本發(fā)明涉及體外分子生物學(xué)診斷試劑領(lǐng)域，尤其涉及前列腺癌特異性甲基化標(biāo)志物的應(yīng)用和檢測試劑。

背景技術(shù)：

1、前列腺癌(prostate?cancer,pca)是泌尿男性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。目前，前列腺癌的確診流程是直腸指診，血清psa檢測，然后是影像學(xué)檢查和前列腺穿刺活檢。血清psa檢測目前是前列腺癌的常規(guī)檢測，但特異度和敏感度不高；前列腺穿刺活檢是目前的金標(biāo)準(zhǔn)，主要局限在于有創(chuàng)性、假陰性、漏診高危前列腺癌和過度診斷。

2、dna甲基化屬于表觀遺傳學(xué)的范疇，可以在不改變堿基序列的情況下，調(diào)控基因的表達(dá)。研究表明,dna甲基化的改變是可以用于前列腺癌的診斷，包括gstp1、apc、rassf1、ar、nep等基因的甲基化都被研究報道與前列腺癌的發(fā)生有關(guān)。目前，國內(nèi)外用于前列腺癌無創(chuàng)檢測的產(chǎn)品較少，且大部分基于ngs檢測平臺，該類技術(shù)不適用于普通醫(yī)院檢驗(yàn)科室，且檢驗(yàn)流程復(fù)雜，成本高，報告周期較長。基于pcr技術(shù)平臺進(jìn)行甲基化檢測的研究和產(chǎn)品陸續(xù)出現(xiàn)，但由于前列腺液是從前列腺腺泡中被擠壓出來，進(jìn)入射精管，然后再排入尿道，因此往往需要進(jìn)行前列腺撫觸促進(jìn)其分泌，然后采集尿液樣本進(jìn)行檢測，從而降低了臨床依從性。是否能夠通過提高檢測技術(shù)的靈敏度，有效解決前列腺檢測前需進(jìn)行前列腺撫觸的問題是關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)。

3、此外，評估基因甲基化對疾病的影響時，選擇合適的分析單位是非常重要的。差異甲基化分析可以分為不同的層次，包括dmp(差異化cpg位點(diǎn))、dmr(差異化cpg區(qū)域)以及dmb(更大范圍的差異化region區(qū)域)。dmp代表找出單個的差異甲基化cpg位點(diǎn)，而dmr則是指一個連續(xù)的比較長的差異片段?？茖W(xué)家們認(rèn)為，這樣的連續(xù)差異片段對基因的影響更為明顯，能夠提高計(jì)算生物學(xué)的精度。因此，通過dmr進(jìn)行的分析能夠更準(zhǔn)確地反映基因甲基化狀態(tài)動態(tài)變化，以及這些變化如何與基因表達(dá)和疾病風(fēng)險相關(guān)聯(lián)。因此，使用dmr進(jìn)行基因甲基化分析在評估疾病風(fēng)險和疾病機(jī)制的研究中具有更高的價值和實(shí)用性。

4、因此，開發(fā)無需前列腺撫觸、直接采集尿液進(jìn)行多基因甲基化水平檢測的方法，用于臨床前列腺癌輔助診斷是非常必要的。

5、cn111154876b公布了用于檢測人add3和cdh23基因甲基化的引物探針組合物、試劑盒及檢測方法，該專利實(shí)施例樣本僅限于少量陰、陽性質(zhì)控品或陰、陽性樣本的測試，未進(jìn)行臨床樣本的測試，無法確定其臨床輔助診斷用途下的靈敏度及特異性等性能。且該發(fā)明生物檢材樣本為人前列腺按摩后的初段尿液中的細(xì)胞，初段尿液約40～50ml。無法有效解決臨床依從性問題。

6、cn116287227a公布了一種用于診斷前列腺癌的試劑和試劑盒。該試劑采用血液或尿液為樣本，通過檢測chst11-r3、aox1-r2、prkcb-r2和c2orf88-r1目標(biāo)區(qū)域的甲基化水平進(jìn)行聯(lián)合診斷，實(shí)現(xiàn)非侵入式檢測前列腺癌。該專利雖使用了較多臨床前列腺癌樣本和健康人樣本進(jìn)行測試，獲得較好的檢測靈敏度和特異性，但它未納入臨床前列腺增生樣本、尿路系統(tǒng)其他癌種如膀胱癌等樣本進(jìn)行特異性測試。臨床研究發(fā)現(xiàn)前列腺增生同樣會導(dǎo)致psa異常升高，導(dǎo)致大量假陽性，因此亟待發(fā)現(xiàn)新的篩查標(biāo)志物，能夠減少假陽性的發(fā)生。在我們的研究過程中發(fā)現(xiàn)前列腺增生及尿路系統(tǒng)其他癌種的甲基化會對前列腺癌的檢測產(chǎn)生較大干擾，尋找能夠區(qū)分前列腺癌與健康人的靶標(biāo)不難，但尋找到能夠很好的區(qū)分前列腺癌和前列腺增生或尿路系統(tǒng)其他癌種的標(biāo)志物卻很不容易，同時也是臨床真正迫切需要解決的問題。

7、cn117925845a公布了通過檢測特定的甲基化分子標(biāo)志物rarb基因的特定區(qū)域，可以實(shí)現(xiàn)高靈敏度的前列腺癌診斷，無需直腸按摩，直接取尿液樣本即可進(jìn)行檢測。但它仍然存在局限性：1、該方案針對rarb基因甲基化進(jìn)行檢測，單個基因甲基化檢測用于癌癥的早期篩查能夠?qū)崿F(xiàn)的檢測靈敏度和特異性是有限的；2、該方案采用rarb基因的5個片段中≥2個片段作為陽性結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，雖然在一定程度上能夠彌補(bǔ)某些樣本因其中一個或幾個cpg位點(diǎn)低甲基化而丟失檢測信號的問題，從而提高檢測靈敏度，但從我們既往的研究經(jīng)驗(yàn)來看，同一基因dmr區(qū)域的甲基化程度是存在一定連鎖關(guān)聯(lián)性，大部分樣本會在該區(qū)域內(nèi)的cpg位點(diǎn)同時都呈現(xiàn)高度甲基化情況，對于這部分樣本，當(dāng)沒有進(jìn)行前列腺撫觸的尿液中來自前列腺的細(xì)胞量極低的情況下，該專利方案等同常規(guī)的qpcr檢測方案仍無法有效提高檢測靈敏度，理論上應(yīng)該很難實(shí)現(xiàn)無前列腺撫觸的尿液的前列腺癌檢測。

8、本發(fā)明主要通過以下四個方面實(shí)現(xiàn)無需前列腺撫觸、直接采集尿液進(jìn)行多基因甲基化水平檢測用于前列腺癌的輔助診斷。(1)通過特殊的尿液保存及核酸富集方式，有效富集前列腺來源細(xì)胞核酸物質(zhì)；(2)通過medip高通量測序篩選全基因組前列腺組織特異性的差異化甲基化區(qū)域(dmrs)，與tcga和geo數(shù)據(jù)庫挖掘的前列腺癌甲基化數(shù)據(jù)取交集，針對交集dmrs區(qū)域進(jìn)行靶基因甲基化高通量測序(target?bisulfite?sequencing，target-bs)獲得組織和尿液一致性前列腺癌特異性甲基化檢測靶標(biāo)位點(diǎn)，(3)優(yōu)化引物探針序列覆蓋的cpg位點(diǎn)個數(shù)和位置，優(yōu)化引物探針的濃度，優(yōu)化反應(yīng)程序等方式，獲得高靈敏度和高特異性的多重pcr熒光檢測系統(tǒng)，以此實(shí)現(xiàn)對多個基因的dmr區(qū)域檢測，累積各dmr區(qū)域的多位點(diǎn)甲基化信號，提高檢測靈敏度；(4)針對訓(xùn)練集樣本檢測多個dmr區(qū)域多甲基化位點(diǎn)的甲基化水平，回歸統(tǒng)計(jì)分析確定各個基因的權(quán)重系數(shù)，建立相應(yīng)的加權(quán)評分模型，并在驗(yàn)證集樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，有效提高檢測的特異性和準(zhǔn)確度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)無需前列腺撫觸采尿情況下低頻前列腺靶標(biāo)核酸的檢出。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供檢測前列腺癌特異性甲基化標(biāo)志物的制劑在制備前列腺癌檢測試劑中的應(yīng)用及檢測試劑。通過大量臨床樣本驗(yàn)證評價了該方法的檢測性能。

2、本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、前列腺癌特異性甲基化標(biāo)志物的應(yīng)用，檢測前列腺癌特異性甲基化標(biāo)志物的制劑在制備前列腺癌檢測試劑中的應(yīng)用；所述的前列腺癌特異性甲基化標(biāo)志物的差異甲基化目標(biāo)區(qū)域以grch37.p13為參考，包含以下3個區(qū)域：chr10:111767101-111767300的正鏈的部分區(qū)域或全長；chr11:54965801-54966100的正鏈的部分區(qū)域或全長；chr16:88717311-88717610的正鏈的部分區(qū)域或全長；每個區(qū)域所覆蓋的cpg位點(diǎn)均不少于8個。

4、進(jìn)一步地，差異甲基化位點(diǎn)包括：

5、add3_chr10:111767228

6、add3_chr10:111767249

7、add3_chr10:111767345

8、add3_chr10:111767350

9、add3_chr10:111767479

10、add3_chr10:111767481

11、add3_chr10:111767493

12、add3_chr10:111767530

13、gsx2_chr11:54965883

14、gsx2_chr11:54966019

15、gsx2_chr11:54966058

16、cyba_chr16:88717489

17、cyba_chr16:88717571

18、cyba_chr16:88717602。

19、所述的檢測試劑包括依據(jù)差異甲基化位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物和探針，序列如下：

20、(1)

21、

22、2條f引物和2條r引物能交叉搭配與p探針使用，擴(kuò)增靶標(biāo)序列均覆蓋了cpg位點(diǎn)cyba_chr16:88717571；

23、(2)

24、

25、2條f引物和2條r引物能交叉搭配與p探針使用，擴(kuò)增靶標(biāo)序列均覆蓋了cpg位點(diǎn)cyba_chr16:88717489；

26、(3)

27、

28、2條f引物和2條r引物能交叉搭配與p探針使用，擴(kuò)增靶標(biāo)序列均覆蓋了cpg位點(diǎn)cyba_chr16:88717602；

29、(4)

30、

31、2條f引物和2條r引物能交叉搭配與p探針使用，擴(kuò)增靶標(biāo)序列均覆蓋了cpg位點(diǎn)add3_chr10:111767228；

32、(5)

33、

34、

35、3條f引物任選一條均能搭配r引物和p探針使用，擴(kuò)增靶標(biāo)序列均覆蓋了cpg位點(diǎn)add3_chr10:111767249；

36、(6)

37、

38、2條f引物和2條r引物能交叉搭配與p探針使用，擴(kuò)增靶標(biāo)序列均覆蓋了cpg位點(diǎn)add3_chr10:111767345和add3_chr10:111767350；

39、(7)

40、

41、2條f引物和2條r引物能交叉搭配與p探針使用，擴(kuò)增靶標(biāo)序列均覆蓋了cpg位點(diǎn)add3_chr10:111767479,add3_chr10:111767481,add3_chr10:111767493和add3_chr10:111767530；

42、(8)

43、

44、3條f引物和2條r引物能交叉搭配與p探針使用，擴(kuò)增靶標(biāo)序列均覆蓋了cpg位點(diǎn)gsx2_chr11:54965883；

45、(9)

46、

47、2條f引物和2條r引物能交叉搭配與p探針使用，擴(kuò)增靶標(biāo)序列均覆蓋了cpg位點(diǎn)gsx2_chr11:54966019和gsx2_chr11:54966058。

48、上述的應(yīng)用，還包括內(nèi)參基因引物探針，序列如下：

49、mactb-f???????????ggtgtttaagatagtgttgtgg

50、mactb-r???????????ctacttaatacacactccaaaacc

51、mactb-p???????????ctttacaccaacctcataaccttatc。

52、進(jìn)一步地，所述的應(yīng)用，

53、

54、更進(jìn)一步地，

55、單基因檢測診斷分析：

56、

57、

58、用于雙基因或多基因聯(lián)合診斷分析的各個組合概率(p)的公式如下：

59、

60、檢測試劑中還包括尿液保存液，

61、配方如下：4m異硫氰酸胍，50mm?edta，200mm?tcep，20％peg，500mm磺基水楊酸，20％異丙醇，10％?tween?20，ph4.5的0.1m檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

62、本發(fā)明還提供了前列腺癌特異性甲基化檢測試劑，包括：根據(jù)所述的前列腺癌特異性甲基化標(biāo)志物的差異甲基化目標(biāo)區(qū)域或者具體的差異化位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物、探針。

63、本發(fā)明研發(fā)思路如下：

64、1.選擇cancer組(前列腺癌組織樣本)和control組(前列腺增生組織、膀胱癌組織樣本)，采用medip(methylated?dna?immunoprecipitation,甲基化dna免疫共沉淀技術(shù))獲得前列腺癌特異性差異甲基化區(qū)域，同步在tcga數(shù)據(jù)庫挖掘差異甲基化基因，將兩者取交集，獲得組織樣本差異甲基化基因集panel。

65、2.針對所獲得的組織樣本差異甲基化基因集panel，選擇cancer組(前列腺癌尿液樣本)和control組(前列腺增生尿液、膀胱癌尿液、正常人尿液樣本)，運(yùn)用靶基因甲基化高通量測序(target?bisulfite?sequencing，target-bs)技術(shù)，即針對已有目標(biāo)基因panel組合，運(yùn)用甲基化捕獲測序技術(shù)，對亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的目標(biāo)基因進(jìn)行探針捕獲，然后進(jìn)行超高深度(1000x以上)甲基化精準(zhǔn)檢測，獲得尿液樣本的差異甲基化區(qū)域及位點(diǎn)。

66、所獲得的差異甲基化目標(biāo)區(qū)域以grch37.p13為參考，為以下區(qū)域：chr10:111767101-111767300(人add3基因上的部分區(qū)域)的部分區(qū)域或全長；chr11:54965801-54966100(人gsx2基因上的部分區(qū)域)的部分區(qū)域或全長；chr16:88717311-88717610(人cyba基因啟動子上的部分區(qū)域)的部分區(qū)域或全長。

67、針對所述add3、gsx2、cyba等3個基因區(qū)域的dna甲基化位點(diǎn)設(shè)計(jì)多對引物探針，并進(jìn)行測試，優(yōu)選最佳引物探針組合物搭配測試優(yōu)選的pcr反應(yīng)液組成qpcr檢測體系。

68、上述檢測體系采用120例臨床來源的尿液樣本(其中30例前列腺癌尿液樣本，60例前列腺增生尿液樣本，10例膀胱癌尿液樣本，20例正常人尿液樣本)作為訓(xùn)練集樣本，通過優(yōu)選的add3、gsx2、cyba基因的甲基化特異性qpcr檢測體系，分別檢測上述樣本中這3個基因的甲基化情況，計(jì)算靶標(biāo)與內(nèi)標(biāo)的ct值差值(δct＝ct靶標(biāo)-ct內(nèi)參)。

69、以臨床診斷金標(biāo)準(zhǔn)(病理檢測結(jié)果)為金標(biāo)準(zhǔn)，對于單基因診斷分析，采用roc曲線法確定每個基因δct值的陽性判斷值；對于雙基因或多基因聯(lián)合診斷分析，則采用邏輯回歸分析模型進(jìn)行訓(xùn)練和測試，得到效用最好的模型參數(shù)，建立各個基因的評分，然后根據(jù)約登指數(shù)數(shù)(靈敏度+特異性-1)最大的原則確定最佳閾值，獲得不同基因組合下的陽性判斷值。通過比較單基因和多基因組合分析檢測性能，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)3個基因聯(lián)合診斷時性能最佳。即使用3個基因聯(lián)合診斷時，auc曲線下面積最大，準(zhǔn)確度最高。

70、至此，我們獲得了尿液前列腺癌甲基化qpcr檢測最佳靶標(biāo)組合，該檢測試劑用于檢測前列腺癌時特異性好且靈敏度高，且為非侵入方式。

71、本發(fā)明有益效果：

72、1.本發(fā)明采用尿液作為樣本進(jìn)行檢測，提供了一種無需前列腺撫觸采尿、真正無創(chuàng)的方式用于前列腺癌的早期診斷。

73、2.前列腺液入尿不同于膀胱脫落細(xì)胞，其可能不僅僅以脫落細(xì)胞的形式入尿，也可能是游離核酸的方式入尿。本發(fā)明使用的尿液保存液能夠在常溫下15天同時保存完整基因組核酸和游離核酸，有效避免了市面上常見的通過離心富集脫落細(xì)胞的采樣形式對游離核酸造成漏檢的情況。該保存液能夠在常溫下保存運(yùn)輸，臨床適用性高。

74、3.本發(fā)明的甲基化標(biāo)志物及其檢測方式的組合具有創(chuàng)新性，能夠顯著提高非撫觸尿液的檢測靈敏度。經(jīng)過大量臨床樣本的驗(yàn)證，其靈敏度和特異性能夠滿足臨床前列腺癌輔助診斷的需求。該甲基化標(biāo)志物組合能夠很好的區(qū)分前列腺癌和前列腺增生或尿路系統(tǒng)其他癌種，能夠有助于解決臨床psa檢測在前列腺癌篩查中的假陽性問題。為臨床為臨床醫(yī)生對前列腺癌早期診斷及鑒別診斷提供重要參考。