本發(fā)明涉及包含亞硫酸根(sulfites)源和脂肪酶變體的組合物。本發(fā)明還涉及脂肪酶變體以及本發(fā)明的組合物用于清潔例如表面的用途。此外，本發(fā)明還涉及多核苷酸、包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體、包含本發(fā)明的多核苷酸的表達載體、包含本發(fā)明的多核苷酸的宿主細胞、產(chǎn)生本發(fā)明的脂肪酶變體的方法、以及獲得本發(fā)明的脂肪酶變體的方法。
背景技術(shù)：
亞硫酸根是在一些食品和人體中天然存在的物質(zhì)。它們被用于食品(作為防腐劑或強化劑)以及非食品(如例如家庭產(chǎn)品)中，并因此被包含在各種組合物中。脂肪酶已經(jīng)被用于組合物中用于通過水解甘油三酯以產(chǎn)生脂肪酸來去除脂質(zhì)污漬。當前的洗滌劑、清潔和/或織物護理組合物包含許多活性成分，所述成分干擾脂肪酶去除脂質(zhì)污漬的能力。在一些組合物中，將亞硫酸根源作為針對更不穩(wěn)定的功能性成分(如但不限于顏料、聚合物、香料)的抗氧化劑添加，或者在磺化的表面活性劑中作為痕量/雜質(zhì)。然而，亞硫酸根可以影響脂肪酶的穩(wěn)定性。wo?2017/005640涉及組合物，所述組合物包含：(a)亞硫酸根源；和(b)對亞硫酸根具有改進的穩(wěn)定性的親本脂肪酶的脂肪酶變體。需要包含亞硫酸根和脂肪酶的組合物(包括洗滌劑組合物)，所述亞硫酸根和脂肪酶在亞硫酸根的存在下是穩(wěn)定且有活性的。

背景技術(shù)

0、發(fā)明背景

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明涉及降低包含亞硫酸根源的組合物中的脂肪酶的穩(wěn)定性的問題。

2、在許多洗滌劑組合物中都存在亞硫酸根(so32-)。亞硫酸根可以破壞二硫鍵(r-s-s-r’)，并降低含有一個或多個半胱氨酸橋的脂肪酶的穩(wěn)定性。諸位發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，可以通過用接近半胱氨酸橋的帶負電荷的氨基酸屏蔽半胱氨酸橋來減少穩(wěn)定性的降低。據(jù)信，這種作用是由于亞硫酸根帶負電荷，因此亞硫酸根不易與帶負電荷的脂肪酶區(qū)域結(jié)合。

3、因此，在第一方面，本發(fā)明涉及組合物，所述組合物包含：

4、(a)亞硫酸根源；

5、(b)示為seq?id?no:2的親本脂肪酶或與seq?id?no:2具有至少60％同一性的親本脂肪酶的脂肪酶變體；

6、其中在半胱氨酸橋的20埃內(nèi)的親本脂肪酶中的一個或多個氨基酸被帶更多負電荷的氨基酸替代。

7、在一個實施例中，親本脂肪酶是seq?id?no:2、seq?id?no:4、seq?id?no:6、seq?idno:8、或seq?id?no:10、或seq?id?no:12的多肽，或者其具有脂肪酶活性的片段。

8、在優(yōu)選的實施例中，被替代的、優(yōu)選被取代的氨基酸在半胱氨酸橋(即，從羧基基團到硫原子)的15埃內(nèi)、優(yōu)選10埃內(nèi)、更優(yōu)選5埃內(nèi)。

9、在優(yōu)選的實施例中，亞硫酸根源選自：亞硫酸根(sulfites)，如亞硫酸鈉、亞硫酸鉀、亞硫酸鈣；亞硫酸氫根(bisulfite)，如亞硫酸氫鉀(potassium?bisulfite)、亞硫酸氫鈉(sodium?bisulfite)、亞硫酸氫鈣(calcium?bisulfite)；焦亞硫酸根/偏二亞硫酸根(metabisulfite)，如焦亞硫酸鉀(potassiummetabisulfite)、焦亞硫酸鈉(sodiummetabisulfite)、焦亞硫酸鈣(calciummetabisulfite)；或其任何組合。

10、在優(yōu)選的實施例中，亞硫酸根(為so32-)或焦亞硫酸根(為s2o52-)的量是從0.1wt％至3wt％；從0.2wt％至2wt％；從0.5wt％至2wt％。

11、在特定實施例中，脂肪酶變體包括與以下對應(yīng)的一個或多個取代：seq?id?no:2的q15d、e，g23d、e，t35d、e，t37d、e，n39d、e，a40d、e，p42d、e，n101d、e，s105d、e，g106d、e，f184d、e，或t267d、e。

12、根據(jù)本發(fā)明，親本脂肪酶可以包含一個或多個半胱氨酸橋。所述半胱氨酸橋優(yōu)選位于親本脂肪酶的表面上。

13、在本發(fā)明的特定實施例中，半胱氨酸橋是或?qū)?yīng)于以下位置處的半胱氨酸橋中的一個或多個：

14、seq?id?no:2的

15、c22-c268、

16、c36-c41、和

17、c104-c107。

18、在本發(fā)明的實施例中，與親本脂肪酶相比，本發(fā)明的脂肪酶變體在亞硫酸根源的存在下具有改進的穩(wěn)定性。

19、在優(yōu)選的實施例中，組合物進一步包含表面活性劑。

20、在一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的組合物用于清潔例如表面的用途。

21、本發(fā)明還涉及親本脂肪酶的脂肪酶變體，其中所述變體具有脂肪酶活性，與seqid?no:2或其具有脂肪酶活性的任何片段具有至少60％但小于100％序列同一性，并在對應(yīng)于seq?id?no:2的殘基15、23、35、37、39、40、42、101、105、106、184和267的位置處包含一個或多個(例如若干個)取代。

22、在特定實施例中，脂肪酶變體包括與選自以下組的取代對應(yīng)的一個或多個取代：seq?id?no:2的q15d、e，g23d、e，t35d、e，t37d、e，n39d、e，a40d、e，p42d、e，n101d、e，s105d、e，g106d、e，f184d，e，和t267d、e。

23、在一方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明的變體的多核苷酸。

24、在一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。

25、在一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的表達載體。

26、在一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多核苷酸、特別是本發(fā)明的表達載體的宿主細胞。

27、在一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生脂肪酶變體的方法，所述方法包括：(a)在適合于表達所述變體的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞；和(b)回收所述變體。

28、在一方面，本發(fā)明涉及用于獲得本發(fā)明的脂肪酶變體的方法，所述方法包括：向在半胱氨酸橋的20埃內(nèi)的示為seq?id?no:2的親本脂肪酶或與其具有至少60％序列同一性的親本脂肪酶中引入帶更多負電荷的氨基酸。

29、在一個實施例中，親本脂肪酶是seq?id?no:2、seq?id?no:4、seq?id?no:6、seq?idno:8、或seq?id?no:10、或seq?id?no:12的多肽，或者其具有脂肪酶活性的片段。

30、在優(yōu)選的實施例中，向親本脂肪酶中引入與seq?id?no:2中以下取代對應(yīng)的一個或多個取代：q15d、e，g23d、e，t35d、e，t37d、e，n39d、e，a40d、e，p42d、e，n101d、e，s105d、e，g106d、e，f184d、e，或t267d、e。

31、定義

32、脂肪酶：術(shù)語“脂肪酶(lipase)”、“脂肪酶(lipase?enzyme)”、“脂肪分解酶”、“脂質(zhì)酯酶”、“脂解多肽”以及“脂解蛋白”是指如酶命名法所定義的ec3.1.1類中的酶。它可以具有脂肪酶活性(三?；视椭久?，ec3.1.1.3)、角質(zhì)酶活性(ec3.1.1.74)、固醇酯酶活性(ec3.1.1.13)和/或蠟酯水解酶活性(ec3.1.1.50)。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)實例部分中描述的程序確定脂肪酶活性：可以使用具有不同鏈長的底物，用pnp測定法確定水解活性。

33、在一方面，本發(fā)明的變體具有親本脂肪酶的脂肪酶活性的至少20％，例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。在一方面，親本脂肪酶是seq?id?no:2、seq?id?no:4、seq?id?no:6、seq?id?no:8、或seq?id?no:10、或seq?idno:12的多肽，或者其具有脂肪酶活性的片段。

34、等位基因變體：術(shù)語“等位基因變體”意指占據(jù)同一染色體基因座的基因的兩種或更多種替代形式中的任一種。等位基因變異通過突變而自然產(chǎn)生，并且可以導致群體內(nèi)部的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?所編碼的多肽無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。

35、cdna：術(shù)語“cdna”意指可以通過從獲得自真核或原核細胞的成熟的、剪接的mrna分子進行反轉(zhuǎn)錄而制備的dna分子。cdna缺乏可以存在于對應(yīng)基因組dna中的內(nèi)含子序列。初始的初級rna轉(zhuǎn)錄物是mrna的前體，其要通過一系列的步驟(包括剪接)進行加工，然后呈現(xiàn)為成熟的剪接的mrna。

36、編碼序列：術(shù)語“編碼序列”意指多核苷酸，所述多核苷酸直接規(guī)定了變體的氨基酸序列。編碼序列的邊界通常由可讀框確定，所述可讀框以起始密碼子(如atg、gtg或ttg)開始并且以終止密碼子(如taa、tag或tga)結(jié)束。編碼序列可為基因組dna、cdna、合成dna或其組合。

37、控制序列：術(shù)語“控制序列”意指對于表達編碼本發(fā)明的變體的多核苷酸所必需的核酸序列。每個控制序列對于編碼所述變體的多核苷酸來說可以是原生的(即，來自相同基因)或外源的(即，來自不同基因)，或相對于彼此是原生的或外源的。此類控制序列包括但不限于前導序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列、和轉(zhuǎn)錄終止子。最少，控制序列包括啟動子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。出于引入促進控制序列與編碼變體的多核苷酸的編碼區(qū)域連接的特異性限制位點的目的，控制序列可以提供有接頭。

38、表達：術(shù)語“表達”包括涉及變體產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。

39、表達載體：術(shù)語“表達載體”意指直鏈或環(huán)狀dna分子，所述分子包括編碼變體的多核苷酸并且可操作地連接至提供用于其表達的控制序列。

40、片段：術(shù)語“片段”意指在多肽的氨基和/或羧基末端不存在一個或多個(例如若干個)氨基酸的多肽；其中所述片段具有脂肪酶活性。在一方面，片段含有存在于親本脂肪酶中的氨基酸的數(shù)目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一方面，親本脂肪酶是seq?id?no:2、seq?id?no:4、seq?id?no:6、seq?id?no:8、或seq?id?no:10、或seq?id?no:12的多肽。在一方面，親本脂肪酶是seq?id?no:2、seq?id?no:4、seq?id?no:6、seq?id?no:8、或seq?id?no:10、或seq?idno:12的氨基酸1-269。

41、高嚴格條件：術(shù)語“高嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準dna印跡程序，在42℃在5x?sspe、0.3％?sds、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和50％甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。最后在65℃使用2x?ssc、0.2％?sds將運載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

42、宿主細胞：術(shù)語“宿主細胞”意指易于用包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體進行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導等的任何細胞類型。術(shù)語“宿主細胞”涵蓋由于復制期間出現(xiàn)的突變而與親本細胞不完全相同的任何親本細胞子代。

43、改進的特性：術(shù)語“改進的特性”意指與相對于親本脂肪酶有所改進的變體相關(guān)的特征。此類改進的特性包括但不限于穩(wěn)定性(如例如在亞硫酸根源的存在下的穩(wěn)定性、在洗滌劑組合物中的穩(wěn)定性、在包含亞硫酸根源的洗滌劑組合物中的穩(wěn)定性、在貯藏條件下穩(wěn)定性、在亞硫酸根源的存在下在貯藏條件下的穩(wěn)定性)、熱穩(wěn)定性以及在亞硫酸根源的存在下的熱穩(wěn)定性。

44、分離的：術(shù)語“分離的”意指處于自然界中不存在的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實例包括(1)任何非天然存在的物質(zhì)，(2)包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子的任何物質(zhì)，所述物質(zhì)至少部分地從與其性質(zhì)相關(guān)的一種或多種或所有天然存在的成分中去除；(3)相對于自然界中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)通過人工修飾的任何物質(zhì)；或(4)通過相對于與其天然相關(guān)的其他組分，增加所述物質(zhì)的量而修飾的任何物質(zhì)(例如，編碼所述物質(zhì)的基因的多個拷貝；比與編碼所述物質(zhì)的基因天然相關(guān)聯(lián)的啟動子更強的啟動子的使用)。分離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣品中。

45、低嚴格條件：術(shù)語“低嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準dna印跡程序，在42℃、于5x?sspe、0.3％?sds、200微克/ml剪切并且變性的鮭魚精子dna以及25％甲酰胺中預雜交和雜交12小時至24小時。最后在50℃使用2x?ssc、0.2％?sds將運載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

46、成熟多肽：術(shù)語“成熟多肽”或“多肽的成熟部分”意指在翻譯和任何翻譯后修飾如n-末端加工、c-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后處于其最終形式的多肽。在一方面，成熟多肽是seq?id?no:2、seq?id?no:4、seq?id?no:6、seq?id?no:8、或seq?id?no:10、或seq?id?no:12的氨基酸1至269。在本領(lǐng)域中已知的是，宿主細胞可以產(chǎn)生由相同多核苷酸表達的兩種或多種不同的成熟多肽(即，具有不同的c-末端和/或n-末端氨基酸)的混合物。

47、成熟多肽編碼序列：術(shù)語“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有脂肪酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，成熟多肽編碼序列是seq?id?no:1、seq?id?no:3、seq?id?no:5、seq?id?no:7、seq?id?no:9、或seq?id?no:11的核苷酸1至807。

48、中嚴格條件：術(shù)語“中嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準dna印跡程序，在42℃在5x?sspe、0.3％?sds、200微克/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和35％甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。最后在55℃使用2x?ssc、0.2％?sds將運載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

49、中-高嚴格條件：術(shù)語“中-高嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準dna印跡程序，在42℃在5x?sspe、0.3％?sds、200ug/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和35％甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。最后在60℃使用2x?ssc、0.2％?sds將運載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

50、突變體：術(shù)語“突變體”意指編碼變體的多核苷酸。

51、核酸構(gòu)建體：術(shù)語“核酸構(gòu)建體”意指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子是從天然存在的基因中分離的，或以本來不存在于自然界中的方式被修飾成包含核酸的區(qū)段，或是合成的，所述核酸分子包含一個或多個控制序列。

52、可操作地連接：術(shù)語“可操作地連接”意指如下的構(gòu)型，在所述構(gòu)型中，控制序列被放置在相對于多核苷酸的編碼序列適當?shù)奈恢锰?，使得所述控制序列引導所述編碼序列的表達。

53、親本或親本脂肪酶：術(shù)語“親本”或“親本脂肪酶”意指進行改變以產(chǎn)生本發(fā)明的脂肪酶變體的脂肪酶。所述親本可以是天然存在的(野生型)多肽或其變體或片段。此類親本脂肪酶的實例是具有seq?id?no:2、seq?id?no:4、seq?id?no:6、seq?id?no:8、或seq?idno:10、或seq?id?no:12中給出的氨基酸序列的那些，或者其具有脂肪酶活性的片段。

54、序列同一性：兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的關(guān)聯(lián)度通過參數(shù)“序列同一性”來描述。

55、出于本發(fā)明的目的，使用尼德曼-翁施算法(needleman-wunsch?algorithm)(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物學雜志]48:443-453)來確定兩個氨基酸序列之間的序列同一性，所述算法如emboss軟件包(emboss：歐洲分子生物學開放軟件套件(the?european?molecular?biology?open?software?suite)，rice等人,2000,trendsgenet.[遺傳學趨勢]16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版本或更新版本)的尼德爾(needle)程序中所實施的。使用的參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5、以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩陣。使用尼德爾標記的“最長同一性”的輸出(使用非簡化(-nobrief)選項獲得)作為同一性百分比并且如下計算：

56、(同一的殘基x?100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))

57、出于本發(fā)明的目的，使用尼德曼-翁施算法(needleman和wunsch,1970,見上文)來確定兩個脫氧核苷酸序列之間的序列同一性，所述算法如emboss軟件包(emboss：歐洲分子生物學開放軟件套件，rice等人,2000,見上文)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德爾程序所實施的。所使用的參數(shù)是空位開放罰分10，空位延伸罰分0.5，以及ednafull(ncbi?nuc4.4的emboss版本)取代矩陣。使用尼德爾標記的“最長同一性”的輸出(使用非簡化(-nobrief)選項獲得)作為同一性百分比并且如下計算：

58、(同一的脫氧核糖核苷酸x?100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))

59、子序列：術(shù)語“子序列”意指具有從多肽編碼序列的5'端和/或3'端缺失的一個或多個(例如，若干個)核苷酸的多核苷酸；其中所述子序列編碼具有脂肪酶活性的片段。在一方面，子序列包含編碼親本脂肪酶的核苷酸1至807的數(shù)目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％但小于100％。在一方面，編碼親本脂肪酶的核苷酸包含seq?id?no:1、seq?id?no:3、seq?id?no:5、seq?id?no:7、seq?id?no:9、seq?id?no:11，或者其編碼具有脂肪酶活性的片段的子序列，或由其組成。

60、亞硫酸根(sulfite)：術(shù)語“亞硫酸根”意指含有亞硫酸根離子[so3]2-的化合物。術(shù)語“亞硫酸氫根”(bisulfite或hydrogen?sulfite)”意指含有亞硫酸氫根離子[hso3]-的化合物。術(shù)語“焦亞硫酸根/偏二亞硫酸根”(metabisulfite)或“二亞硫酸根(disulfite)”意指含有焦亞硫酸根/偏二亞硫酸根離子[s2o5]2-的化合物。出于本發(fā)明的目的，使用術(shù)語“亞硫酸根源”覆蓋提供在本發(fā)明的段落中提及的化合物的任何亞硫酸根源。本發(fā)明包括有意添加的亞硫酸根源。

61、變體：術(shù)語“變體”意指具有脂肪酶活性的、在一個或多個(例如若干個)位置包含改變(即取代、插入和/或缺失)的一個多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占用某一位置的氨基酸；并且插入意指在鄰接并且緊隨占用某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。本發(fā)明的變體具有親本脂肪酶的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的脂肪酶活性。在一方面，親本脂肪酶包含seq?id?no:2、seq?id?no:4、seq?id?no:6、seq?id?no:8、或seq?id?no:10、seq?id?no:12，或其具有脂肪酶活性的變體，或由其組成。

62、非常高嚴格條件：術(shù)語“非常高嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準dna印跡程序，在42℃在5x?sspe、0.3％sds、200ug/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和50％甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。最后在70℃使用2x?ssc、0.2％?sds將運載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

63、非常低嚴格條件：術(shù)語“非常低嚴格條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標準dna印跡程序，在42℃在5x?sspe、0.3％sds、200ug/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和25％甲酰胺中預雜交和雜交12至24小時。最后在45℃使用2x?ssc、0.2％?sds將運載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

64、野生型脂肪酶：術(shù)語“野生型”脂肪酶意指由見于自然界中的天然存在的微生物(如細菌、酵母或絲狀真菌)表達的脂肪酶。

65、變體命名慣例

66、出于本發(fā)明的目的，使用在seq?id?no:2的多肽來確定另一種脂肪酶中相應(yīng)的氨基酸殘基。將另一種脂肪酶的氨基酸序列與seq?id?no:2的脂肪酶進行比對，并且基于比對，使用如在emboss包(emboss：歐洲分子生物學開放軟件套件，rice等人,2000,trendsgenet.[遺傳學趨勢]16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版本或更新版本)的尼德爾程序中所實施的尼德曼-翁施算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物學雜志]48:443-453)來確定與seq?id?no:2的多肽中的任何氨基酸殘基相對應(yīng)的氨基酸位置編號。使用的參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5、以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩陣。

67、可以通過使用若干計算機程序，使用其對應(yīng)默認參數(shù)比對多個多肽序列來確定在另一種脂肪酶中的對應(yīng)氨基酸殘基的鑒別，所述計算機程序包括但不限于muscle(通過對數(shù)預期的多序列比較；版本3.5或更新版本；edgar,2004,nucleic?acids?research[核酸研究]32:1792-1797)，mafft(版本6.857或更新版本；katoh和kuma,2002,nucleic?acidsresearch[核酸研究]30:3059-3066；katoh等人,2005,nucleic?acids?research[核酸研究]33:511-518；katoh和toh,2007,bioinformatics[生物信息學]23:372-374；katoh等人,2009,methods?in?molecular?biology[分子生物學方法]537:39-64；katoh和toh,2010,bioinformatics[生物信息學]26:1899-1900)，以及采用clustalw(1.83或更新版本；thompson等人，1994，nucleic?acids?research[核酸研究]22:4673-4680)的emboss?emma。

68、當其他酶與seq?id?no:2的多肽相背離這樣使得傳統(tǒng)的基于序列的比較方法不能檢測其關(guān)系時(lindahl和elofsson,2000,j.mol.biol.[分子生物學雜志]295:613-615)，可使用其他成對序列比較算法。在基于序列的搜索中較高的敏感度可使用搜索程序來獲得，所述搜索程序利用多肽家族的概率表現(xiàn)(譜)來搜索數(shù)據(jù)庫。例如，psi-blast程序通過迭代數(shù)據(jù)庫搜索過程來產(chǎn)生多個譜，并且能夠檢測遠距離同源物(atschul等人,1997,nucleic?acids?res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中的一個或多個代表，可以實現(xiàn)甚至更高的敏感度。程序如genthreader(jones,1999,j.mol.biol.[分子生物學雜志]287:797-815；mcguffin和jones,2003,bioinformatics[生物信息學]19:874-881)利用來自多種來源(psi-blast、二級結(jié)構(gòu)預測、結(jié)構(gòu)比對譜、以及溶劑化勢)的信息作為預測查詢序列的結(jié)構(gòu)折疊的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入。類似地，gough等人,2000,j.mol.biol.[分子生物學雜志]313:903-919的方法可用于將未知結(jié)構(gòu)的序列與存在于scop數(shù)據(jù)庫中的超家族模型進行比對。這些比對進而可以用于產(chǎn)生多肽的同源性模型，并且使用出于所述目的而開發(fā)的多種工具可以評估此類模型的準確度。

69、對于已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，若干工具和資源可用于檢索并產(chǎn)生結(jié)構(gòu)比對。例如，蛋白質(zhì)的scop超家族已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上進行比對，并且那些比對是可訪問且可下載的?？梢允褂枚喾N算法如距離比對矩陣(holm和sander,1998,proteins[蛋白質(zhì)]33:88-96)或組合延伸(shindyalov和bourne,1998,protein?engineering[蛋白質(zhì)工程]11:739-747)比對兩種或更多種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且這些算法的實施可另外用于查詢具有感興趣結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，以發(fā)現(xiàn)可能的結(jié)構(gòu)同源物(例如，holm和park,2000,bioinformatics[生物信息學]16:566-567)。

70、在描述本發(fā)明的變體中，為了便于參考，對以下所述的命名法進行了改編。采用了已接受的iupac單字母或三字母的氨基酸縮寫。

71、取代.對于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，將在位置226處的蘇氨酸被丙氨酸取代表示為“thr226ala”或“t226a”。多個突變通過加號(“+”)分開，例如“gly205arg+ser411phe”或“g205r+s411f”代表在位置205和位置411處的甘氨酸(g)和絲氨酸(s)分別被精氨酸(r)和苯丙氨酸(f)取代。

72、缺失.對于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，將在位置195處的甘氨酸的缺失表示為“gly195*”或“g195*”。多個缺失由加號(“+”)分開，例如，“gly195*+ser411*”或“g195*+s411*”。

73、插入.對于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，將在位置195處的甘氨酸之后插入賴氨酸表示為“gly195glylys”或“g195gk”。多個氨基酸的插入被表示為[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，將在位置195處的甘氨酸之后插入賴氨酸和丙氨酸表示為“gly195glylysala”或“g195gka”。

74、在此類情況下，通過將小寫字母添加至在所插入的一個或多個氨基酸殘基之前的氨基酸殘基的位置編號而對所插入的一個或多個氨基酸殘基進行編號。在以上實例中，序列因此會是：

75、 <![cdata[<u>親本：</u>]]> <![cdata[<u>變體：</u>]]> 195 195?195a?195b g g-k-a

76、多種改變.包含多種改變的變體由加號(“+”)分開，例如，“arg170tyr+gly195glu”或“r170y+g195e”代表在位置170和位置195處的精氨酸和甘氨酸分別被酪氨酸和谷氨酸取代。多個變體也可以被披露為例如“r170y?g195e”(即，在改變之間沒有“+”)。

77、不同改變.在可于一個位置處引入不同改變的情況下，不同的改變由逗號分開，例如，“arg170tyr,glu”代表用酪氨酸或谷氨酸取代在位置170處的精氨酸。因此，“tyr167gly,ala+arg170gly,ala”表示以下變體：

78、“tyr167gly+arg170gly”、“tyr167gly+arg170ala”、“tyr167ala+arg170gly”、和“tyr167ala+arg170ala”。