本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，尤其涉及一種靶向肝臟血竇內(nèi)皮細(xì)胞的工程化外泌體、制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肝臟作為人體最大的實質(zhì)器官，在代謝和轉(zhuǎn)化攝入的外源性物質(zhì)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在新藥研發(fā)和臨床實踐的過程中，藥物的肝毒性仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。然而，藥物性肝損傷(drug-inducedliverinjury，dili)的機制復(fù)雜，缺乏有效的治療策略。

2、在臨床實踐工作中，aili(acetaminopheninducedliverinjury)是導(dǎo)致alf(acuteliverfailure)的主要原因之一，9％的患者患有apap誘導(dǎo)的alf，且預(yù)后不良，需要肝移植。apap是一種經(jīng)典的家庭藥物，每天有超過1000萬人使用它來治療牙痛、頭痛、關(guān)節(jié)炎、發(fā)燒和其他癥狀。如果攝入超過日推薦劑量(健康成人每天4克)，則極有可能導(dǎo)致aili。此外，治療劑量的apap也可能誘發(fā)肝病、酒精中毒或禁食患者發(fā)生aili。因此，為了及時發(fā)現(xiàn)aili并控制病情的發(fā)展，有必要了解其作用機制。(如圖1)當(dāng)人體攝入治療劑量的apap時，約85％-90％的apap被ii期偶聯(lián)酶代謝并隨尿液排出，其中約50％轉(zhuǎn)化為apap-glu，約30％通過硫酸轉(zhuǎn)移酶(sult)轉(zhuǎn)化為apap-sult。大約2％的apap以原型形式隨尿液排出。只有5％-9％的apap被細(xì)胞色素p450(cyp)酶代謝，主要是由cyp2e1轉(zhuǎn)化為n-乙?；?對苯醌亞胺(napqi)。napqi可快速結(jié)合谷胱甘肽(gsh)解毒，gsh在肝臟中含量豐富(約10mm)。結(jié)合物napqi-gsh首先排泄到膽汁中，降解后隨尿液排出。然而，當(dāng)apap過量時，會產(chǎn)生大量的napqi，耗盡細(xì)胞質(zhì)和線粒體中有限的谷胱甘肽儲存。過量的napqi會以巰基共價結(jié)合細(xì)胞蛋白，尤其是線粒體蛋白。細(xì)胞中大量的活性氧(ros)引發(fā)一系列的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激和功能障礙，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞的壞死。除了已知的氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙外，大量的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、微循環(huán)功能障礙、肝細(xì)胞再生和無菌炎癥反應(yīng)等過程也參與了aili的病理生理機制。aili的機制十分復(fù)雜，即使目前已有很多關(guān)于此方面的研究，但距離臨床應(yīng)用仍有很長的路要走，我們需要更多的研究來進一步闡明這些機制在aili中的確切作用，從而使臨床治療成為可能。

3、二甲基亞硝胺(dmn)是一種黃色的半揮發(fā)性油性液體，是工業(yè)生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)品或廢物，在煙草煙霧冷凝物和腌熏肉制品中也微量存在。亞硝胺類化合物對動物和人類的毒性已得到充分證實，由于其主要在肝臟中代謝，因此毒性主要累及肝臟，靜脈注射或口服少量dmn會導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷。在肝臟中，cyp2e1催化dmn在肝臟中的代謝過程中會產(chǎn)生甲醛和甲醇，這些化合物均具有肝毒性。除此之外，如圖2所示，dmn的代謝過程會產(chǎn)生活性中間體，這些中間體與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)以及核酸等形成甲基化大分子，反應(yīng)性代謝物可以作為親電子試劑與dna結(jié)合，形成的典型加合物是n7-甲基鳥嘌呤和o6-甲基鳥嘌呤。dmn及其反應(yīng)性代謝物會影響細(xì)胞的線粒體代謝，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧和抗氧化劑的失衡。dmn從肝小葉的中央靜脈擴散，導(dǎo)致小鼠肝臟cv區(qū)廣泛的出血壞死并引起大量的中性粒細(xì)胞浸潤。長期持續(xù)的dmn會引發(fā)小鼠肝臟的膽管反應(yīng)、肝小葉的橋接壞死以及肝臟的纖維化，最終可導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。由于誘導(dǎo)肝臟損傷的穩(wěn)健性，綜合上述dmn的代謝機制，dmn除了應(yīng)用于急性肝損傷動物模型的誘導(dǎo)外，還可以用于肝纖維化和肝癌動物模型的建立。

4、肝竇是一種組織良好的血管基質(zhì)，肝竇內(nèi)分布著多種非實質(zhì)細(xì)胞(npcs)，由肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(lsecs)、kupffer細(xì)胞(kcs)和星狀細(xì)胞(hscs)組成。其余的非實質(zhì)細(xì)胞由淋巴細(xì)胞和膽管細(xì)胞組成。盡管非實質(zhì)細(xì)胞在數(shù)量上并無優(yōu)勢，但其對于肝臟微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要。disse間隙充滿細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)成分，將npcs與肝細(xì)胞分開。因此，可以將肝臟微環(huán)境理解為是一個多維度的細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)，其中，不同類型細(xì)胞之間的分子信號協(xié)調(diào)傳遞，肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(lsec)、肝星狀細(xì)胞(hsc)和kupffer細(xì)胞(kc)能夠準(zhǔn)確地相互“交談”。

5、其中，數(shù)量最為豐富的是肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞(lsecs)。lsecs的獨特結(jié)構(gòu)和功能使其參與介導(dǎo)了多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展，dili也不例外。大量研究已經(jīng)證實，來源于lsecs的血管分泌因子，如wnt2和wnt9b，在急性肝損傷后的肝細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，表明lsecs作為潛在治療靶點的可能性。更重要的是，如圖3所示，wnt9b主要由中央靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ecs)表達(dá)，而wnt2則由中央靜脈ecs和lsecs更廣泛地表達(dá)。wnt2，作為分泌糖蛋白wnt家族的一員，對肝細(xì)胞增殖過程至關(guān)重要，這是肝臟損傷后再生所必需的。該通路通過wnt2配體與frizzled受體和lrp5/6共受體的結(jié)合而被激活，導(dǎo)致由axin、apc和gsk-3β組成的β-catenin蛋白降解復(fù)合物的抑制。這種抑制導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定和積累，隨后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中參與下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，如cyclin?d1、c-myc和survivin，這些基因?qū)?xì)胞周期進展和存活至關(guān)重要。wnt2信號的激活不僅能夠促進成熟肝細(xì)胞的增殖，還會刺激肝祖細(xì)胞的增殖和分化，從而有助于肝臟組織結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。

6、外泌體是具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的天然納米囊泡，來源于細(xì)胞。與人工合成的納米載體相比，外泌體具有更好的生物相容性和較低的毒性。更重要的是，外泌體的工程化進一步增強了其在疾病治療中的應(yīng)用。如圖4所示，通過對外泌體的膜進行工程化修飾并裝載治療性藥物，外泌體可以靶向特定細(xì)胞進行精確的藥物遞送。其中，將兩親性分子插入外泌體的脂質(zhì)雙層膜中提供了一種化學(xué)修飾策略，dmpe-peg2k是一種廣泛用于攜帶功能性配體以實現(xiàn)外泌體靶向修飾的兩親性分子。大量研究已經(jīng)證實，使用載脂蛋白apob100結(jié)構(gòu)中包含的rxr/rxxr序列的肽修飾的合成脂質(zhì)體或納米顆粒，其表面配體可以特異性地與lsec上表達(dá)的受體結(jié)合。這促進了外泌體被lsec攝取，從而有助于藥物的精確傳遞，并使干預(yù)由lsec介導(dǎo)的疾病成為可能。目前，基于外泌體的靶向lsec藥物遞送系統(tǒng)尚未被探索。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述問題，本技術(shù)提供了一種靶向肝臟血竇內(nèi)皮細(xì)胞的工程化外泌體、制備方法及應(yīng)用，采用新型“吃我/別吃我”的策略，結(jié)合雙重靶向效果，以抑制mps對外泌體的非特異性吞噬并提高lsec靶向效率。

2、第一方面，本發(fā)明提供了一種靶向肝臟血竇內(nèi)皮細(xì)胞的工程化外泌體的制備方法，包括以下步驟：

3、步驟1：利用過表達(dá)cd47的慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建cd47oe-bend.3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，分離其來源的外泌體exocd47；

4、步驟2：通過wnt2慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建cd47oe|wnt2oe-bend.3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，分離其來源的外泌體wnt2@exocd47；

5、步驟3：利用dmpe-peg2k-crltrkrglk對步驟2獲得的外泌體wnt2@exocd47膜表面進行修飾，得到rltr-wnt2@exocd47。

6、在該方面的部分優(yōu)選例中，步驟1中cd47oe-bend.3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建過程包括：

7、將cd47過表達(dá)慢病毒載體與bend.3細(xì)胞在37℃、5％co2的加濕培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)48小時；轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中的熒光表達(dá)情況，在確認(rèn)細(xì)胞中慢病毒的熒光強度后，將細(xì)胞接種到t25培養(yǎng)瓶中，用5ug/ml嘌呤霉素篩選72小時后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，制備得到cd47oe-bend.3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

8、在該方面的部分優(yōu)選例中，步驟2中cd47oe-bend.3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建過程包括：

9、將wnt2過表達(dá)慢病毒載體與cd47oe-bend.3細(xì)胞在37℃、5％co2的加濕培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)48小時；轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下對zsgreen和mcherry熒光雙陽性的細(xì)胞進行觀察，在確認(rèn)細(xì)胞的熒光強度后，將細(xì)胞接種到t25培養(yǎng)瓶中，同時添加5ug/ml嘌呤霉素和殺稻瘟菌素篩選72小時后，更換培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，制備得到cd47oe|wnt2oe-bend.3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

10、在該方面的部分優(yōu)選例中，步驟3中dmpe-peg2k-crltrkrglk的制備過程如下：

11、將100mg?dmpe-peg2k-mal溶解在5mln，n-二甲基甲酰胺中，然后向溶液中加入1.1eq肽crltrkrglk，并在室溫下孵育12小時后，將混合物裝入分子量為2000da的透析管中，在純化水中透析24小時后，收集透析液，使用冷凍干燥法獲得最終產(chǎn)物

12、dmpe-peg2k-crltrkrglk。

13、9、在該方面的部分優(yōu)選例中，利用外泌體wnt2@exocd47和dmpe-peg2k-crltrkrglk輕輕混合，在40℃的pbs緩沖液中孵育1小時后，通過離心兩次去除游離的dmpe-peg2k-crltrkrglk。通過納米流式細(xì)胞術(shù)分析rltr的外泌體膜修飾效率，并通過透射電子顯微鏡觀察rltr的膜修飾是否改變了外泌體的形態(tài)。

14、第二方面，本發(fā)明提供了一種靶向肝臟血竇內(nèi)皮細(xì)胞的工程化外泌體，利用一種靶向肝臟血竇內(nèi)皮細(xì)胞的工程化外泌體的制備方法制備得到。

15、第三方面，本發(fā)明提供一種靶向肝臟血竇內(nèi)皮細(xì)胞的工程化外泌體在制備急性藥物性肝損傷的藥物中的應(yīng)用。

16、在該方面的部分優(yōu)選例中，所述的急性藥物肝損傷為對乙酰氨基酚或二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的急性肝損傷。

17、第四方面，本發(fā)明提供一種靶向肝臟血竇內(nèi)皮細(xì)胞的工程化外泌體在制備靶向肝臟血竇內(nèi)皮細(xì)胞的藥物系統(tǒng)中的應(yīng)用。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

19、本發(fā)明利用cd47oe-bend.3衍生的cd47過表達(dá)外泌體，并通過wnt2慢病毒轉(zhuǎn)染將治療性核酸藥物(wnt2?mrna)裝載到外泌體中，最后用dmpe-peg2k-crltrkrglk(rltr)對外泌體進行rltr膜功能化，構(gòu)成rltr-wnt2@exocd47的藥物遞送系統(tǒng)。該工程化外泌體能夠增強肝臟血竇內(nèi)皮細(xì)胞靶向性，促進肝臟血竇內(nèi)皮細(xì)胞對外泌體的攝取效率，免受巨噬細(xì)胞的吞噬，且外泌體中的wnt2?mrna能夠有效遞送至受體細(xì)胞并發(fā)揮功能。

20、本發(fā)明制備的rltr-wnt2@exocd47為“eat?me/don't?eat?me”雙靶向系統(tǒng)，能夠有效促進外泌體靶向lsec，同時顯著抑制mps的吞噬，靶向肝臟血竇內(nèi)皮細(xì)胞遞送wnt2?mrna，促進肝臟血竇內(nèi)皮細(xì)胞向血竇微環(huán)境釋放wnt2，激活wnt/β-catenin信號通路，進而促進肝細(xì)胞的增殖。