本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種雙功能連接劑、n端定點(diǎn)聚乙二醇化蛋白及其制備工藝和在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、干擾素亞型ifnα-2b已被證明具有較強(qiáng)的抗乙肝病毒活性，但較短的血漿半衰期限制了其應(yīng)用。為此，瑞士羅氏制藥對(duì)ifnα-2b進(jìn)行了非定點(diǎn)的長鏈（平均分子量為40kda）聚乙二醇化修飾，顯著延長了ifnα-2b的半衰期，在2002年被fda批準(zhǔn)用于慢性丙型肝炎治療，商品名為“派羅欣”（pegasys）；2005年，派羅欣被批準(zhǔn)用于慢性乙型肝炎治療。

2、然而，非定點(diǎn)的聚乙二醇修飾會(huì)將聚乙二醇鏈修飾于干擾素所有賴氨酸的側(cè)鏈上，盡管延長了半衰期，但可能會(huì)減弱藥物的活性。

3、為解決非定點(diǎn)聚乙二醇修飾所存在的問題，公告號(hào)為103087182?b的中國發(fā)明專利公開了一種定點(diǎn)修飾n-末端的聚乙二醇化生長激素拮抗劑及其制備方法，該方法包括：將gha置換到50mm?naac-hac緩沖液（ph5.5）中，調(diào)整gha濃度為2.2mg/ml（0.1mm）；按gha：peg醛（20kda）：nacnbh3的摩爾比1:8:80混合各原料，并在4℃下反應(yīng)過夜（約16?小時(shí)），而后采用superdex200?凝膠過濾柱（1.6cm×60cm）對(duì)修飾產(chǎn)物m-p20k-gha進(jìn)行分離純化，洗脫液為20mm?磷酸緩沖液（ph7.2）。該技術(shù)雖然采用peg醛實(shí)現(xiàn)了對(duì)肽鏈n端的定點(diǎn)修飾，但反應(yīng)需要在nacnbh3（氰基硼氫化鈉）存在下進(jìn)行，且nacnbh3用量極大；眾所周知，氰基硼氫化鈉是一種劇毒試劑，該試劑的大量使用使得該蛋白修飾方法過程具有極高的危險(xiǎn)性，且對(duì)環(huán)境不利。

4、因此，亟需開發(fā)條件溫和、綠色環(huán)保的蛋白質(zhì)n端定點(diǎn)修飾技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種雙功能連接劑、n端定點(diǎn)聚乙二醇化蛋白及其制備工藝和在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用。

2、為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

3、本發(fā)明首先提供了一種雙功能連接劑，該雙功能連接劑的結(jié)構(gòu)中至少含有用于連接修飾基團(tuán)的連接基團(tuán)r1，以及用于連接肽鏈的連接基團(tuán)r2；

4、其中，所述的連接基團(tuán)r2至少包括具有自然化學(xué)連接反應(yīng)活性的苯基硫酯基團(tuán)。

5、本發(fā)明的雙功能連接劑中含有苯基硫酯基團(tuán)，該苯基硫酯基團(tuán)能夠與肽鏈n端游離的半胱氨酸發(fā)生自然化學(xué)連接反應(yīng)，反應(yīng)機(jī)理為：首先，硫酯基團(tuán)中的羰基被肽鏈n端游離的半胱氨酸側(cè)鏈巰基進(jìn)攻，使得苯基離去；而后半胱氨酸上的游離氨基介導(dǎo)重排反應(yīng)，與羰基形成酰胺鍵，從而將已通過連接基團(tuán)r1與修飾基團(tuán)相連的雙功能連接劑連接到肽鏈n端。

6、該雙功能連接劑與肽鏈發(fā)生的是自然化學(xué)連接反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和、可控，且不需要使用有毒試劑，對(duì)環(huán)境和人員均十分友好，綠色環(huán)保；并且該自然化學(xué)連接反應(yīng)需要半胱氨酸的游離巰基和游離氨基共同參與，因此只會(huì)發(fā)生在處于肽鏈n端的半胱氨酸上，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)肽鏈n端的定點(diǎn)修飾。

7、在實(shí)現(xiàn)連接劑與肽鏈n端的連接后，連接劑與修飾基團(tuán)之間的連接方式即可選擇本領(lǐng)域已知的、與修飾基團(tuán)對(duì)應(yīng)的任意可行方式。本發(fā)明的雙功能連接劑對(duì)修飾基團(tuán)無特殊選擇性，可廣泛適用；只需確保連接基團(tuán)r1能正確地與之連接即可。作為具體實(shí)施方式的舉例，在上述的雙功能連接劑中，所述的連接基團(tuán)r1至少包括具有點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)活性的炔基。

8、具有點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)活性的炔基能夠與疊氮發(fā)生husigen環(huán)加成反應(yīng)，從而能夠?qū)㈦p功能連接劑與具有疊氮修飾的修飾基團(tuán)快速、高效地連接起來，并最終實(shí)現(xiàn)修飾基團(tuán)與肽鏈n端的連接。

9、作為優(yōu)選，所述的炔基與疊氮發(fā)生的husigen環(huán)加成反應(yīng)能夠在無銅催化劑下進(jìn)行，以消除銅催化劑的毒性。

10、作為優(yōu)選，在上述的雙功能連接劑中，所述的炔基由以下基團(tuán)提供：

11、。

12、在此基礎(chǔ)上，上述的雙功能連接劑的結(jié)構(gòu)式可呈現(xiàn)為：

13、；

14、其中，r3選自-h、-(ch2)ncooh、鹵素原子、氰基、烷氧基或三氟甲基，n為1-4；r4、r5、r6和r7獨(dú)立地選自-h、-oh、-ch3、鹵素原子、氰基、烷氧基或三氟甲基，r8選自co(ch2)m，m為1-10。

15、本發(fā)明還提供了上述的雙功能連接劑的制備方法，該制備方法包括以下步驟：

16、（1）將二苯基環(huán)辛炔-羧酸、失水劑和?；呋瘎┯萌軇┤芙夂?，與對(duì)巰基苯乙酸混合，在室溫下攪拌反應(yīng)過夜；

17、作為優(yōu)選，對(duì)巰基苯乙酸與二苯基環(huán)辛炔-羧酸的摩爾比為（1-2）：2；

18、作為優(yōu)選，所述的溶劑包括二氯甲烷（dcm）、dmf或丙酮中的至少一種；

19、（2）反應(yīng)完全后純化，獲得所述的雙功能連接劑。

20、在上述反應(yīng)溶劑、失水劑和酰化催化劑的存在下，二苯基環(huán)辛炔-羧酸（提供炔基）中的羧基和對(duì)巰基苯乙酸（提供苯基巰基）中的巰基發(fā)生?；磻?yīng)，形成的雙功能連接劑的結(jié)構(gòu)式為：

21、。

22、本發(fā)明還提供了一種n端定點(diǎn)聚乙二醇化蛋白，該蛋白即采用上述的雙功能連接劑將聚乙二醇修飾到蛋白n端的半胱氨酸上獲得。

23、作為優(yōu)選，在上述的n端定點(diǎn)聚乙二醇化蛋白中，所述的聚乙二醇的平均分子量為20-40?kda；

24、所述的蛋白包括干擾素，所述的干擾素包括ifnα-2b、ifnα14、ifnα2-eifk及各種干擾素突變體中的至少一種。

25、本發(fā)明對(duì)所要修飾的蛋白的類型和肽鏈組成無特殊要求，只要蛋白的肽鏈n端氨基酸為半胱氨酸即可。則在待修飾的蛋白類型不同時(shí)，對(duì)作為修飾基團(tuán)的聚乙二醇的平均分子量的要求就會(huì)有所不同（聚乙二醇的鏈長應(yīng)滿足：在盡可能地延長蛋白的血漿半衰期的同時(shí)不會(huì)削弱蛋白的活性）。

26、以ifnα14為例，聚乙二醇的平均分子量在20-40?kda時(shí)均不會(huì)削弱ifnα14活性。

27、本發(fā)明還提供了上述的n端定點(diǎn)聚乙二醇化蛋白的制備方法，該制備方法包括以下步驟：

28、（a）將所述的雙功能連接劑和疊氮修飾的聚乙二醇按摩爾比（1~5）：1溶于溶劑中，攪拌反應(yīng)過夜；待反應(yīng)完全后純化、干燥，獲得peg-linker偶聯(lián)物；

29、（b）將還原型ifnα14和步驟（a）獲得的peg-linker偶聯(lián)物以等摩爾量加入到含蛋白質(zhì)變性劑的緩沖液中，以發(fā)生自然化學(xué)連接反應(yīng)；反應(yīng)完成后對(duì)水透析、凍干，獲得粗品；

30、（c）將步驟（b）獲得的粗品稀釋于含蛋白質(zhì)變性劑的tris-hcl緩沖液中，在室溫及氧化條件下折疊，折疊完成后純化，獲得所述的n端定點(diǎn)聚乙二醇化蛋白。

31、作為優(yōu)選，在上述的n端定點(diǎn)聚乙二醇化蛋白的制備方法中，步驟（a）中采用的溶劑為乙腈和n,n-二甲基甲酰胺中的至少一種與水的混合溶劑；

32、步驟（b）采用的緩沖液為nah2po4緩沖液中，nah2po4的終濃度為0.1-1m；

33、所述的蛋白質(zhì)變性劑包括鹽酸胍、尿素、異硫氰酸胍或丙酮中的至少一種，更優(yōu)選為鹽酸胍；

34、步驟（b）及（c）采用的nah2po4緩沖液中，該鹽酸胍的終濃度為1-10?m。

35、本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用上述的雙功能連接劑將聚乙二醇修飾到干擾素n端的半胱氨酸上后，所獲得的n端定點(diǎn)聚乙二醇化干擾素表現(xiàn)出優(yōu)異的抗乙肝病毒活性。

36、因此，本發(fā)明還提供了一種n端定點(diǎn)聚乙二醇化干擾素，該n端定點(diǎn)聚乙二醇化干擾素即采用上述的雙功能連接劑將聚乙二醇修飾到干擾素n端的半胱氨酸上而獲得的，所述的干擾素包括ifnα-2b、ifnα14、ifnα2-eifk及各種干擾素突變體中的至少一種。

37、本發(fā)明還提供了該n端定點(diǎn)聚乙二醇化干擾素在制備抗乙肝病毒藥物中的應(yīng)用。

38、本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，與ifnα-2b相比，ifnα14表現(xiàn)出更優(yōu)秀的抗乙肝病毒活性，在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明采用上述的雙功能連接劑和聚乙二醇對(duì)ifnα14進(jìn)行n端定點(diǎn)修飾，在保留其抗乙肝病毒活性的基礎(chǔ)上，大大延長了其血漿半衰期。

39、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

40、（1）本發(fā)明的雙功能連接劑中含有苯基硫酯基團(tuán)，該苯基硫酯基團(tuán)能夠與肽鏈n端游離的半胱氨酸發(fā)生自然化學(xué)連接反應(yīng)，反應(yīng)機(jī)理為：首先，硫酯基團(tuán)中的羰基被肽鏈n端游離的半胱氨酸側(cè)鏈巰基進(jìn)攻，使得苯基離去；而后半胱氨酸上的游離氨基介導(dǎo)重排反應(yīng)，與羰基形成酰胺鍵，從而將已通過連接基團(tuán)r1與修飾基團(tuán)相連的雙功能連接劑連接到肽鏈n端。該雙功能連接劑與肽鏈發(fā)生的自然化學(xué)連接反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和、可控，且不需要使用有毒試劑，對(duì)環(huán)境和人員均十分友好，綠色環(huán)保；并且該自然化學(xué)連接反應(yīng)需要半胱氨酸的游離巰基和游離氨基共同參與，因此只會(huì)發(fā)生在處于肽鏈n端的半胱氨酸上，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)肽鏈n端的定點(diǎn)修飾。

41、（2）本發(fā)明的雙功能連接劑中，連接基團(tuán)r1至少包括具有點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)活性的炔基；該炔基能夠與疊氮發(fā)生husigen環(huán)加成反應(yīng)，從而能夠?qū)㈦p功能連接劑與具有疊氮修飾的修飾基團(tuán)快速、高效地連接起來，并最終實(shí)現(xiàn)修飾基團(tuán)與肽鏈n端的連接。

42、（3）本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用本發(fā)明的雙功能連接劑將聚乙二醇修飾到干擾素n端的半胱氨酸上后，所獲得的n端定點(diǎn)聚乙二醇化干擾素不僅表現(xiàn)出優(yōu)異的抗乙肝病毒活性，而且具備更長的血漿半衰期；因此，能夠?qū)⒃搉端定點(diǎn)聚乙二醇化干擾素α14用于制備抗乙肝病毒藥物，為乙肝的治療提供更為有效的途徑。