本申請屬于微生物及生物醫(yī)學(xué)，具體涉及一種雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌、其應(yīng)用及檢測其的分子標(biāo)記。

背景技術(shù)：

1、惡性腫瘤是威脅我國乃至全世界人民健康的重要疾病。惡性腫瘤中超90％都是實體瘤，實體瘤是指起源于實體器官的腫瘤，包括常見的肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌等。

2、實體瘤的生長離不開氧氣。然而，腫瘤組織的快速生長會引起腫瘤部分區(qū)域供血不足，從而形成乏氧區(qū)域。為滿足腫瘤組織的生長，腫瘤微環(huán)境的細胞會分泌促血管生成因子并且降低血管生成抑制因子的釋放，從而促進腫瘤中血管生成。但這些血管屬于病理性新生血管，其血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能都存在缺陷，常出現(xiàn)斷裂，堵塞以及過度的分支，這些異常的血管網(wǎng)絡(luò)也是腫瘤內(nèi)出現(xiàn)乏氧區(qū)域的一個重要原因。缺氧是實體瘤內(nèi)部環(huán)境的重要特征。傳統(tǒng)抗癌藥物無法經(jīng)血管到達腫瘤深部乏氧或壞死區(qū)域，導(dǎo)致藥物響應(yīng)性差，這是腫瘤易復(fù)發(fā)的主要原因之一。

3、近年來，隨著細菌療法的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)氧氣濃度可作為細菌感知腫瘤微環(huán)境的重要信號。其中兼性或厭氧細菌表現(xiàn)出較高的腫瘤定植能力，是天然的腫瘤靶向載體，具體表現(xiàn)為：厭氧細菌只能在低氧分壓的條件下生長，實體腫瘤中存在的血管流通受阻和組織乏氧區(qū)有益于厭氧菌定植和生長。此外，腫瘤內(nèi)的低氧微環(huán)境會引起免疫系統(tǒng)的局部缺失，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)在腫瘤中清除細菌的能力大大降低；腫瘤深部壞死區(qū)凋亡的細胞碎片則為厭氧細菌增殖提供大量豐富原料。上述原理是運用厭氧菌治療腫瘤提供了的理論和實踐依據(jù)。

4、該類細菌被稱為溶瘤細菌，可富集到腫瘤缺氧、壞死區(qū)域，進行特異性定植和增殖，從而搶占腫瘤細胞的生存環(huán)境及養(yǎng)料，抑制腫瘤細胞增長；細菌溶解腫瘤組織，可釋放腫瘤抗原，激活機體自身抗腫瘤免疫，協(xié)同化療藥物殺傷腫瘤細胞。適宜氧氣需求對溶瘤細菌的研發(fā)較為重要，由于腫瘤組織非絕對厭氧區(qū)域，是低氧濃度區(qū)域(乏氧)區(qū)域。因此絕對厭氧的細菌或好氧細菌在腫瘤低氧區(qū)域很難存活。溶瘤細菌的研發(fā)需要細菌在低氧濃度區(qū)域生長，發(fā)揮破壞、溶解腫瘤組織效應(yīng)；另外，細菌不能在氧氣高濃度區(qū)域生長，避免在其他正常氧含量組織(心、肝、脾、肺、腎等)生長，破壞正常組織，確保其安全性。

5、溶瘤細菌研發(fā)首先需要滿足安全性，例如：clostridium?novyi和clostridiumbutyricum能夠在腫瘤的缺氧環(huán)境中存活，發(fā)揮腫瘤組織溶解作用，但上述菌株會表達較高活性毒素，引發(fā)呼吸困難、肌肉癱瘓，甚至危及生命。為解決這一問題，研究通過去除引發(fā)毒性的梭菌主要毒素(毒素a)，發(fā)明制備了clostridium?novyi減毒菌株，被命名為clostridium?novyi-nt。然而，針對clostridium?novyi-nt一期臨床實驗數(shù)據(jù)表明：單次腫瘤內(nèi)注射c.novyi-nt可發(fā)揮腫瘤組織溶解作用，但出現(xiàn)4級膿毒癥，4級氣性壞疽以及呼吸功能不全等嚴(yán)重程度較高且明顯的毒性反應(yīng)。雖然毒副反應(yīng)可控，但是給病人造成大量生理和經(jīng)濟負擔(dān)。因此，提供一種溶瘤細菌，安全，有效，成為了本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一在于，提供了一種雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌paraclostridiumbifermentans?s1-gt1，能夠解決目前溶瘤細菌治療實體腫瘤毒副反應(yīng)大、安全性低的技術(shù)問題。

2、本發(fā)明的目的之二在于，提供了該雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌paraclostridiumbifermentans?s1-gt1的應(yīng)用。

3、本發(fā)明的目之三在于，提供檢測該雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌paraclostridiumbifermentans?s1-gt1的分子標(biāo)記。

4、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

5、第一方面，本發(fā)明提供了一種雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌paraclostridiumbifermentans?s1-gt1，于2024年5月27日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號為gdmcc?no:64683，保藏地址為：廣東省廣州市越秀區(qū)先烈中路100號大院實驗大樓5樓。

6、所述雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌paraclostridium?bifermentans?s1-gt1的16srdna全序列如seq?id?no.1所示。

7、所述雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌paraclostridium?bifermentans?s1-gt1呈白色不透明狀圓形菌落，中間凸起、表面光滑濕潤。

8、第二方面，本發(fā)明還提供了一種上述的雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌paraclostridiumbifermentans?s1-gt1在制備治療實體瘤的藥物中的應(yīng)用。

9、第三方面，本發(fā)明還提供了一種用于治療實體瘤的菌劑，包括上述的雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌paraclostridium?bifermentans?s1-gt1和其他藥學(xué)上可接受的佐劑。

10、在一些實施例中，所述其他藥學(xué)上可接受的佐劑包括白細胞介素-12、pd-1抑制劑、陽離子脂質(zhì)體、生理鹽水、葡萄糖溶液。

11、第四方面，本發(fā)明還提供了一種用于鑒定上述的雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌paraclostridium?bifermentans?s1-gt1的分子標(biāo)記，其所述分子標(biāo)記為cibif基因，所述cibif基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

12、在一些實施例中，用于擴增所述cibif基因的引物包括clbif-f和clbif-r；所述clbif-f的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，所述clbif-r的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

13、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

14、本發(fā)明中提供的雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌不具有毒力因子，基因組層面安全；直接小鼠腹腔或尾靜脈注射菌株活菌體或芽孢，不會引發(fā)動物死亡，具備良好的安全性；該菌株具有優(yōu)越的產(chǎn)芽孢能力；本發(fā)明所述芽孢具有專性厭氧的特點，能在腫瘤乏氧區(qū)萌發(fā)、定植、生長，引起實體瘤組織溶瘤壞死，在治療實體瘤領(lǐng)域具有巨大的發(fā)展前景和應(yīng)用潛力。

技術(shù)特征：

1.一種雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌(paraclostridium?bifermentans)，其特征在于，于2024年5月27日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號為gdmcc?no:64683。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌(paraclostridium?bifermentans)，其特征在于，其16s?rdna全序列如seq?id?no.1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌(paraclostridiumbifermentans)，其特征在于，所述雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌呈白色不透明狀圓形菌落，中間凸起、表面光滑濕潤。

4.一種如權(quán)利要求1～3任意一項所述的雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌(paraclostridiumbifermentans)的應(yīng)用，其特征在于，在制備治療實體瘤的藥物中的應(yīng)用。

5.一種用于治療實體瘤的菌劑，其特征在于，包括如權(quán)利要求1～3任意一項所述的雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌(paraclostridium?bifermentans)和其他藥學(xué)上可接受的佐劑。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的菌劑，其特征在于，所述其他藥學(xué)上可接受的佐劑包括白細胞介素-12、pd-1抑制劑、陽離子脂質(zhì)體、生理鹽水、葡萄糖溶液。

7.一種用于鑒定如權(quán)利要求1～3任意一項所述的雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌(paraclostridium?bifermentans)的分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記為cibif基因，所述cibif基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分子標(biāo)記，其特征在于，用于擴增所述cibif基因的引物包括clbif-f和clbif-r；所述clbif-f的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，所述clbif-r的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌、其應(yīng)用及檢測其的分子標(biāo)記，屬于微生物及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開的雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌Paraclostridium?bifermentans?S1?GT1，于2024年5月27日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號為GDMCC?NO:64683。本發(fā)明還公開了S1?GT1菌株在制備治療實體瘤的藥物中的應(yīng)用，以及用于鑒定該S1?GT1菌株的分子標(biāo)記。本發(fā)明的雙發(fā)酵副梭狀芽孢桿菌S1?GT1具備良好的安全性，優(yōu)越的產(chǎn)芽孢能力，能抑制一種或多種實體瘤的生長、逆轉(zhuǎn)或破壞一種或多種實體瘤。

技術(shù)研發(fā)人員：陽泰,代正群,趙熠,張迪,楊倩,張先翠,周媛媛,黃勝,米佳佳,劉進,郭慧杰,鄭洪宇,李瑞,付熹芮
受保護的技術(shù)使用者：成都醫(yī)學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15