本發(fā)明涉及柑橘植物，具體涉及一種柑橘葉片油胞的分離劑及使用方法。

背景技術(shù)：

1、植物分泌腔是合成與儲存各種重要次生代謝物的特殊內(nèi)分泌結(jié)構(gòu)。在柑橘類植物中，通常將分泌腔表述為“油胞”。油胞主要發(fā)生于果皮、葉、花和枝刺等部位。油胞內(nèi)，多種次生代謝物以精油的形式積累，其中以揮發(fā)性萜類成分為主，另含有少量的甾醇、蠟、香豆素等非揮發(fā)性化合物。這些代謝成分不僅對作物本身驅(qū)避害蟲、抑制病原體等生物防御過程有重要作用，同時(shí)從中提煉的精油在食品、醫(yī)藥、香水等領(lǐng)域也有廣泛用途。早期對于油胞發(fā)生發(fā)育、代謝物質(zhì)檢測及相關(guān)分子合成的研究，大部分以所在的油胞層組織為實(shí)驗(yàn)材料開展。

2、然而，將所在的整體組織部位等同于要研究的單個(gè)對象開展實(shí)驗(yàn)，無法避免地導(dǎo)致油胞存在復(fù)雜的組織背景，難以確定關(guān)鍵信息。因此，油胞要脫離復(fù)雜組織背景并作為單一對象應(yīng)用到多組學(xué)研究中，有效從鑲嵌組織部位中分離是第一要?jiǎng)?wù)。

3、目前大多數(shù)方法以分離植物體外部特化的腺毛結(jié)構(gòu)為主。腺毛與分泌腔的發(fā)育方式、形態(tài)各異，現(xiàn)有的分離方法也難以借鑒。涉及到相同類型結(jié)構(gòu)的分離方法僅有少數(shù)文章報(bào)道。例如在萬壽菊中，以酶液真空滲透并不斷超聲、震蕩循環(huán)，獲得去除無周圍葉肉組織的分泌腔，但該方法在分離過程中結(jié)構(gòu)完整性受到損害，導(dǎo)致腔內(nèi)容物損失83％至96％。其次是對針葉樹樹脂導(dǎo)管中的單萜和二萜樹脂酸的分離(統(tǒng)稱為油樹脂)，但這項(xiàng)工作主要得益于使用激光顯微切割將管道復(fù)合體與周圍組織分離。最后則是利用酶液將桉樹皮下分泌腔與所有周圍的葉肉組織隔離，該方法可維持結(jié)構(gòu)完整性和保證腔內(nèi)的內(nèi)容物。

4、柑橘作為揮發(fā)性物質(zhì)成分豐富和精油產(chǎn)出含量更高的經(jīng)濟(jì)作物，更需要構(gòu)建油胞分離的技術(shù)體系，進(jìn)而更好地應(yīng)用到系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)中(例如代謝組和轉(zhuǎn)錄組學(xué))，為柑橘風(fēng)味品質(zhì)改良及柑橘精油高效開發(fā)提供重要技術(shù)支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷和不足，本發(fā)明一種柑橘葉片油胞的分離劑及使用方法，所采用的分離劑可以有效地從柑橘葉片中分離并獲得完整的油胞。該分離劑及其使用方法簡便，成本低，分離出的油胞結(jié)構(gòu)完整、內(nèi)含成分活性和純凈度高，可直接用于油胞的進(jìn)一步研究。

2、為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用果膠酶溶液和緩沖液作為分離劑的主要成分，其具體的技術(shù)方案是：

3、一種柑橘葉片油胞的分離劑，所述分離劑為果膠酶溶液和緩沖液的混合溶液，所述緩沖液包含山梨糖醇、koh和cacl2。

4、進(jìn)一步的，混合溶液中果膠酶濃度為100-300u/ml。

5、進(jìn)一步的，所述緩沖液中山梨糖醇溶液的濃度為0.5-1.0mol/l、koh溶液的濃度為4-6mmol/l，cacl2溶液的濃度為0.5-1.5mmol/l，緩沖液的ph值為5.0-6.0。

6、進(jìn)一步的，果膠酶溶液和緩沖液的體積比為(0.5-1.5)：10。

7、本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述分離劑進(jìn)行柑橘葉片油胞分離的方法，該方法包括：

8、(1)以柑橘新鮮半成熟葉片為材料，避開粗大葉脈，將柑橘葉片裁剪成長條狀；

9、(2)將剪好的葉片放入配置好的分離劑中，放入搖床振蕩11～16小時(shí)不等；

10、(3)當(dāng)葉片由綠轉(zhuǎn)為褐綠色后，置于純水中剝離葉片上下表皮，并在解剖顯微鏡下用細(xì)針將油胞從葉肉組織中分離；

11、(4)分離油胞沉于液面底部，采用移液槍進(jìn)行收集。

12、進(jìn)一步的，步驟(1)中，裁剪后的葉片尺寸長度為4-6mm，寬度為2-3mm，呈長條狀。

13、進(jìn)一步的，步驟(2)中將分離劑在25-30℃的溫度下進(jìn)行搖床振蕩。

14、相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下：

15、(1)本發(fā)明的分離劑及其使用方法可分離出完整且干凈的柑橘葉片油胞，為其他植物葉片內(nèi)嵌型分泌結(jié)構(gòu)的分離收集提供了借鑒的思路。

16、(2)采用本發(fā)明的分離劑和使用方法分離的葉片油胞經(jīng)冷臺電鏡觀察可以看出，油胞顯微結(jié)構(gòu)完整。以分離油胞附著的葉綠素程度作為油胞是否污染的標(biāo)準(zhǔn)，可以看出油胞所含葉綠素濃度極低，表明使用本方法分離獲得的油胞純凈度高。對分離的油胞進(jìn)行組織化學(xué)驗(yàn)證，經(jīng)尼羅藍(lán)、尼羅紅和油紅o染液染色結(jié)果表明，油胞內(nèi)含豐富油性成分活性，表明該方法獲得的油胞保持了良好的生物活性，進(jìn)一步加強(qiáng)了可應(yīng)用于多組學(xué)研究的可行性。

17、(3)本發(fā)明的分離劑及其使用方法適用于大多數(shù)柑橘品種油胞的分離，可為探究不同柑橘種質(zhì)油胞內(nèi)部的柑橘揮發(fā)性物質(zhì)積累差異提供寶貴的材料基礎(chǔ)，同時(shí)也對柑橘精油開發(fā)及產(chǎn)值提升具有重要指導(dǎo)意義。

技術(shù)特征：

1.一種柑橘葉片油胞的分離劑，其特征在于，所述分離劑為果膠酶溶液和緩沖液的混合溶液，所述緩沖液包含山梨糖醇、koh和cacl2。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種柑橘葉片油胞的分離劑，其特征在于，混合溶液中果膠酶濃度為100-300u/ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的一種柑橘葉片油胞的分離劑，其特征在于，所述緩沖液中山梨糖醇溶液的濃度為0.5-1.0mol/l、koh溶液的濃度為4-6mmol/l，cacl2溶液的濃度為0.5-1.5mmol/l，緩沖液的ph值為5.0-6.0。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的一種柑橘葉片油胞的分離劑，其特征在于，所述果膠酶溶液和緩沖液的體積比為(0.5-1.5)：10。

5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的一種柑橘葉片油胞的分離劑的使用方法，其特征在于，包含以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種柑橘葉片油胞的分離劑的使用方法，其特征在于，所述步驟(1)中，裁剪后的葉片尺寸長度為4-6mm，寬度為2-3mm，呈長條狀。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種柑橘葉片油胞的分離劑的使用方法，其特征在于，所述步驟(2)中將分離劑在25-30℃的溫度下進(jìn)行搖床振蕩。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種柑橘葉片油胞的分離劑及其使用方法。本發(fā)明采用果膠酶溶液和緩沖溶液配置獲得分離劑，所述緩沖溶液包含山梨糖醇、KOH和CaCl<subgt;2</subgt;。將柑橘葉片進(jìn)行修剪放入分離劑后，經(jīng)過酶解作用可有效酶解柑橘葉片的葉肉組織，便于剝離上下表皮，方便后續(xù)在清水中對酶解后的葉片進(jìn)行油胞分離，從而分離出完整的柑橘葉片油胞，為后續(xù)柑橘葉片油胞的研究提供了基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：葉俊麗,蔡天奧,鄧秀新,朱甚超,柴利軍,張飛,謝宗周
受保護(hù)的技術(shù)使用者：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15