本發(fā)明涉及基因工程，尤其涉及一種類芽孢桿菌的反向篩選標記、基因編輯載體及其構(gòu)建方法和應用。

背景技術：

1、類芽孢桿菌屬(paenibacillus?sp.)廣泛存在于土壤、水體、動植物體等環(huán)境中，具有豐富的碳水化合物酶系統(tǒng)，并可在高溫、高酸性、高堿性和高滲性等極端條件下生長。在與人類疾病關系的分析中，類芽孢桿菌屬在健康人腸道中的豐度高于疾病患者，提示該菌屬具有益生潛能。大多數(shù)類芽孢桿菌對人類或動物無害，并通過產(chǎn)生抑菌劑和生物營養(yǎng)物來促進植物生長。類芽孢桿菌被列為一級安全菌株，并將這些菌株作為微生物育種的標準。美國食品和藥物管理局(fda)已將許多類芽孢桿菌分類為公認安全(gras)，美國環(huán)境保護署(epa)已批準這些物種用于商業(yè)用途。

2、基因編輯技術在許多細菌中被廣泛應用，但在類芽孢桿菌屬中的應用僅限于部分菌株，如多粘類芽孢桿菌，在其他類芽孢桿菌中則鮮有報道?；蚓庉嫹椒ㄓ性谀康幕蛏舷掠瓮幢壑虚g引入抗性基因的有痕敲除，及基于crispr-cas9基因編輯技術的無痕敲除，而利用反向篩選標記的基因編輯技術尚未有報道。

3、蔗糖致死基因sacb是目前基因編輯中常用的一種反向篩選標記，sacb基因編碼蔗糖果聚糖酶，該酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并且將果糖聚合成高分子量的果聚糖，高分子量果聚糖積累對細胞存在潛在的毒性作用，可造成細胞死亡。因此sacb基因作為反向篩選標記，經(jīng)過2次同源重組和2次篩選后得到目的菌株。但發(fā)明人團隊采用該反向篩選標記對類芽孢桿菌菌株進行基因敲除，并未篩選到耐蔗糖的目的菌落。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，類芽孢桿菌菌株基因組中含有果聚糖酶編碼基因，可以將產(chǎn)生的果聚糖水解而消除致死因素。所以，對于類芽孢桿菌，傳統(tǒng)的反向篩選標記并不適用，需要開發(fā)新的反向篩選標記。

4、近年來，有研究發(fā)現(xiàn)編碼苯丙氨酸t(yī)rna合成酶α亞基的phes基因的突變體可以用作細菌的反向篩選標記，從早期的單突變到后來的雙突變，使得篩選效率顯著提高。該篩選標記已在很多細菌(如芽孢桿菌、擬桿菌、球菌等)中使用，但在類芽孢桿菌中的應用尚未研究報道。目標菌中phes突變體通過與菌株自身的野生型phes蛋白相競爭，在翻譯過程中錯誤引入培養(yǎng)基中的p-cl-phe到合成的蛋白中，使得細菌死亡。但這一篩選標記需要應用到類芽孢桿菌中，至少需要克服以下問題：1)如何設計類芽孢桿菌的phes基因的突變體，既保證該基因所用密碼子頻率符合類芽孢桿菌，使其高效表達，同時降低與目標菌中野生型phes基因間的相似度；2)如何尋找出適用于類芽孢桿菌的超強啟動子，使得在篩選過程中突變型phes基因的表達水平高于野生型，來提高篩選效率和成功率；3)如何選出適用于基因編輯載體的抗性基因標記，以確保單交換突變株篩選的成功率。

技術實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明鑒定了類芽孢桿菌phes基因及蛋白序列，通過引入了關鍵的氨基酸(a294和t251對應的氨基酸)雙突變和同義突變，開發(fā)了一種類芽孢桿菌的反向篩選標記并命名為mphes基因，其編碼的phes突變體合成的trna可以將對氯苯丙氨酸組裝進蛋白質(zhì)，從而使蛋白質(zhì)失去活性，導致菌體死亡，達到篩選的目的。以苯丙氨酰-trna合成酶基因突變體作為類芽孢桿菌基因編輯中的反向篩選標記可實現(xiàn)對編輯成功的菌株進行高效篩選。此外，本發(fā)明還提供了能驅(qū)動mphes基因高效表達的sgsepromoter進一步提高了篩選的效率和成功率。

2、本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種類芽孢桿菌的反向篩選標記，芽孢桿菌屬菌株拉丁學名為paenibacillussp.；所述的反向篩選標記為突變后的編碼類芽孢桿菌苯丙氨酸t(yī)rna合成酶α亞基的phes基因，命名為mphes基因；mphes基因?qū)е铝司幋a的類芽孢桿菌苯丙氨酸t(yī)rna合成酶α亞基發(fā)生了t255s和a309g雙取代突變，phes突變體通過與菌株自身的野生phes蛋白競爭，翻譯過程中將苯丙氨酸類似物對氯苯丙氨酸(簡寫為p-cl-phe，cas編號：14173-39-8)錯誤地摻入到合成的蛋白質(zhì)中，從而在對氯苯丙氨酸存在條件下，表達phes突變體的菌株死亡，不表達phes突變體的菌株生存。

4、在一些優(yōu)選的實施例中，所述類芽孢桿菌屬菌株為paenibacillus?sp.xp02，保藏編號為cctcc?no：m?20242534。所述類芽孢桿菌xp02為paenibacillus?sp.xp02，已于2024年11月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctcc?no：m?20242534，保藏地址為湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號。

5、paenibacillus?sp.xp02是一株革蘭氏陽性桿菌，具有降解多種非淀粉多糖的功能。根據(jù)全基因組測序結(jié)果及生物信息學分析，該菌株所在菌屬廣泛存在于土壤、水體、動植物體等環(huán)境中，具有豐富的碳水化合物酶系統(tǒng)。

6、在一些優(yōu)選的實施例中，所述的mphes基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

7、進一步地，所述的mphes基因編碼的phes突變體的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

8、第二方面，本發(fā)明提供了一種用于無痕基因編輯類芽孢桿菌的質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體命名為pksp-2質(zhì)粒載體，是以pk18mobsacb為出發(fā)載體，用反向篩選標記mphes基因表達盒替換原始反向篩選標記sacb基因表達盒，再增加第二抗性篩選標記基因表達盒構(gòu)建獲得；第二抗性篩選標記不同于pk18mobsacb中原始的第一抗性篩選標記kanr。

9、在一些優(yōu)選的實施例中，所述第二抗性篩選標記基因表達盒為氯霉素抗性基因表達盒。

10、在一些優(yōu)選的實施例中，所述反向篩選標記mphes基因表達盒包括來源于嗜高溫芽孢桿菌屬的強啟動子sgsepromoter，所述sgsepromoter核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

11、所述sgsepromoter為溫敏型啟動子，文獻報道該啟動子在37℃的啟動表達水平約是28℃的3倍，45℃時可增加到20倍。(novotny,r.,berger,h.,schinko,t.,messner,p.,&strauss,j..(2011).atemperature-sensitive?expression?system?based?on?thegeobacillus?stearothermophilus?nrs2004/3a?sgse?surface-layer?genepromoter.biotechnology&appliedbiochemistry.)本發(fā)明通過相關篩選和驗證，確認所述sgsepromoter能使后續(xù)篩選實驗過程中mphes基因的表達水平高于野生型。在另一些實施例中所述sgse?promoter也可采用其他適用于類芽孢桿菌的強啟動子替代。

12、在一些優(yōu)選的實施例中，所述pksp-2質(zhì)粒載體核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

13、所述pksp-2質(zhì)粒載體，如圖1所示，包括：位于868-1456bp的復制起始位點、位于2425-2534bp的接合轉(zhuǎn)移復制起始位點、位于2887-3921bp的反向篩選標記mphes基因、位于3922-4321bp的sgse?promoter序列、位于4367-5305bp的氯霉素抗性基因及其啟動子序列、位于5346-6140bp的卡那霉素抗性基因及其啟動子序列。

14、第三方面，本發(fā)明還提供了一種類芽孢桿菌無痕基因編輯的方法，利用權(quán)利要求1所述的反向篩選標記對類芽孢桿菌進行基因編輯，所述基因編輯包括基因的敲除、插入或替換。

15、本發(fā)明所提供的所述用于無痕基因編輯類芽孢桿菌的質(zhì)粒載體，以及所述無痕基因編輯的方法，其原理包括：pksp-2質(zhì)粒載體僅在大腸桿菌中可以復制，但在類芽孢桿菌中無法復制，因此，在類芽孢桿菌中只有發(fā)生同源臂交換，整合至基因組中才能使載體上基因得以表達，而且只有發(fā)生第二次同源交換整合了成功基因編輯的片段恢復至野生型phes基因的菌株才能在氯苯丙氨酸存在下存活。當發(fā)生二次交換后，因該質(zhì)粒無法在目標菌中復制，經(jīng)過一段時間的菌體增殖后，該質(zhì)粒會逐漸消除，達到無痕基因編輯的目的。

16、在一些優(yōu)選的實施例中，所述的無痕基因編輯的方法，包括如下步驟：

17、s1構(gòu)建如權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體為pksp-2質(zhì)粒載體；

18、s2將靶基因位點上下游同源臂拼接后插入到pksp-2質(zhì)粒載體上，獲得含有同源臂的質(zhì)粒載體，最后將含有同源臂的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到類芽孢桿菌中，獲得敲除靶基因的類芽孢桿菌；或，將靶基因上下游同源臂和目的基因片段拼接后，插入到pksp-2質(zhì)粒載體上，獲得含有同源臂和目的基因的質(zhì)粒載體，最后將含有同源臂和目的基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到類芽孢桿菌中，獲得目標基因插入或替換的類芽孢桿菌。

19、在一些優(yōu)選的實施例中，所述的無痕基因編輯的方法，步驟s2中，將含有同源臂/含有同源臂和目的基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到類芽孢桿菌后，先通過第二抗性篩選標記進行一次篩選，獲得陽性轉(zhuǎn)化子，再通過對氯苯丙氨酸篩選標記進行二次篩選，獲得基因編輯成功的菌落。

20、在一些優(yōu)選的實施例中，所述的靶基因位點上下游同源臂為靶基因位點兩側(cè)大小為200-1500bp的核苷酸片段。

21、在一些優(yōu)選的實施例中，所述的無痕基因編輯的方法，步驟s1中，包括：

22、(a1)合成mphes基因與sgse啟動子，并分別進行pcr擴增，再構(gòu)建融合片段sgse-mphes(拼接mphes基因與sgse啟動子片段)；

23、(a2)將sgse-mphes片段插入pk18mobsacb載體，將獲得含sgse-mphes片段的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到dh5α感受態(tài)細胞，獲得含sgse-mphes片段的菌株，保菌并提取質(zhì)粒，將所獲得的(中間)質(zhì)粒載體命名為pksp-1質(zhì)粒載體；

24、(a3)從質(zhì)粒pht43上pcr擴增氯霉素抗性基因片段，再將其插入pksp-1載體獲得pksp-2質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化到dh5α感受態(tài)細胞，獲得含pksp-2質(zhì)粒載體的菌株，保菌并提取質(zhì)粒；

25、其中，步驟(a1)中融合片段sgse-mphes為反向篩選標記mphes基因表達盒的實施例中的一種，步驟(a2)中將sgse-mphes片段插入pk18mobsacb載體的同時，pk18mobsacb載體上的原始反向篩選標記sacb基因表達盒被sgse-mphes片段取代。

26、本發(fā)明具有如下有益效果：

27、本發(fā)明采用苯丙氨酰-trna合成酶基因突變體特異識別對氯苯丙氨酸而致細胞致死性作為類芽孢桿菌基因編輯中的反向篩選標記，特異性高，可實現(xiàn)編輯成功的菌株的高效篩選，該篩選標記適用于傳統(tǒng)同源重組打靶技術。本發(fā)明的基因編輯方法可以實現(xiàn)對類芽孢桿菌基因組的無痕編輯和精準編輯，能夠?qū)崿F(xiàn)對類芽孢桿菌基因編輯過程的高效篩選。反向篩選技術對類芽孢桿菌屬基因進行無痕基因編輯的研究目前仍未有報道。既往常用的反向篩選標記如sacb在類芽孢桿菌中無法應用。本發(fā)明所提供的mphes反向篩選標記有助于深入研究類芽孢桿菌的遺傳特性，充分挖掘該菌的應用前景。