本申請涉及生物免疫學檢測，具體涉及抗鴨呼腸孤病毒單克隆抗體雜交瘤細胞及其檢測應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、我國年養(yǎng)殖商品水禽數(shù)量近50億只，龐大的養(yǎng)殖規(guī)模及廣泛的地域分布伴隨著多種疾病的發(fā)生和流行。鴨呼腸孤病毒（duck?reovirus，drv）感染在我國商品鴨和鵝群中廣泛發(fā)生，病毒感染造成雛鴨和鵝免疫系統(tǒng)嚴重損傷及死亡，給水禽生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失。鴨呼腸孤病毒屬于呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬，是一種感染鴨的無囊膜、具有雙層衣殼的分節(jié)段雙鏈rna病毒。病毒基因組由3個長節(jié)段（l1、l2、l3），3個中節(jié)段（m1、m2、m3）和4個小節(jié)段（s1、2、s3、s4）組成，編碼8個結(jié)構(gòu)蛋白和4個非結(jié)構(gòu)蛋白。μns蛋白為病毒m3基因編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，蛋白大小約70kd，含有635個氨基酸，是唯一一個在感染細胞中形成包涵體（病毒工廠并招募蛋白）的蛋白，在病毒形態(tài)發(fā)生早期具有重要作用。目前對鴨呼腸孤病毒的主要監(jiān)測和診斷方法是病毒分離或者利用分子生物學技術(shù)檢測病毒核酸，也有針對表面結(jié)構(gòu)蛋白σb和σc建立elisa監(jiān)測方法的報道。呼腸孤病毒屬于rna病毒，存在頻繁變異的情況，臨床上出現(xiàn)不同毒力或者感染不同宿主的毒株，近年來，根據(jù)在不同基因型和血清學上的差異，在發(fā)現(xiàn)番鴨呼腸孤病毒（muscovy?duck?reovirus，mdrv）之后，亦稱經(jīng)典鴨呼腸孤病毒（classical?duck?reovirus，c-drv），有新型呼腸孤病毒（novel?duck?reovirus，ndrv）和禽鴨呼腸孤病毒b（avian?reovirusb，arv-b）的報道，這些毒株基因型以及表面結(jié)構(gòu)蛋白存在不同程度變異，在基層動物疫病防控中，需一種針對不同基因型或者血清型毒株檢測通用的方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述存在的技術(shù)局限性，本申請?zhí)岢鲆环N鴨呼腸孤病毒單克隆抗體雜交瘤細胞及其檢測應(yīng)用；其克服了背景技術(shù)中提到的不足和缺陷。

2、為實現(xiàn)上述目的，本申請采用了以下技術(shù)方案：

3、本申請的發(fā)明點是提供一種抗鴨呼腸孤病毒單克隆抗體3c3，由保藏編號為cgmccno.46129的雜交瘤細胞株drv-3c3所分泌得到。

4、本申請的第二個發(fā)明點是提供了分泌抗鴨呼腸孤病毒單克隆抗體3c3的雜交瘤細胞株drv-3c3，其保藏編號為cgmcc?no.46129。

5、菌株為分泌抗鴨呼腸孤病毒單克隆抗體3c3的雜交瘤細胞株drv-3c3，分類命名為一株產(chǎn)鴨呼腸孤病毒μns蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞，已于2024年11月7日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為cgmcc?no.46129。

6、本申請的第三個發(fā)明點是提供了上述的抗鴨呼腸孤病毒單克隆抗體3c3在制備用于檢測鴨呼腸孤病毒的生物制品中的應(yīng)用。

7、本申請的第四個發(fā)明點是提供了一種檢測鴨呼腸孤病毒的阻斷elisa試劑盒，所述試劑盒包括上述的單克隆抗體3c3。

8、可選地，上述的阻斷elisa試劑盒，所述試劑盒還包括鴨呼腸孤病毒、標準陰性血清、標準陽性血清、碳酸鹽緩沖液、封閉液、洗滌液（pbst）、辣根過氧化物酶（hrp）標記羊抗鼠igg、顯色液和終止液。

9、本申請的第五個發(fā)明點是提供了非診斷目的的鴨呼腸孤病毒的阻斷elisa檢測方法，包括以下步驟：

10、s1.抗原包被：用碳酸鹽包被液稀釋所述鴨呼腸孤病毒，在酶標板中每孔加入80-120μl，于2-6℃包被12-18h，棄去包被液；

11、s2.洗滌：每孔加入洗滌液進行洗滌3次，棄去孔中液體，拍干；

12、s3.封閉：每孔加入封閉液180-220μl，36-38℃封閉1.5-2.5h，棄去封閉液，按照s2步驟進行洗滌；

13、s4.待檢血清孵育：以樣品稀釋液將陽性對照血清、陰性對照血清以及待檢血清稀釋后，每孔加入80-120μl進行孵育，36-38℃孵育50-70min，之后棄去孔中液體，按照s2步驟進行洗滌；

14、s5.單抗孵育：以稀釋液稀釋純化腹水后，每孔加入80-120μl進行孵育，36-38℃孵育50-70min，之后棄去孔中液體，按照s2步驟進行洗滌；

15、s6.酶標二抗孵育：1：（4000-6000）稀釋的hrp標記羊抗鼠igg，每孔加入80-120μl進行孵育，36-38℃孵育50-70min，之后棄去孔中液體，按照s2步驟進行洗滌；

16、s7.顯色：將顯色劑a液與b液等體積混合，每孔加入80-120μl，避光顯色；

17、s8.終止：每孔加入終止液40-60μl，終止反應(yīng)；

18、s9.讀數(shù)：用酶標儀測定各孔在450nm波長處的吸光度od值

19、可選地，上述的鴨呼腸孤病毒的間接elisa檢測方法，所述呼腸孤病毒抗原μns蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

20、可選地，上述的鴨呼腸孤病毒的間接elisa檢測方法，編碼所述呼腸孤病毒抗原μns蛋白的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

21、本申請的第六個發(fā)明點是提供了一種上述鴨呼腸孤病毒單克隆抗體3c3或者上述試劑盒在鴨群臨床血清學監(jiān)測中的應(yīng)用。

22、本申請的第七個發(fā)明點是提供了一種上述鴨呼腸孤病毒單克隆抗體3c3或者上述試劑盒在用于禽類感染鴨呼腸孤病毒和接種鴨呼腸孤病毒疫苗后的血清抗體及免疫評估中的應(yīng)用。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相對比，本申請具有以下優(yōu)點：

24、本申請通過用鴨呼腸孤病毒免疫小鼠和常規(guī)單克隆抗體制備方法，獲得了一種抗鴨呼腸孤病毒μns蛋白特異性單克隆抗體，其分泌的抗體為3c3，以此抗體構(gòu)建阻斷elisa檢測的方法，對比檢測臨床血清，與western?blot方法、間接免疫熒光方法有相同的結(jié)果，該方法檢測特異性強，通量大和成本低，結(jié)果直觀，以滿足當前基層鴨呼腸孤病毒監(jiān)測的需求

技術(shù)特征：

1.一種抗鴨呼腸孤病毒單克隆抗體3c3，其特征在于，由保藏編號為cgmcc?no.46129的雜交瘤細胞株drv-3c3所分泌得到。

2.分泌抗鴨呼腸孤病毒單克隆抗體3c3的雜交瘤細胞株drv-3c3，其保藏編號為cgmccno.46129。

3.權(quán)利要求1所述的鴨呼腸孤病毒單克隆抗體3c3在制備用于檢測鴨呼腸孤病毒的生物制品中的應(yīng)用。

4.一種檢測鴨呼腸孤病毒的阻斷elisa試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體3c3。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的阻斷elisa試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括含有鴨呼腸孤病毒、標準陰性血清、標準陽性血清、碳酸鹽緩沖液、封閉液、洗滌液（pbst）、辣根過氧化氫酶（hrp）標記羊抗鼠igg、顯色液和終止液。

6.一種非診斷目的的鴨呼腸孤病毒抗體阻斷elisa方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的鴨呼腸孤病毒的阻斷elisa檢測方法，其特征在于，所述呼腸孤病毒抗原μns蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的鴨呼腸孤病毒的阻斷elisa檢測方法，其特征在于，編碼所述呼腸孤病毒抗原μns蛋白的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

9.一種權(quán)利要求1所述鴨呼腸孤病毒單克隆抗體3c3或者權(quán)利要求4所述試劑盒在鴨群臨床血清學監(jiān)測中的應(yīng)用。

10.一種權(quán)利要求1所述鴨呼腸孤病毒單克隆抗體3c3或者權(quán)利要求4所述試劑盒在用于禽類感染鴨呼腸孤病毒和接種鴨呼腸孤病毒疫苗后的血清抗體及免疫效果評估中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本申請通過用鴨呼腸孤病毒免疫小鼠和常規(guī)單克隆抗體制備方法，獲得了一種抗鴨呼腸孤病毒μNS蛋白特異性單克隆抗體，該雜交瘤細胞的保藏編號為CGMCC?No.46129，其分泌的抗體為3C3，以此抗體構(gòu)建阻斷ELISA檢測的方法，對比檢測臨床血清，與Western?Blot方法、間接免疫熒光方法有相同的結(jié)果，該方法檢測特異性強，通量大和成本低，結(jié)果直觀，以滿足當前基層鴨呼腸孤病毒監(jiān)測的需求。

技術(shù)研發(fā)人員：任瑞,蘇敬良,張艷,趙乃鈺,江岳
受保護的技術(shù)使用者：中國農(nóng)業(yè)大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15