本發(fā)明涉及分子生物學，具體地說，涉及 arf1作為內(nèi)參基因在西方蜜蜂實時熒光定量pcr檢測中的應用。
背景技術(shù)：
：：1、西方蜜蜂（ apis?mellifera）是重要的傳粉昆蟲和典型的社會性昆蟲，蜂群內(nèi)成員建立了成熟的社會分工體系。其中，成年工蜂表現(xiàn)出日齡依賴性的勞動分工，即年輕工蜂主要從事清理巢房、哺育幼蟲等巢內(nèi)工作，而年老工蜂主要擔巢外花粉和花蜜采集等外勤勞務(wù)。工蜂由哺育到采集行為的轉(zhuǎn)變具有可塑性，可以根據(jù)蜂群需求靈活地加速、延遲或逆轉(zhuǎn)，相關(guān)組織器官的結(jié)構(gòu)功能和基因表達會發(fā)生相應調(diào)整，例如咽下腺的發(fā)育程度和泌漿活性、觸角對幼蟲信息素的敏感性等。此外，從意大利蜜蜂（ a.?m.?ligustica）中選育的蜂王漿高產(chǎn)品系（漿蜂）的產(chǎn)漿能力遠高于未選育的意大利蜜蜂和西方蜜蜂其他亞種，其新出房蜂、哺育蜂和采集蜂的咽下腺、觸角和腦中均發(fā)生了與蜂王漿高產(chǎn)表型相適應的基因表達模式變化。蜜蜂腺體發(fā)育、勞動分工、蜂王漿高產(chǎn)機制等科學問題一直是昆蟲生物學領(lǐng)域的研究熱點，基因表達水平的準確定量是挖掘相關(guān)功能基因和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵所在。 2、實時熒光定量pcr（real-time?quantitative?pcr，rt-qpcr）是定量基因表達水平的重要技術(shù)，其準確定量的前提是基于穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因進行目的基因表達數(shù)據(jù)的歸一化。不同內(nèi)參基因在不同處理條件下的表達水平可能存在差異，因此需要篩選和驗證在特定條件下穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因。雖然不同亞種西方蜜蜂成年工蜂在不同發(fā)育時期各組織中的功能基因研究備受關(guān)注，但此條件下內(nèi)參基因的使用尚存在亟待改進的問題。首先，以往研究經(jīng)常使用 actin和 gapdh等不同的內(nèi)參基因，導致研究結(jié)果的可比性受到影響，而且這些內(nèi)參基因在有些條件下的表達穩(wěn)定性較差，例如農(nóng)藥處理后的西方蜜蜂（kim?s,?cho?s,lee?sh.?selection?of?stable?reference?genes?for?real-time?quantitative?pcr?inhoney?bee?pesticide?toxicity?studies.?journal?of?apicultural?research,?2022,61(1):?26-36）。其次，現(xiàn)有的西方蜜蜂內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的比較研究主要使用整只蜜蜂，或簡單分為頭、胸、腹三部分，無法反映特定組織中內(nèi)參基因表達的真實水平。最后，目前對西方蜜蜂內(nèi)參基因的篩選大多集中在單一條件下，缺乏對西方蜜蜂成年工蜂不同亞種、不同發(fā)育時期、不同組織等多種條件下內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的全面解析。因此，急需開發(fā)一種同時適用于這些條件下的內(nèi)參基因，為深入研究蜜蜂生產(chǎn)性能差異、腺體發(fā)育和行為可塑性等科學問題提供科學支撐。 技術(shù)實現(xiàn)思路1、本發(fā)明的目的之一在于提供一種可提高檢測結(jié)果可信度的西方蜜蜂成年工蜂基因研究時所用內(nèi)參基因及其應用。2、本發(fā)明提供了 arf1作為內(nèi)參基因在西方蜜蜂成年工蜂不同組織的實時熒光定量pcr檢測中的應用，所述西方蜜蜂為意大利蜜蜂和/或卡尼鄂拉蜂，所述不同組織包括咽下腺、觸角和/或腦。 3、本發(fā)明還提供了 arf1作為內(nèi)參基因在分析西方蜜蜂成年工蜂不同組織的不同基因表達情況中的應用，所述西方蜜蜂為意大利蜜蜂和/或卡尼鄂拉蜂，所述不同組織包括咽下腺、觸角和/或腦。 4、本發(fā)明首次提出將 arf1基因作為特定亞種西方蜜蜂成年工蜂不同組織的rt-qpcr的內(nèi)參基因?qū)δ繕嘶虻谋磉_水平進行歸一化，解決了不同條件研究中西方蜜蜂的內(nèi)參基因泛用的現(xiàn)狀，同時為不同亞種西方蜜蜂成年工蜂不同發(fā)育時期和組織基因的表達研究奠定了重要基礎(chǔ)。 5、本發(fā)明還提供了擴增 arf1基因的引物組在進行西方蜜蜂成年工蜂不同組織的實時熒光定量pcr檢測中的應用，所述西方蜜蜂為意大利蜜蜂和/或卡尼鄂拉蜂，所述不同組織包括咽下腺、觸角和/或腦。 6、本發(fā)明還提供了擴增 arf1基因的引物組在西方蜜蜂成年工蜂的不同發(fā)育時期差異基因篩選或鑒定中的應用，所述西方蜜蜂為意大利蜜蜂和/或卡尼鄂拉蜂。 7、本發(fā)明還提供了擴增 arf1基因的引物組在制備西方蜜蜂成年工蜂的不同發(fā)育時期差異基因篩選或鑒定產(chǎn)品或制備西方蜜蜂成年工蜂不同組織的實時熒光定量pcr檢測試劑或試劑盒中的應用，所述西方蜜蜂為意大利蜜蜂和/或卡尼鄂拉蜂。 8、本發(fā)明的應用中，西方蜜蜂成年工蜂的不同發(fā)育時期差異基因篩選或鑒定通過檢測不同發(fā)育時期的西方蜜蜂成年工蜂的咽下腺、觸角和/或腦實現(xiàn)。9、本發(fā)明的應用中，不同發(fā)育時期的西方蜜蜂成年工蜂指新出房蜂（羽化出房時間小于12?h）、哺育蜂（頭部伸入幼蟲巢房且持續(xù)時間超過10?s）和/或采集蜂（后足花粉筐攜帶花粉的歸巢蜜蜂）。10、本發(fā)明的應用中， arf1的核苷酸序列如seq?id?no.21所示。 11、本發(fā)明的應用中，所述引物組包括：正向引物：5’-ctgtatgggacgtaggtgg-3’和反向引物：5’-cattcattgcatttgggag-3’。12、本發(fā)明的有益效果至少在于：13、本發(fā)明提供了 arf1基因作為內(nèi)參基因在rt-qpcr檢測特定亞種西方蜜蜂基因轉(zhuǎn)錄表達水平中的應用，能夠用于研究不同亞種西方蜜蜂成年工蜂不同發(fā)育時期和組織中關(guān)鍵差異基因的表達情況，提高了檢測結(jié)果的可信度以及基因表達分析研究的穩(wěn)定性、可靠性和重復性，應用廣泛，為西方蜜蜂差異基因的表達研究奠定了重要基礎(chǔ)。 技術(shù)特征：1.arf1作為內(nèi)參基因在西方蜜蜂成年工蜂不同組織的實時熒光定量pcr檢測中的應用，所述西方蜜蜂為意大利蜜蜂和/或卡尼鄂拉蜂，所述不同組織包括咽下腺、觸角和/或腦。2.arf1作為內(nèi)參基因在分析西方蜜蜂成年工蜂不同組織的不同基因表達情況中的應用，所述西方蜜蜂為意大利蜜蜂和/或卡尼鄂拉蜂，所述不同組織包括咽下腺、觸角和/或腦。3.擴增arf1基因的引物組在進行西方蜜蜂成年工蜂不同組織的實時熒光定量pcr檢測中的應用，所述西方蜜蜂為意大利蜜蜂和/或卡尼鄂拉蜂，所述不同組織包括咽下腺、觸角和/或腦。4.擴增arf1基因的引物組在西方蜜蜂成年工蜂的不同發(fā)育時期差異基因篩選或鑒定中的應用，所述西方蜜蜂為意大利蜜蜂和/或卡尼鄂拉蜂。5.擴增arf1基因的引物組在制備西方蜜蜂成年工蜂的不同發(fā)育時期差異基因篩選或鑒定產(chǎn)品或制備西方蜜蜂成年工蜂不同組織的實時熒光定量pcr檢測試劑或試劑盒中的應用，所述西方蜜蜂為意大利蜜蜂和/或卡尼鄂拉蜂。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于，西方蜜蜂成年工蜂的不同發(fā)育時期差異基因篩選或鑒定通過檢測不同發(fā)育時期的西方蜜蜂成年工蜂的咽下腺、觸角和/或腦實現(xiàn)。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于，不同發(fā)育時期的西方蜜蜂成年工蜂指新出房蜂、哺育蜂和/或采集蜂。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的應用，其特征在于，arf1的核苷酸序列如seq?id?no.21所示。9.根據(jù)權(quán)利要求3-7任一項所述的應用，其特征在于，所述引物組包括：正向引物：5’-ctgtatgggacgtaggtgg-3’和反向引物：5’-cattcattgcatttgggag-3’。技術(shù)總結(jié)本發(fā)明涉及分子生物學
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體公開了ARF1作為內(nèi)參基因在西方蜜蜂實時熒光定量PCR檢測中的應用。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，ARF1可作為內(nèi)參基因在西方蜜蜂特定兩個亞種成年工蜂不同組織和發(fā)育階段的實時熒光定量PCR檢測中進行有效應用，提高了檢測結(jié)果的可信度以及基因表達分析研究的穩(wěn)定性、可靠性和重復性，應用廣泛，為西方蜜蜂差異基因的表達研究奠定了重要基礎(chǔ)。技術(shù)研發(fā)人員：馬川,劉軒鵬,李繼蓮受保護的技術(shù)使用者：中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所技術(shù)研發(fā)日：技術(shù)公布日：2025/5/15