本發(fā)明屬于微藻生物，具體涉及一種從纖細(xì)裸藻發(fā)酵液中提取制備外泌體的方法。

背景技術(shù)：

1、裸藻是一類具有動(dòng)物和植物雙屬性的單細(xì)胞真核生物，培養(yǎng)方式有光自養(yǎng)培養(yǎng)、兼養(yǎng)培養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中能合成多種活性物質(zhì)，包括：裸藻多糖、類胡蘿卜素、必需維生素、氨基酸、礦物質(zhì)和不飽和脂肪酸等。因此，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值，在飼料、食品、營(yíng)養(yǎng)品、藥物、化妝品和生物能源等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間。

2、細(xì)胞外囊泡(extracellular?vesicles，evs)是細(xì)胞分泌的雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)小泡，在各種細(xì)胞及組織之間起著物質(zhì)傳遞、信息溝通的作用，其各亞群主要以直徑大小區(qū)分。而外泌體(exosomes)，是由細(xì)胞內(nèi)多泡小體形成的多囊泡體(multivesicular?bodies，mvbs)與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外環(huán)境中的膜性小囊泡，其直徑為30～150nm。研究表明，裸藻細(xì)胞產(chǎn)生并分泌evs至培養(yǎng)環(huán)境中，在微藻環(huán)境適應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸、病毒感染、調(diào)節(jié)生態(tài)平衡，以及疾病治療和載藥平臺(tái)構(gòu)建等領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力。

3、近年來(lái)，外泌體已成為生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，目前大部分關(guān)于外泌體的研究成果多集中于動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源的外泌體。然而其提取制備工藝復(fù)雜，成本高，收率低；如果把動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源的外泌體作為藥物載體，含有與供體細(xì)胞一致的脂質(zhì)、核酸及蛋白等，應(yīng)用過(guò)程存在安全性問(wèn)題。而植物來(lái)源的外泌體，作為藥物載體其安全性更為可靠。目前對(duì)裸藻外泌體的提取制備工藝研究較少，且對(duì)植物外泌體提取制備存在提取困難和純度低等問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、裸藻細(xì)胞中富含有高價(jià)值的天然色素、多不飽和脂肪酸和多糖等多種營(yíng)養(yǎng)和功能成分，裸藻在產(chǎn)生外泌體的過(guò)程中，分選多種細(xì)胞活性組成成分進(jìn)入外泌體，使得裸藻外泌體可作為治療劑直接作用于受體細(xì)胞，表現(xiàn)出細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的作用，在醫(yī)藥治療、化妝品和保健品領(lǐng)域行使治療功能。由于目前對(duì)裸藻外泌體提取制備方法的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本發(fā)明提供了一種從裸藻發(fā)酵液中提取制備外泌體的方法，該方法以纖細(xì)裸藻突變株為發(fā)酵藻種進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)，在特有的工藝下進(jìn)行發(fā)酵和提取制備，所獲得的裸藻外泌體在醫(yī)藥治療、化妝品和保健品應(yīng)用領(lǐng)域具有較好的前景。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一種從裸藻發(fā)酵液中提取制備外泌體的方法，包括以下步驟：

4、(1)將裸藻(euglena?gracilis)cgmcc?no.40684轉(zhuǎn)接至固體em培養(yǎng)基制備成藻種；

5、(2)配置液體em液體培養(yǎng)基進(jìn)行洗板，制備成種子液；

6、(3)將em種子液轉(zhuǎn)接至eg液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)培；

7、(4)擴(kuò)培好的eg種子液轉(zhuǎn)接至種子罐進(jìn)行二級(jí)擴(kuò)培；

8、(5)將種子液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；

9、(6)發(fā)酵液預(yù)處理；

10、(7)裸藻發(fā)酵液外泌體的提取制備；

11、上述步驟(1)所述em固體培養(yǎng)基包含以下成分：5-20g/l無(wú)水乙醇、0.03-0.08g/l尿素、0.01-0.015g/l氯化鈣、0.2-0.7g/l磷酸二氫鉀、1.2-2.0g/l硫酸鎂、0.001-0.002g/l氯化錳、0.001-0.002g/l硝酸鈷、0.0004-0.0008g/l硫酸鋅、0.0002-0.0006g/l硫酸銅、0.002-0.008g/l硫酸鐵、0.0005-0.0008g/l乙酸二鈉、0.0001-0.0004g/l維生素b1、0.000005-0.000008g/l維生素b12、5-20g/l瓊脂粉；上述步驟(2)所述em液體培養(yǎng)基組成成分是：em固體培養(yǎng)基中不添加瓊脂粉制備而成；

12、上述步驟(3)所述eg液體培養(yǎng)基包含以下成分：10-30g/l葡萄糖、0.03-0.08g/l尿素、0.01-0.015g/l氯化鈣、0.2-0.7g/l磷酸二氫鉀、1.2-2.0g/l硫酸鎂、0.001-0.002g/l氯化錳、0.001-0.002g/l硝酸鈷、0.0004-0.0008g/l硫酸鋅、0.0002-0.0006g/l鉬酸、0.00002-0.00006g/l硫酸銅、0.002-0.008g/l硫酸鐵、0.0005-0.0008g/l乙酸二鈉、0.0001-0.0004g/l維生素b1、0.000005-0.000008g/l維生素b12；

13、進(jìn)一步地，所述步驟(1)培養(yǎng)條件為：

14、培養(yǎng)溫度25-30℃、培養(yǎng)時(shí)間7-10d、接種量100-200μl、光照培養(yǎng)；

15、進(jìn)一步地，所述步驟(2)、(3)培養(yǎng)條件為：

16、培養(yǎng)溫度25-30℃、培養(yǎng)時(shí)間3-5d、接種量5-10v/v％、光照培養(yǎng)；

17、進(jìn)一步地，所述步驟(4)培養(yǎng)條件為：

18、0-72h：培養(yǎng)溫度25-30℃、接種量5-10％、ph?3-5，罐壓0.05-0.1mpa、轉(zhuǎn)速50-150rpm、通氣量0.3-1.0m3/h、光照培養(yǎng)；

19、72-120h：培養(yǎng)溫度25-30℃、接種量5-10％、ph?3-5，罐壓0.05-0.1mpa、轉(zhuǎn)速50-150rpm、通氣量0.3-1.0m3/h；

20、進(jìn)一步地，所述步驟(5)培養(yǎng)條件為：

21、0-72h：培養(yǎng)溫度25-30℃、接種量5-10％、ph?3-5，罐壓0.05-0.1mpa、轉(zhuǎn)速50-150rpm、通氣量0.3-1.0m3/h、光照培養(yǎng)；

22、72-120h：培養(yǎng)溫度25-30℃、接種量5-10％、ph?3-5，罐壓0.05-0.1mpa、轉(zhuǎn)速50-150rpm、通氣量0.3-1.0m3/h；

23、優(yōu)選地，所述培養(yǎng)過(guò)程中當(dāng)葡萄糖濃度低于10g/l時(shí)進(jìn)行一次性的eg培養(yǎng)基補(bǔ)料分批發(fā)酵；

24、進(jìn)一步地，所述步驟(6)中的預(yù)處理的條件為：

25、取新鮮藻液30ml?5000g離心30min，去除上清液里的大塊碎片；離心結(jié)束后將上層液轉(zhuǎn)移至新的容器內(nèi)，丟棄下層沉淀，得到外泌體粗提液，將其放入-80℃冰箱凍存，待需要時(shí)提前一晚放入4℃冰箱解凍。

26、進(jìn)一步地，所述步驟(7)中的制備涉及過(guò)膜、沉淀、離心；

27、所述的過(guò)膜過(guò)程，濾膜大小為：0.22um。

28、所述的沉淀過(guò)程，具體實(shí)施步驟為：將外泌體粗提液過(guò)0.22um濾膜過(guò)濾，得到濾液。將提前配制好的peg6000溶液與濾液按照體積比1：1混勻，開(kāi)始一次沉淀，置于4℃冰箱過(guò)夜沉淀。

29、所述的沉淀劑濃度：18％-26％；優(yōu)選地，所述沉淀劑濃度為24％；

30、所述的沉淀過(guò)程，具體實(shí)施步驟為：8000g-12000g離心力離心1h；優(yōu)選地，所述離心力為11000g。

31、本發(fā)明的有益效果：

32、1.本發(fā)明采用離心和沉淀相結(jié)合的方法，該法操作簡(jiǎn)單，分離得到的外泌體生物活性也不受影響，為裸藻發(fā)酵液外泌體提取制備及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

33、2.本發(fā)明所述的裸藻發(fā)酵濾液中發(fā)酵結(jié)束階段外泌體含量最高，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)取樣，降低了發(fā)酵過(guò)程中染菌風(fēng)險(xiǎn)。

34、3.本發(fā)明使用的離心速度較其它超高速離心提取制備法較低，且與沉淀法相結(jié)合，沉淀劑易得，工藝簡(jiǎn)單，可行度高。