本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，特別是一種基于ilamp檢測苯乙醇胺a的檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

1、苯乙醇胺a(phenylethanolamine?a,peaa)通過食物鏈的傳遞會在人體內(nèi)累積，當(dāng)達到一定量后會對人體的健康產(chǎn)生極大的威脅。目前，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部明確禁止該物質(zhì)添加在動物飼料和動物飲水中。

2、在目前，已經(jīng)有大量研究方法用于檢測β-受體激動劑的殘留，而苯乙醇胺a也是β-受體激動劑的一種，對于其檢測方法的研究主要分為以下幾種：王瑞國等[54]建立的超高效液相色譜(uplc)利用甲酸-甲醇混合液來對不同飼料中的苯乙醇胺a進行測定，該方法有較好的檢出限和定量線(0.3mg/kg和1.0mg/kg)。液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)以色譜為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)，它結(jié)合了色譜分離能力強，質(zhì)譜選擇性和靈敏度高的優(yōu)點。目前，液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)已作為檢測苯乙醇胺a的主要方法，其具有檢測限低，檢測結(jié)果準(zhǔn)確且檢測速度快速等優(yōu)點。但是該方法的對檢測技術(shù)要求較高，儀器昂貴，檢測成本較高，這些也是不可忽視的問題。

3、隨著時代的進步，人類對食品中有毒有害物質(zhì)的關(guān)注度越來越高，因此檢測方法的精確度是現(xiàn)如今仍要突破的方面。在1992年，sano等首次建立了免疫pcr的抗原-抗體反應(yīng)體系。免疫pcr技術(shù)結(jié)合了elisa的高特異性和pcr的擴增性。相比于傳統(tǒng)的elisa，其靈敏度提高103-104倍，且具有很寬的，六個數(shù)量級的線性動態(tài)范圍。免疫pcr是將信號標(biāo)記物從蛋白質(zhì)替換為核酸，利用特定的雙鏈或單鏈dna片段標(biāo)記抗體，再pcr擴增dna報告分子，最后檢測。通過其中的數(shù)量關(guān)系，就能使pcr產(chǎn)物的量可反映出抗原分子的量。一般的免疫pcr反應(yīng)均由4個系統(tǒng)組成：抗原抗體反應(yīng)、橋聯(lián)、指示和檢測系統(tǒng)。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)是2000年由notomi等建立的新型核酸等溫擴增方法。該方法不需要昂貴的pcr儀器，只需要在60-65℃恒溫條件下，就能完成核酸的指數(shù)擴增，且耗時極短。lamp技術(shù)的實現(xiàn)，主要是通過4條特殊的引物以及bst?dna聚合酶。其中4條特殊的引物能夠特異的識別靶序列，而bst?dna聚合酶具有鏈置換的特點。lamp反應(yīng)的結(jié)果判斷可直接通過肉眼觀看，因為在反應(yīng)進行時，隨著dna的合成會產(chǎn)出大量焦磷酸根離子，它們能與反應(yīng)液中的鎂離子生成白色焦磷酸鎂沉淀。由于lamp技術(shù)具有高特異性，高靈敏度，并且擴增高效，操作簡便，目前已被應(yīng)用于各個領(lǐng)域：例如在細菌疾病檢測中，有現(xiàn)有技術(shù)針對大腸桿菌o157中的8個特異性靶區(qū)域設(shè)計了引物，進行l(wèi)amp反應(yīng)，與pcr方法相比將靈敏度提高了10倍以上；在病毒性疾病檢測中，黃書林等利用lamp技術(shù)檢測豬細小病毒，發(fā)現(xiàn)比普通pcr方法靈敏100倍；在支原體的疾病檢測中，有現(xiàn)有技術(shù)以牛支原體的uvrc靶序列設(shè)計了lamp引物，同樣將靈敏度提高了100倍不止。上述lamp技術(shù)的發(fā)展研究，體現(xiàn)了其在動物病原檢測上的廣闊前景，因此將具有高靈敏度、高特異性并且能夠?qū)崿F(xiàn)可視化技術(shù)等特點的lamp應(yīng)用于免疫pcr中，創(chuàng)建一種新型檢測技術(shù)免疫lamp具有很高的可行性；本發(fā)明解決這樣的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于ilamp檢測苯乙醇胺a的檢測試劑盒及其檢測方法，本發(fā)明通過免疫動物獲得抗peaa多克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立了peaa間接競爭elisa法，再將酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)和熒光定量pcr相結(jié)合，建立了免疫-pcr檢測方法，再加入lamp技術(shù)，成功檢測苯乙醇胺a，本方法可靠性高，靈敏性高。

2、為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

3、基于ilam2μg/ml?peaa-ova，2.1mg/ml包被bio-peaa?pab，28.2ng/ml?bio-dna，2.5μl模板，0.5μl濃度為0.2mmol/l的外引物，4μl濃度為1.6mmol/l的內(nèi)引物，2μl濃度為0.8mmol/l的環(huán)引物，3.5μl濃度為1.4mmol/l的dntps，0.5μl濃度為500μmol/l的mncl2，3μl濃度為0.6mol/l的甜菜堿，1μl濃度為200μmol/l的鈣黃綠素，0.5μl濃度為8mmol/l的mgso4，0.5μl濃度為10mmol/l的kcl，1μl濃度為20mmol/l的tris-hcl，1.0μl?bst?dna聚合酶，0.5μl濃度為10mmol/l的(nh4)2so4，0.5μl?0.1％?tween20，4μl?ddh2o；

4、外引物f3為5’-gtaacgccagggttttcc-3’seq?id?no：01、b3為5’cagctatgaccatgattacg-3’seq?id?no：02；

5、內(nèi)引物：fip上游引物為：5’-gtacccggggatcctctagag-3’seq?id?no：03和fip下游引物為5’-ttttccaagctatttaggtgacact-3’seq?id?no：04；bip上游引物為5’-tcgaattcgccctatagtgagtctttt-3’seq?id?no：05和bip下游引物為5’-gtcacgacgttgtaaaacg-3’seq?id?no：06；

6、環(huán)引物：lb為5’-gcaggcatgcaagcttgag-3’seq?id?no：07。

7、基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法，包括：

8、步驟一，通過蘭尼鎳還原法，得到苯乙醇胺a氨基衍生物peaa-nh2；

9、步驟二，將peaa-nh2分別與卵清白蛋白ova和牛血清白蛋白bsa進行重氮化反應(yīng)，分別合成出包被原peaa-ova和免疫原peaa-bsa；

10、步驟三，制備兔多克隆抗體，通過效價測定，獲得了多克隆抗體peaa?pabs；

11、步驟四，建立苯乙醇胺a間接競爭elisa方法，再建立標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測苯乙醇胺a；

12、步驟五，建立lamp方法，利用熒光定量pcr儀對熒光起始時間進行檢測。

13、前述的基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法，步驟一，通過蘭尼鎳還原法，得到苯乙醇胺a氨基衍生物peaa-nh2的具體步驟包括：

14、(a)將稱取的2.0g苯乙醇胺a加入到10ml甲醇中，室溫攪拌溶解1h；

15、(b)稱取0.3g蘭尼鎳，加入到步驟(a)溶解的溶液中，在4mpa氫氣條件下反應(yīng)8h；

16、(c)將得到的反應(yīng)產(chǎn)物過濾，旋干，用適量乙酸乙酯和石油醚重結(jié)晶得到苯乙醇胺a氨基衍生物peaa-nh2，用13c?nmr、1h?nmr與質(zhì)譜進行分子結(jié)構(gòu)鑒定。

17、前述的基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法，步驟二，將peaa-nh2分別與卵清白蛋白ova和牛血清白蛋白bsa進行重氮化反應(yīng)，分別合成出包被原peaa-ova和免疫原peaa-bsa的具體步驟包括；

18、(1)稱取18.9mg?peaa-nh2，加入1.2ml硫酸，4℃下溶解20min；

19、(2)在碎冰上邊滴加邊攪拌0.3ml的亞硝酸鈉溶液于步驟(1)得到的溶液中，然后加入適量的氨基磺酸銨，用淀粉碘化鉀試紙檢測，當(dāng)滲圈變成無色后停止添加，在4℃下攪拌30min。

20、(3)稱取150mg?bsa溶于4ml碳酸緩沖液，將以上活化的peaa-nh2溶液逐滴滴加入，4℃下攪拌反應(yīng)過夜；

21、(4)將步驟(3)反應(yīng)產(chǎn)物裝入透析袋中，在0.01mol/l的pbs緩沖液透析4天，每天換透析液2次；透析后的溶液放于-20℃保存?zhèn)溆?；采用相同的方法合成包被原peaa-ova。

22、前述的基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法，步驟四，建立苯乙醇胺a間接競爭elisa方法，再建立標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測苯乙醇胺a的具體方法包括：

23、1、按照下面公式(2-1)計算結(jié)合率(b/b0值)，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

24、結(jié)合率(％)＝b/b0×100％(1-1)，

25、其中b和b0分別為加入標(biāo)準(zhǔn)品和rac濃度為0時測定的od450nm；

26、2、按照公式(2-2)，將實驗測的苯乙醇胺a濃度值的平均值同實際添加的苯乙醇胺a濃度值比較得到添加回收率；

27、回收率(％)＝樣品實測濃度/樣品添加濃度×100％(1-2)。

28、前述的基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法，步驟五中建立lamp方法的具體步驟包括：優(yōu)化包被peaa-ova的工作濃度，優(yōu)化包被bio-peaa?pab的工作濃度，優(yōu)化bio-dna的工作濃度，優(yōu)化lamp反應(yīng)體系后建立peaa免疫-lamp。

29、前述的基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法，優(yōu)化包被peaa-ova的工作濃度和優(yōu)化包被bio-peaa?pab的工作濃度的具體方法為：分別用7500、15000、30000倍稀釋的peaa-ova和500、1000、2000、4000倍稀釋的bio-peaa?pab在1％戊二醛處理的pcr管里進行棋盤法實驗：將不同稀釋倍數(shù)的peaa-ova包被于戊二醛處理pcr管中，50μl/管，4℃孵育過夜；倒去管內(nèi)液體后用pbst洗滌1次；加入封閉液，200μl/管，37℃封閉2h；倒掉封閉液,分別加入0ppb和1ppb的peaa準(zhǔn)品(50μl/管)和不同稀釋倍數(shù)的bio-peaa?pab(50μl/管)，37℃孵育l?h；倒去管內(nèi)液體后，加入稀釋2000倍的sa(50μl/管)，37℃孵育l?h；再次倒掉反應(yīng)液bio-dna(50μl/管)，37℃孵育l?h；倒去管中液體后，用pbst和滅菌水分別洗滌5次，加入lamp體系，進行反應(yīng)，并用熒光定量pcr儀實時監(jiān)測；以peaa標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0ppb的tt值最小且濃度在0ppb與1ppb之間的tt值差異(δtt)最大者為最佳抗原抗體工作濃度。

30、前述的基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法，優(yōu)化lamp反應(yīng)體系的方法包括：lamp引物的設(shè)計、外內(nèi)引物比的優(yōu)化、最佳lamp反應(yīng)溫度優(yōu)化、最佳bst聚合酶添加量優(yōu)化；

31、lamp引物的設(shè)計方法：采用primer?explorer?version?4.0系統(tǒng)，以pgem-3z載體質(zhì)粒dna上長度為209bp的片段作為目標(biāo)dna，采用primer?premier?5.0與beacon?designer7.9分別設(shè)計lamp的環(huán)引物和內(nèi)外引物；

32、外內(nèi)引物比的優(yōu)化方法：將外內(nèi)引物的濃度比設(shè)定為1:2,1:4,1:6,1:8,1:10,1:12，通過比較熒光結(jié)果來確定最佳外內(nèi)引物比；

33、最佳lamp反應(yīng)溫度優(yōu)化方法：分別將反應(yīng)溫度梯度設(shè)定為60-66℃，通過比較收到熒光值的時間來確定最佳反應(yīng)溫度；

34、bst聚合酶添加量優(yōu)化方法：將bst酶的添加量分別設(shè)置為2u、4u、6u、8u、10u、12u；通過比較熒光結(jié)果來確定最佳bst聚合酶的添加量。

35、前述的基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法，建立peaa免疫-lamp的方法包括：

36、將最佳工作濃度的peaa-ova包被于1％戊二醛預(yù)處理的pcr管中，50μl/管；4℃包被24h后棄板內(nèi)液體，用pbst清洗1次，拍干；加入封閉液(200μl/管)；37℃條件下孵育2h后倒去封閉液，pbst洗滌3次后，拍干；分別加入最佳工作濃度的bio-peaa?pab和不同濃度的peaa標(biāo)準(zhǔn)品，50μl/管；37℃孵育l?h后棄管內(nèi)反應(yīng)液，pbst洗滌3次后，拍干；加入最佳工作濃度的sa，50μl/管；37℃孵育1h后倒掉液體后pbst洗滌3次，拍干；加入最佳工作濃度的bio-dna，50μl/管；37℃孵育1h后倒掉液體；清洗10次，即pbst和滅菌超純水各5次后，按照lamp反應(yīng)體系與程序擴增；

37、確立免疫lamp方法步驟如下：用cb包被液將peaa-ova稀釋成1:7500(2μg/ml)，包被于1％戊二醛預(yù)處理的pcr管中，50μl/管；4℃包被24h后棄板內(nèi)液體，用pbst清洗1次，拍干；加入封閉液(200μl/管)；37℃條件下孵育2h后倒去封閉液，pbst洗滌3次后，拍干；分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和最佳工作濃度的bio-peaa?pab(2.1μg/ml)，50μl/管；37℃孵育l?h后棄管內(nèi)反應(yīng)液，pbst洗滌3次后，拍干；加入最佳工作濃度的sa(1.5μg/ml)，50μl/管；37℃孵育1h后倒掉液體后pbst洗滌3次；加入稀釋成1:1600的bio-dna(28.2ng/ml)，50μl/管；37℃孵育1h后倒掉液體分別用pbst與滅菌超純水洗滌5次，加入lamp體系，然后65℃恒溫下反應(yīng)60min，利用熒光定量pcr儀對熒光起始時間進行檢測。

38、前述的基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法，lamp體系包括：2.5μl模板，0.5μl濃度為0.2mmol/l的外引物，4μl濃度為1.6mmol/l的內(nèi)引物，2μl濃度為0.8mmol/l的環(huán)引物,3.5μl濃度為1.4mmol/l的dntps，0.5μl濃度為500μmol/l的mncl2，3μl濃度為0.6mol/l的甜菜堿，1μl濃度為200μmol/l的鈣黃綠素，0.5μl濃度為8mmol/l的mgso4，0.5μl濃度為10mmol/l的kcl，1.0μl濃度為20mmol/l的tris-hcl，1.0μl?bst?dna聚合酶，0.5μl濃度為10mmol/l的(nh4)2so4，0.5μl?0.1％?tween?20，ddh2o補足25μl。

39、本發(fā)明的有益之處在于：

40、本發(fā)明通過通過蘭尼鎳還原法，得到苯乙醇胺a氨基衍生物，即peaa-nh2，將peaa-nh2分別與卵清白蛋白(ova)和牛血清白蛋白(bsa)進行重氮化反應(yīng)，分別合成出包被原peaa-ova和免疫原peaa-bsa；再采用常規(guī)免疫方法進行免疫新西蘭大白兔，通過效價測定，獲得了多克隆抗體peaa?pabs(1#和5#)進行后續(xù)實驗，建立了苯乙醇胺a間接競爭elisa方法，再通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測苯乙醇胺a，各個步驟之間實現(xiàn)協(xié)同，使得本方法的ic50值為0.401ng/ml，ic10為0.035ng/ml,對苯乙醇胺a的交叉反應(yīng)率很高,并且對其余11種β-受體激動劑交叉反應(yīng)率均在0.01％以下；在實際樣品檢測時，回收率為86.2-116.6％，板內(nèi)變異系數(shù)小于4.41％，板間變異系數(shù)小于9.58％，說明本發(fā)明的可靠性；

41、本發(fā)明通過對lamp體系優(yōu)化，包括外內(nèi)引物比、反應(yīng)溫度和bst聚合酶的添加量的優(yōu)化，以及包被抗原與生物素標(biāo)記抗體ilamp體系下的最佳工作濃度優(yōu)化。優(yōu)化體系與peaa間接競爭ilamp法配合在特異性上實現(xiàn)協(xié)同；實驗結(jié)果表明該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為：y＝1.1949x+42.251，r2＝0.956。ic50為0.0396±0.009ng/ml，同間接競爭elisa相比，提高了一個數(shù)量級，最低檢測限為0.0044ng/ml，同樣提高了一個數(shù)量級。用ilamp法進行特異性實驗結(jié)果表明，ilamp同樣具有較高的特異性。