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基于ILAMP檢測苯乙醇胺A的檢測試劑盒及其檢測方法

文檔序號:41954939發(fā)布日期:2025-05-16 14:20閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.基于ilamp檢測苯乙醇胺a的檢測試劑盒,其特征在于,包括:2μg/ml?peaa-ova,

2.基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法,其特征在于,包括:

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法,其特征在于,所述步驟一,通過蘭尼鎳還原法,得到苯乙醇胺a氨基衍生物peaa-nh2的具體步驟包括:

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法,其特征在于,所述步驟二,將peaa-nh2分別與卵清白蛋白o(hù)va和牛血清白蛋白bsa進(jìn)行重氮化反應(yīng),分別合成出包被原peaa-ova和免疫原peaa-bsa的具體步驟包括;

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法,其特征在于,所述步驟四,建立苯乙醇胺a間接競爭elisa方法,再建立標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測苯乙醇胺a的具體方法包括:

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法,其特征在于,所述步驟五中建立lamp方法的具體步驟包括:優(yōu)化包被peaa-ova的工作濃度,優(yōu)化包被bio-peaa?pab的工作濃度,優(yōu)化bio-dna的工作濃度,優(yōu)化lamp反應(yīng)體系后建立peaa免疫-lamp。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法,其特征在于,所述優(yōu)化包被peaa-ova的工作濃度和優(yōu)化包被bio-peaa?pab的工作濃度的具體方法為:分別用7500、15000、30000倍稀釋的peaa-ova和500、1000、2000、4000倍稀釋的bio-peaa?pab在1%戊二醛處理的pcr管里進(jìn)行棋盤法實驗:將不同稀釋倍數(shù)的peaa-ova包被于戊二醛處理pcr管中,50μl/管,4℃孵育過夜;倒去管內(nèi)液體后用pbst洗滌1次;加入封閉液,200μl/管,37℃封閉2h;倒掉封閉液,分別加入0ppb和1ppb的peaa準(zhǔn)品(50μl/管)和不同稀釋倍數(shù)的bio-peaapab(50μl/管),37℃孵育l?h;倒去管內(nèi)液體后,加入稀釋2000倍的sa(50μl/管),37℃孵育lh;再次倒掉反應(yīng)液bio-dna(50μl/管),37℃孵育l?h;倒去管中液體后,用pbst和滅菌水分別洗滌5次,加入lamp體系,進(jìn)行反應(yīng),并用熒光定量pcr儀實時監(jiān)測;以peaa標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0ppb的tt值最小且濃度在0ppb與1ppb之間的tt值差異(δtt)最大者為最佳抗原抗體工作濃度。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法,其特征在于,所述優(yōu)化lamp反應(yīng)體系的方法包括:lamp引物的設(shè)計、外內(nèi)引物比的優(yōu)化、最佳lamp反應(yīng)溫度優(yōu)化、最佳bst聚合酶添加量優(yōu)化;

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法,其特征在于,所述建立peaa免疫-lamp的方法包括:

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于ilamp檢測苯乙醇胺a的方法,其特征在于,所述lamp體系包括:2.5μl模板,0.5μl濃度為0.2mmol/l的外引物,4μl濃度為1.6mmol/l的內(nèi)引物,2μl濃度為0.8mmol/l的環(huán)引物,3.5μl濃度為1.4mmol/l的dntps,0.5μl濃度為500μmol/l的mncl2,3μl濃度為0.6mol/l的甜菜堿,1μl濃度為200μmol/l的鈣黃綠素,0.5μl濃度為8mmol/l的mgso4,0.5μl濃度為10mmol/l的kcl,1.0μl濃度為20mmol/l的tris-hcl,1.0μlbst?dna聚合酶,0.5μl濃度為10mmol/l的(nh4)2so4,0.5μl?0.1%tween?20,ddh2o補足25μl。


技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種基于ILAMP檢測苯乙醇胺A的檢測試劑盒及其檢測方法,涉及生物檢測領(lǐng)域,本方法通過免疫動物獲得抗PEAA多克隆抗體,在此基礎(chǔ)上建立了PEAA間接競爭ELISA法,再將酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和熒光定量PCR相結(jié)合,建立了免疫?PCR檢測方法,再加入LAMP技術(shù),成功檢測苯乙醇胺A;本方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性檢測范圍、IC<subgt;50</subgt;和最低檢測限同間接競爭ELISA相比,提高了一個數(shù)量級;變異系數(shù)(CV)不超過10%,本方法具有較強的可靠性,且ILAMP特異性檢測結(jié)果表明,本方法對PEAA有很高的特異性,與其他11種β?受體激動劑物質(zhì)沒有交叉反應(yīng)(CR<0.04%)。

技術(shù)研發(fā)人員:馬骉,張明洲,郝培應(yīng),林俊瀟,付賢樹,鄧欣
受保護(hù)的技術(shù)使用者:中國計量大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日:
技術(shù)公布日:2025/5/15
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