，所述適配體是基于核酸的適配體。這使得能夠高效地生成每個對于特定標(biāo)記部分都具有特異性的一系列適配體。適配體可以通過各種方式生成，其中selex(systematic?evolution?of?ligands?by?exponential?enrichment，指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化)是最典型的途徑。此外，所述骨架和/或所述適配體可以包括修飾，諸如糖基化。進(jìn)一步地，可以特別優(yōu)選地，具有所述適配體的所述骨架包括天然存在的d-dna或核酸類似物，諸如非天然存在的核酸、lna、l-dna、pt-dna、或pna、或可以包括所述骨架和/或核堿基的修飾的任何其他異種核酸(xna)。

6、特別地，由于適配體的尺寸通常較小，其范圍在20至100個核苷酸之間或10至50kda之間，適配體的使用能夠?qū)崿F(xiàn)緊湊型標(biāo)記。進(jìn)一步地，快速生產(chǎn)對特定標(biāo)記部分具有高親和力和/或特異性的基于核酸的適配體的能力使得能夠生成可以高效生成的緊湊型標(biāo)記。

7、優(yōu)選地，所述骨架包括至少兩個適配體。每個適配體可以結(jié)合標(biāo)記部分。這使得能夠生成具有不同或相同可檢測性質(zhì)的標(biāo)記，并因此生成多個可區(qū)分的標(biāo)記或比僅具有單個標(biāo)記部分的標(biāo)記更容易檢測的標(biāo)記。

8、優(yōu)選地，所述骨架的所述適配體是多聚體。所述多聚體優(yōu)選地是相同的核酸分子?？蛇x擇地，所述多聚體可以包括多個單獨(dú)的單體，每個單體被配置為結(jié)合具有相同可檢測性質(zhì)的標(biāo)記部分或被配置為結(jié)合具有不同可檢測性質(zhì)的標(biāo)記部分。這使得能夠生成組合標(biāo)記或比僅具有單個標(biāo)記部分的標(biāo)記更容易檢測的標(biāo)記。優(yōu)選地，每個單體結(jié)合單個標(biāo)記部分。

9、優(yōu)選地，所述標(biāo)記包括至少兩個標(biāo)記部分。特別地，每個標(biāo)記部分結(jié)合到所述適配體中的一個。所述標(biāo)記部分可以具有不同或相同的可檢測性質(zhì)，例如光學(xué)性質(zhì)，諸如激發(fā)/發(fā)射波長，或熒光壽命。這使得能夠生成組合標(biāo)記或比僅具有單個標(biāo)記部分的標(biāo)記更容易檢測的標(biāo)記。

10、優(yōu)選地，所述標(biāo)記部分是熒光蛋白或分子熒光團(tuán)。特別地，所述分子熒光團(tuán)的分子量可以在100至1000da之間的范圍內(nèi)。這能夠?qū)崿F(xiàn)緊湊型標(biāo)記。例如，所述熒光蛋白的分子量可以在10至100kda之間的范圍內(nèi)。熒光標(biāo)記部分是可光學(xué)檢測的，例如通過熒光顯微鏡、平板讀數(shù)器或細(xì)胞儀的方法，并且可以通過它們的光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行區(qū)分。

11、優(yōu)選地，所述標(biāo)記部分包括生物素，例如所述標(biāo)記部分可以是生物素化的分子熒光團(tuán)，并且所述至少一個適配體被配置為特異性地結(jié)合所述生物素，特別地，通過所述至少一個適配體的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，所述至少一個適配體可以結(jié)合至所述標(biāo)記部分的所述生物素。這使得能夠從其部分高效組裝所述標(biāo)記，特別是從所述至少一個適配體和所述標(biāo)記部分高效組裝所述標(biāo)記。

12、優(yōu)選地，所述標(biāo)記部分是smile或染料-大環(huán)共晶體(dye-macrocyclecocrystal)、聚合物點(diǎn)或量子點(diǎn)。在這種情況下，使用適配體直接識別這樣的粒子是有利的，因?yàn)檫@可能比功能化這樣的粒子更容易。

13、可替代地或附加地，所述標(biāo)記部分可以包括通過拉曼光譜可檢測的聚炔烴。所述標(biāo)記部分還可以包括通過拉曼光譜可檢測的粒子，例如用于表面增強(qiáng)拉曼光譜(surfaceenhanced?raman?spectroscopy,sers)的粒子。這樣的粒子通常含有金(au)或銀(ag)核、拉曼報(bào)告分子、由例如聚乙二醇(peg)制成的殼(shell)。sers探針由于其非常窄的發(fā)射峰而在顯微鏡檢查中備受關(guān)注，這例如在一個多路復(fù)用生物標(biāo)記物成像實(shí)驗(yàn)中可以允許對例如+100個sers探針進(jìn)行成像。同樣，這些探針在液體蛋白質(zhì)組學(xué)和多重免疫測定的背景下也備受關(guān)注。在這樣的測定中，抗體可以經(jīng)由例如nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)化學(xué)偶聯(lián)至peg，然后其用于涂覆金屬納米顆粒。使用本文件中提出的策略，使得輕松、快速且經(jīng)濟(jì)高效地將多種抗體或其他親和試劑與sers粒子偶聯(lián)。

14、優(yōu)選地，所述骨架包括被配置為附著到標(biāo)記物的親和試劑上的附著寡核苷酸，特別地，所述附著寡核苷酸可以被配置為與標(biāo)記物的親和試劑的互補(bǔ)的寡核苷酸雜交。這使得能夠高效地由所述標(biāo)記生成標(biāo)記物。

15、優(yōu)選地，所述骨架包括裂解位點(diǎn)。這使得能夠使所述標(biāo)記失活，例如，在迭代或循環(huán)標(biāo)記的方法期間。特別地，所述裂解位點(diǎn)可以被配置為可被裂解劑裂解的。例如，所述裂解位點(diǎn)可以是特定限制位點(diǎn)或化學(xué)/光化學(xué)可裂解部分。

16、優(yōu)選地，所述裂解位點(diǎn)被布置且被配置為，在所述裂解位點(diǎn)裂解時，將所述標(biāo)記的所述附著寡核苷酸和所述標(biāo)記的所述至少一個適配體彼此分離。優(yōu)選地，所述裂解位點(diǎn)的所述裂解是不可逆的。這使得能夠高效地將所述標(biāo)記與附著到所述附著寡核苷酸的實(shí)體(諸如親和試劑)分離。

17、在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于分析生物樣本的標(biāo)記物。所述標(biāo)記物包括特別地根據(jù)上述實(shí)施方案中的一個的至少一個標(biāo)記，和被配置為特異性結(jié)合到所述生物樣本的靶標(biāo)分析物上的親和試劑。特別地，所述標(biāo)記附著到所述親和試劑。這使得能夠提供具有緊湊型標(biāo)記的標(biāo)記物。

18、優(yōu)選地，所述親和試劑是適配體。這使得能夠提供一種緊湊型的標(biāo)記物。特別地，所述適配體被配置為與所述生物樣本的相應(yīng)靶標(biāo)分析物結(jié)合。可替代地，所述親和試劑可以是抗體、單域抗體(也稱為納米抗體)、至少兩個單域抗體的組合、寡核苷酸、嗎啉基、與預(yù)定的rna或dna靶標(biāo)序列互補(bǔ)的pna、配體、或聚合物結(jié)合劑(例如藥物或類藥物分子)、或毒素，例如，與肌動蛋白絲結(jié)合的一種毒素，鬼筆環(huán)肽。

19、特別地，由于所述適配體的所述復(fù)雜結(jié)構(gòu)，和基于所述適配體與所述靶標(biāo)分析物之間的分子間力，所述適配體被配置為特異性地結(jié)合到所述靶標(biāo)分析物。具體地，所述適配體的所述核酸的單獨(dú)、不連續(xù)核苷酸與所述靶標(biāo)分析物結(jié)合，而不是所述核酸的序列的連續(xù)核苷酸與所述靶標(biāo)分析物雜交。

20、優(yōu)選地，所述標(biāo)記共價地附著到所述親和試劑。這能夠?qū)崿F(xiàn)一種穩(wěn)健且緊湊的標(biāo)記物。

21、優(yōu)選地，所述親和試劑包括互補(bǔ)的附著寡核苷酸，所述互補(bǔ)的附著寡核苷酸與所述標(biāo)記的所述附著寡核苷酸互補(bǔ)。這使得所述標(biāo)記通過雜交能夠高效地附著到所述親和試劑。

22、在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了一種用于分析生物樣本的試劑盒。所述試劑盒包括：至少一種標(biāo)記，特別地根據(jù)上述實(shí)施方案的至少一個標(biāo)記；和裂解劑，被配置為裂解所述標(biāo)記的裂解位點(diǎn)。

23、優(yōu)選地，所述試劑盒包括被配置為特異性結(jié)合到所述生物樣本的靶標(biāo)分析物上的親和試劑。這使得能夠用所述試劑盒高效地生成標(biāo)記物。

24、在另一方面，本發(fā)明提供了一種包括至少一個適配體的骨架，所述骨架被配置為通過所述適配體的復(fù)雜結(jié)構(gòu)特異性地結(jié)合到至少一個標(biāo)記部分，以便生成標(biāo)記，具體地如上所述。優(yōu)選地，所述骨架包括至少兩個適配體，每個適配體均被配置為特異性結(jié)合標(biāo)記部分。

25、在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了一種用于分析生物樣本的標(biāo)記盒，所述標(biāo)記盒包括具體地如上所述的骨架，和所述至少一個標(biāo)記部分。

26、術(shù)語和定義

27、“染料”：在本文件中，術(shù)語“熒光染料”、“熒光團(tuán)”、“熒色物”、“染料”可互換使用以表示熒光化學(xué)化合物或結(jié)構(gòu)，并且可以特別是以下中的一個：熒光有機(jī)染料、熒光量子點(diǎn)、熒光二聯(lián)體、熒光碳點(diǎn)、石墨烯量子點(diǎn)或其他碳基熒光納米結(jié)構(gòu)、熒光蛋白、基于熒光dna折紙的納米結(jié)構(gòu)。在有機(jī)熒光染料中，術(shù)語“熒光染料”特別指以下染料的衍生物：氧雜蒽(例如熒光素、羅丹明、俄勒岡綠、texas)、菁(例如菁、吲哚碳菁(indocarbocyanine)、氧雜碳菁(oxacarbocyanine)、硫代碳菁(thiacarbocyanine)、部花菁(merocyanine))、衍生物、方酸輪烷衍生物(squaraine?rotaxane?derivatives)、萘、香豆素、惡二唑、蒽(蒽醌、draq5、draq7、cytrak橙)、芘(cascade?blue)、惡嗪(尼羅紅、尼羅藍(lán)、甲酚紫、惡嗪170)、吖啶(原黃素、吖啶橙、吖啶黃)、芳基次甲基(arylmethine)(金胺、結(jié)晶紫、孔雀綠)、四吡咯(卟吩、酞菁、膽紅素)，二吡咯亞甲基(dipyrromethene)(bodipy、aza-bodipy)、磷光染料或發(fā)光染料。以下商標(biāo)群組指定了可能包括屬于不同化學(xué)家族的染料的市售熒光染料：cf染料(biotium)、draq和cytrak探針(biostatus)、bodipy(invitrogen)、everfluor(setarehbiotech)、alexa?fluor(invitrogen)、bella?fluore(setareh?biotech)、dylight?fluor(thermo?scientific)、atto和tracy(sigma-aldrich)、fluoprobes(interchim)、abberior染料(abberior?dyes)、dy和megastokes染料(dyomics)、sulfo?cy染料(cyandye)、hilytefluor(anaspec)、seta、setau和square染料(seta?biomedicals)、quasar和cal?fluor染料(biosearch?technologies)、surelight染料(columbia?biosciences)、vio染料(miltenyibiotec)(列表修改自：https://en.wikipedia.org/wiki/fluorophore)。在熒光蛋白的組中，特別是綠色熒光蛋白(gfp)家族的成員，包括gfp和gfp樣蛋白(例如dsred、tagrfp)及其(單體化)衍生物(例如ebfp、ecfp、eyfp、cerulaen、mturquoise2、yfp、eyfp、mcitrine、venus、ypet、superfolder?gfp、mcherry、mplum)在本文件中是指術(shù)語“熒光染料”。此外，在熒光蛋白的組中，術(shù)語“熒光染料”在本文件中可以包括熒光蛋白，其吸光度或發(fā)射特性在結(jié)合配體時發(fā)生變化，例如bfpms1，或響應(yīng)于環(huán)境變化而發(fā)生變化，例如氧化還原敏感的rogfp或ph敏感變體。此外，在熒光蛋白的組中，術(shù)語“熒光染料”在本文件中可以包括藍(lán)藻藻膽蛋白的衍生物小超紅色熒光蛋白smurfp以及可以衍生自smurfp的熒光蛋白納米顆粒。在rodriguez等人于2017年在trends?biochem?sci.2017feb；42(2):111-129中可以找到熒光蛋白的概述。術(shù)語“熒光染料”在本文件中還可以指熒光量子點(diǎn)。術(shù)語“熒光染料”在本文件中還可以指熒光碳點(diǎn)、熒光石墨烯量子點(diǎn)、熒光碳基納米結(jié)構(gòu)，如yan等人于2019年在microchimica?acta(2019)186:583以及iravani和varma于2020年在environ?chemlett.2020mar?10:1-25中所描述的。術(shù)語“熒光染料”在本文件中還可以指熒光聚合物點(diǎn)(pdot)或納米金剛石。術(shù)語“熒光染料”在本文件中還可以指熒光二聯(lián)體，例如kacenauskaite等人于2021年在j.am.chem.soc.2021,143,1377-1385中所描述的peryleneantenna和三角形發(fā)射體(triangelium?emitter)的二聯(lián)體。

28、術(shù)語“熒光染料”在本文件中還可以指有機(jī)染料、二聯(lián)體、量子點(diǎn)、聚合物點(diǎn)、石墨烯點(diǎn)、碳基納米結(jié)構(gòu)、基于dna折紙的納米結(jié)構(gòu)、納米尺、摻有染料的聚合物珠、熒光蛋白、無機(jī)熒光染料、smile或填充有上述任何物質(zhì)的微膠囊。

29、術(shù)語“熒光染料”在本文件中還可以指具有至少一種熒光染料作為fret供體和至少一種熒光染料作為fret受體的fret對，或用于生成三組分共振能量轉(zhuǎn)移的fret三重態(tài)(fret-triplet)。特別地，fret對或fret三重態(tài)通過互補(bǔ)接頭或連接元件連接。

30、術(shù)語“熒光染料”在本文件中還可以指物理連接的染料的fret?n元組(n-tuple)。

31、“預(yù)定的靶標(biāo)結(jié)構(gòu)”：在本文件中，“預(yù)定的靶標(biāo)結(jié)構(gòu)”是指靶標(biāo)分子或靶標(biāo)結(jié)構(gòu)或分析物，其可以是例如蛋白質(zhì)(例如特定蛋白質(zhì))、rna序列(例如特定基因的mrna)、肽(例如生長抑素)、dna序列(例如基因位點(diǎn)或元件)、代謝物(例如乳酸)、激素(例如雌二醇)、神經(jīng)遞質(zhì)(例如多巴胺)、維生素(例如鈷胺素)、微量營養(yǎng)素(例如生物素)、金屬離子(例如金屬和重金屬離子，如cd(ii)、co(ii)、pb(ii)、hg(ii)、u(vi))。

32、“樣本”：在本文件中，“樣本”是指生物樣本，其也可稱為生物標(biāo)本，包括例如血液、血清、血漿、組織、體液(例如淋巴液、唾液、精液、間質(zhì)液、腦脊液)、糞便、固體活檢物、液體活檢物、外植體、整個胚胎(例如斑馬魚、果蠅)、整個模型生物(例如斑馬魚幼蟲、果蠅胚胎、秀麗隱桿線蟲(c.elegans))、細(xì)胞(例如原核生物、真核生物、古生菌)、多細(xì)胞生物(例如團(tuán)藻(volvox))、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物、單層細(xì)胞培養(yǎng)物、3d細(xì)胞培養(yǎng)物(例如球狀體(spheroids)、類腫瘤(tumoroids)、源自各種器官(如腸、腦、心、肝臟等)的類器官)、任何上述的裂解物、病毒。在本文件中，“樣本”還指圍繞生物樣本的體積。例如在研究分泌蛋白如生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分的測試中，圍繞細(xì)胞的直至依賴于測試的一定距離的細(xì)胞外環(huán)境，也被稱為“樣本”。具體而言，親和試劑被帶入該圍繞體積在本文件中被稱為“被引入樣本”。