本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種rtn4基因編碼蛋白功能喪失細(xì)胞系及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

1、豬繁殖與呼吸綜合征（porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome,prrs）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine?reproductive?and?respiratory?syndromevirus,?prrsv）產(chǎn)生的一種高度傳染性豬疫病。已報(bào)道的prrsv分為兩種類(lèi)型：歐洲型prrsv-1和美洲型prrsv-2，同源性為60%。臨床癥狀主要為繁殖母豬受精率降低，懷孕母豬流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等繁殖障礙以及不同年齡段豬呼吸道癥狀等。prrs在全球范圍內(nèi)廣泛傳播,目前已成為威脅全球養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病之一，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。prrsv病毒粒子是有囊膜的、單股正鏈rna病毒。該病毒具有高變異、免疫抑制和持續(xù)性感染等特性，導(dǎo)致該病難以防控。因此prrsv一直是獸醫(yī)領(lǐng)域重點(diǎn)研究的對(duì)象。

2、rtn4是細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的網(wǎng)狀蛋白家族成員蛋白，又稱(chēng)神經(jīng)突生長(zhǎng)抑制劑或nogo，包含兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)c端雙賴(lài)氨酸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)檢索基序。廣泛參與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)分泌和膜轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生理病理過(guò)程。由于在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中啟動(dòng)子和剪接方式的不同，導(dǎo)致編碼亞型的不同形成了異構(gòu)體，包含了3個(gè)主要異構(gòu)體：nogo-a、nogob和nogo-ch2，nogo蛋白存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（er）和細(xì)胞表面。

3、marc-145細(xì)胞來(lái)源于非洲綠猴的胚胎腎組織的上皮樣細(xì)胞，從母細(xì)胞（ma-104細(xì)胞）克隆而得到，可連續(xù)傳代培養(yǎng)。marc-145細(xì)胞是一種常用于病毒培養(yǎng)的細(xì)胞系，豬藍(lán)耳病病毒對(duì)此細(xì)胞尤為敏感，是豬藍(lán)耳病病毒及其防控技術(shù)研究中的重要材料。crispr/cas9介導(dǎo)的基因組工程已被廣泛高效地應(yīng)用于各種物種中，可實(shí)現(xiàn)條件性基因敲除、基因敲入、基因替換、點(diǎn)突變等等，為基因的功能研究提供了一個(gè)有吸引力的策略。cas9靶向切割dna是通過(guò)一條向?qū)na鏈，即sgrna（single?guide?rna）介導(dǎo)的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種rtn4基因編碼蛋白功能喪失細(xì)胞系在抑制prrsv復(fù)制中應(yīng)用，選擇野生型marc-145細(xì)胞系作為基礎(chǔ)，使用cas9在引導(dǎo)序列的引導(dǎo)下對(duì)rtn4基因進(jìn)行切割，實(shí)現(xiàn)rtn4基因的敲除，導(dǎo)致rtn4蛋白無(wú)法表達(dá)，得到rtn4基因敲除的marc-145細(xì)胞系，可以有效抑制ⅱ型prrsv感染，為后續(xù)獲得可有效抑制prrsv感染且不影響豬生長(zhǎng)性能的豬群提供了理論基礎(chǔ)。

2、本發(fā)明的另一目的在于提供一種使rtn4基因編碼蛋白的功能喪失構(gòu)建具有prrsv抗性細(xì)胞系的應(yīng)用。

3、優(yōu)選地，所述使rtn4基因編碼蛋白的功能喪失的方法包括基因敲除、基因突變或基因插入。

4、本發(fā)明的另一目的在于提供一對(duì)特異性靶向rtn4基因的sgrna，包括sgrna1和sgrna2，sgrna1的dna序列如seq?id?no:1，sgrna2的dna序列如seq?id?no:2所示。

5、sgrna1：5’-agacctggaccagtcgcctc-3’?（seq?id?no：1）；

6、sgrna2：5’-ccctgatggacttcggaaat-3’?（seq?id?no：2）

7、本發(fā)明的另一目的在于提供上述sgrna在敲除rtn4基因中的應(yīng)用。

8、本發(fā)明的另一目的在于提供上述sgrna在制備rtn4基因編碼蛋白功能喪失細(xì)胞系中的應(yīng)用。

9、本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于敲除rtn4基因的試劑盒，所述試劑盒包括上述?sgrna或靶向敲除rtn4基因的打靶載體，所述靶向敲除rtn4基因的打靶載體包括上述sgrna和cas9蛋白基因的編碼序列。

10、本發(fā)明的另一目的在于提供一種非診斷和治療目的rtn4基因編碼蛋白功能喪失細(xì)胞系的構(gòu)建方法，所述方法為：通過(guò)基因打靶技術(shù)使宿主細(xì)胞中rtn4基因編碼蛋白功能喪失。

11、優(yōu)選地，所述方法為crispr-cas9技術(shù)。

12、優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟：

13、（1）制備含有粘性末端的特異性靶向rtn4基因的sgrna寡聚核苷酸的雙鏈片段；

14、（2）將步驟（1）制備的雙鏈片段插入到cas9表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)，得到同時(shí)表達(dá)cas9蛋白基因和打靶sgrna序列的重組載體；

15、（3）將步驟（2）制備的重組載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，挑取單個(gè)細(xì)胞，接種培養(yǎng)，獲得rtn4基因功能缺失細(xì)胞系。

16、本發(fā)明的另一目的在于提供一種根據(jù)上述方法制備獲得的rtn4基因編碼蛋白功能喪失細(xì)胞系。

17、本發(fā)明的另一目的在于提供一種rtn4基因編碼蛋白功能喪失細(xì)胞系或?qū)崿F(xiàn)rtn4基因編碼蛋白功能喪失的物質(zhì)的如下任一應(yīng)用：

18、a.制備預(yù)防或治療豬繁殖與呼吸綜合征的產(chǎn)品；

19、b.或制備提高機(jī)體或機(jī)體細(xì)胞對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗性產(chǎn)品；

20、c.或制備抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的細(xì)胞；

21、d.或制備抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒豬；

22、e.或抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒豬育種；

23、f.或構(gòu)建豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗性細(xì)胞模型；

24、g.或構(gòu)建豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗性豬模型。

25、優(yōu)選地，所述機(jī)體為哺乳動(dòng)物。

26、優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物為豬。

27、優(yōu)選地，使猴rtn4蛋白實(shí)現(xiàn)所述突變的物質(zhì)為spcas9和與spcas9相配合的sgrna。所述sgrna引導(dǎo)spcas9實(shí)現(xiàn)敲除編輯：剪切去除sgrna序列引導(dǎo)的基因片段，實(shí)現(xiàn)基因沉默。

28、本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種非診斷和治療目的rtn4基因突變細(xì)胞的構(gòu)建方法，包括如下步驟：使豬原代胎兒成纖維細(xì)胞中野生型rtn4基因沉默，以實(shí)現(xiàn)rtn4基因敲除效果。

29、本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種非診斷和治療目的rtn4基因敲除基因編輯豬的構(gòu)建方法，為如下兩種方法：

30、第一種方法包括如下步驟：

31、使離體豬原代胎兒成纖維細(xì)胞中rtn4基因沉默，使rtn4基因無(wú)法正常表達(dá)，得到rtn4基因敲除細(xì)胞；

32、將所述rtn4基因敲除細(xì)胞作為核移植供體細(xì)胞通過(guò)體細(xì)胞核移植入母豬體內(nèi)，生產(chǎn)的子代即為rtn4基因敲除豬；

33、第二種方法包括如下步驟：

34、將上述使rtn4基因發(fā)生上述敲除的物質(zhì)導(dǎo)入到豬合子期胚胎中，得到rtn4基因敲除胚胎，再將所述rtn4基因敲除胚胎移植入母體內(nèi)經(jīng)妊娠，獲得rtn4基因敲除豬。

35、有益效果如下：

36、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)rtn4基因不表達(dá)可有效抑制ⅱ型prrsv感染的位點(diǎn)，利用基因敲除成功制備了rtn4基因敲除的marc-145細(xì)胞，可有效的抑制ⅱ型prrsv的復(fù)制。為獲得可有效抑制prrsv感染且不影響豬生長(zhǎng)性能和的豬群提供了理論基礎(chǔ)，為prrsv的防控研究提供了新的思路。利用rtn4基因敲除的細(xì)胞得到的基因編輯豬的制備方法，具有操作方便，普適性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，且制備得到的rtn4基因敲除豬具有良好的prrsv抗性。