本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種蛇隱孢子蟲病抗體的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、隱孢子蟲是引起蛇類胃腸道疾病的重要病原體，分布在世界各地。隱孢子蟲病是一種眾所周知的慢性肥厚性胃炎的病因，在圈養(yǎng)的蛇中可能是致命的。蛇隱孢子蟲病的臨床表現(xiàn)為粘液樣或出血性腹瀉、發(fā)熱，厭食、嗜睡、餐后反流、中體腫脹和體重減輕甚至死亡。與哺乳動(dòng)物和鳥類不同，這種感染更常發(fā)生在成年爬行動(dòng)物而不是幼小爬行動(dòng)物中。爬行動(dòng)物主要感染2種隱孢子蟲，分別為c.saurophilum和c.serpentis。c.saurophilum主要感染蜥蜴，寄生于腸道和泄殖腔，而馬達(dá)加斯加殘趾虎(phelsuma?madagascarensisgrandis)和豹紋守宮(eublepharis?macularius)的感染部位則局限在泄殖腔。c.serpentis主要感染蛇，寄生于胃組織，在8～28周可在糞便中發(fā)現(xiàn)卵囊，通常不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，一旦出現(xiàn)軀體中部腫脹、嘔吐、厭食和體重減輕等，預(yù)后不良，死亡率較高。

2、蛇的隱孢子蟲感染很難識(shí)別，特別是那些亞臨床感染。此前，對(duì)蛇隱孢子蟲感染的分子分析檢出較高比例的隱孢子蟲(10.1-75.0％)感染。此外，隱孢子蟲具有環(huán)境抗性卵囊，這是一個(gè)公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)因素，特別是對(duì)兒童、老年人或免疫功能低下的患者。用感染隱孢子蟲的老鼠或任何其他獵物喂養(yǎng)蛇可能會(huì)通過糞便、水和受污染的設(shè)備將病原體傳播給人類。

3、目前尚無商品化藥物可以有效清除蛇體內(nèi)的隱孢子蟲，磺胺甲氧芐啶、巴龍霉素和螺旋霉素均只能減輕動(dòng)物的臨床癥狀，減少或消除卵囊的脫落。此外必須給予患病動(dòng)物全面的支持性治療，如較高的環(huán)境溫度(≥27℃)、皮下補(bǔ)液、定時(shí)灌食易消化的流質(zhì)食物等。因此，為有效防治蛇隱孢子蟲感染，亟需開發(fā)安全有效的特異性藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種蛇隱孢子蟲病抗體的制備方法及其應(yīng)用，以期高效制備高效價(jià)、對(duì)于蛇隱孢子蟲有良好的預(yù)防和輔助治療作用的卵黃抗體。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種蛇隱孢子蟲病抗體的制備方法，包括以下步驟：

4、s1：取bl21-pet-28a-owp蛋白與佐劑混合并進(jìn)行乳化處理，得到bl21-pet-28a-owp蛋白免疫原；bl21-pet-28a-owp蛋白免疫原中owp含量為50-100μg；

5、s2：取免疫助劑，免疫助劑含魚腥草提取物0.3-0.5wt％、蓽茇提取物0.5-0.8wt％、枳椇子提取物0.8-1.5wt％，溶劑為注射用水；

6、s3：選取健康產(chǎn)蛋母雞，隔離飼養(yǎng)觀察后，接種bl21-pet-28a-owp蛋白免疫原和免疫助劑進(jìn)行免疫；免疫程序包括：

7、s3.1：基礎(chǔ)免疫：對(duì)每只健康產(chǎn)蛋母雞的頸部皮下或胸部肌肉進(jìn)行注射接種bl21-pet-28a-owp蛋白免疫原1-2ml/只雞，然后注射免疫助劑1-2ml/只雞；

8、s3.2：二次免疫：在基礎(chǔ)免疫后間隔10-15日進(jìn)行第二次注射接種，對(duì)頸部皮下或胸部肌肉進(jìn)行注射接種bl21-pet-28a-owp蛋白免疫原1-2ml/只雞，然后注射免疫助劑1-2ml/只雞；

9、s3.3：三次免疫：在二次免疫后間隔10-15日進(jìn)行第三次注射接種，對(duì)頸部皮下或胸部肌肉進(jìn)行注射接種bl21-pet-28a-owp蛋白免疫原1-2ml/只雞，然后注射免疫助劑1-2ml/只雞；

10、s3.4：三次免疫后，當(dāng)雞蛋卵黃液中bl21-pet-28a-owp蛋白抗體效價(jià)高于1:4000后，收集免疫雞蛋；

11、s4：對(duì)免疫雞蛋進(jìn)行消毒，收集蛋黃液，制備蛇隱孢子蟲卵黃抗體液；蛇隱孢子蟲卵黃抗體液的制備方法包括如下步驟：將蛋黃液與ph7.3-7.5的tris-hcl緩沖液按照體積比1:1-1:5進(jìn)行混合，震蕩混勻20-30秒后，加入總體積2-5％(w/v)的聚乙二醇peg6000，充分震蕩混勻，用低溫冷凍離心機(jī)在4℃，10000-12000r/min條件下離心20-30min，取上清液，用丙綸750b濾布進(jìn)行過濾，收集濾液，之后采用濾柱式過濾器過濾至液體澄清，得到澄清液；向澄清液中加入總體積5-10％(w/v)的聚乙二醇peg6000，震蕩混勻后室溫放置30-40min；用低溫冷凍離心機(jī)在4℃，10000-12000r/min條件下離心20-30min，棄掉上清液，獲得沉淀物a；用無菌ph7.3-7.5的pbs緩沖溶液溶解沉淀物a(10ml蛋黃液制備的沉淀物a用10ml無菌ph7.3-7.5的pbs緩沖溶液溶解)，之后加入總體積10-15％(w/v)的聚乙二醇peg6000，震蕩混勻充分溶解，在室溫條件下放置30-40min，用低溫冷凍離心機(jī)在4℃，10000-12000r/min條件下離心20-30min，棄掉上清液，獲得沉淀物b，在沉淀物b中加入無菌ph7.3-7.5的pbs緩沖溶液進(jìn)行溶解(10ml蛋黃液制備的沉淀物b用1ml無菌ph7.3-7.5的pbs緩沖溶液溶解)，獲得蛇隱孢子蟲卵黃抗體液，即蛇隱孢子蟲病抗體。

12、進(jìn)一步地，步驟s1中，所述bl21-pet-28a-owp蛋白的制備方法，包括以下步驟：

13、n1：根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫查找蛇隱孢子蟲具有免疫原性的蛋白片段，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并克隆至pet-28a原核表達(dá)載體中；

14、n2：大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)pet-28a-owp蛋白；

15、n3：western?blot鑒定蛋白表達(dá)，得到bl21-pet-28a-owp蛋白。

16、進(jìn)一步地，步驟s2中，所述魚腥草提取物的制備方法，包括以下步驟：取魚腥草進(jìn)行粉碎，加入魚腥草質(zhì)量8-12倍的水，調(diào)節(jié)ph4.0-5.0，加入魚腥草質(zhì)量0.5-2％的半纖維素酶和魚腥草質(zhì)量0.5-2％的果膠酶，在45-50℃酶解2-3h，調(diào)節(jié)ph6.8-7.0，加入魚腥草質(zhì)量0.5-1.5％的沙雷肽酶，在45-50℃酶解1-2h，調(diào)節(jié)ph7.5-8.5，加入魚腥草質(zhì)量0.5-1.5％的角蛋白酶，在45-50℃酶解1-1.5h，調(diào)節(jié)ph6.5-7.0，沸水浴滅酶15-20min，降至室溫后，以5000-6000r/min離心10-15min，取上清液，采用3kda超濾膜進(jìn)行超濾，得到小于3kda的組分，凍干至恒重，得到魚腥草提取物。

17、進(jìn)一步的，步驟s2中，所述蓽茇提取物的制備方法，包括以下步驟：取蓽茇果穗進(jìn)行粉碎，加入蓽茇果穗質(zhì)量8-12倍的水，調(diào)節(jié)ph?4.5-5.5，加入蓽茇果穗質(zhì)量0.5-2％的纖維素酶，在50-60℃酶解2-3h，調(diào)節(jié)ph1.5-2.5，加入蓽茇果穗質(zhì)量0.5-1.5％的胃蛋白酶，在35-38℃酶解1-2h，調(diào)節(jié)ph6.5-7.0，加入蓽茇果穗質(zhì)量0.5-1.5％的無花果蛋白酶，在60-65℃酶解1-1.5h，沸水浴滅酶15-20min，降至室溫后，以5000-6000r/min離心10-15min，取上清液，采用1kda和5kda超濾膜進(jìn)行超濾，截留1kda-5kda之間的組分，凍干至恒重，得到蓽茇提取物。

18、進(jìn)一步的，步驟s2中，所述枳椇子提取物的制備方法，包括以下步驟：取枳椇子進(jìn)行粉碎，加入枳椇子質(zhì)量8-12倍質(zhì)量的水，調(diào)節(jié)ph?4.0-5.0，加入枳椇子質(zhì)量0.5-2％的半纖維素酶和枳椇子質(zhì)量0.5-2％的果膠酶，在50-55℃酶解2-3h，調(diào)節(jié)ph1.5-2.5，加入枳椇子質(zhì)量0.5-1.5％的胃蛋白酶，在35-38℃酶解1-2h，沸水浴滅酶15-20min，降至室溫后，調(diào)節(jié)ph6.5-7，加入枳椇子質(zhì)量0.5-1.5％的木瓜蛋白酶和枳椇子質(zhì)量0.5-1.5％的角蛋白酶，在55℃-60℃酶解1-1.5h，沸水浴滅酶15-20min，降至室溫后，加入枳椇子質(zhì)量1-3倍質(zhì)量的乙醇，混合浸泡1-2h，以5000-6000r/min離心10-15min，取上清液，采用1kda和3kda超濾膜進(jìn)行超濾，截留1kda-3kda之間的組分，凍干至恒重，得到枳椇子提取物。

19、本發(fā)明還提供一種蛇隱孢子蟲病抗體，采用上述制備方法制得。

20、本發(fā)明還提供一種藥物制劑，包含所述的蛇隱孢子蟲病抗體以及藥學(xué)上可接受的輔助成分；所述藥物制劑給藥途徑為口服給藥或注射給藥。

21、本發(fā)明還提供一種蛇隱孢子蟲病抗體或所述藥物制劑在制備預(yù)防、緩解、輔助治療或治療蛇隱孢子蟲病藥物中的用途。

22、本發(fā)明的有益效果：

23、一、本發(fā)明開發(fā)的蛇隱孢子蟲病抗體對(duì)于治療該疾病及相關(guān)適應(yīng)癥具有顯著的療效，能夠改善臨床癥狀，減少病理損害，并提高感染動(dòng)物的存活率和生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)具有成本效益和廣泛的應(yīng)用前景。

24、二、免疫助劑中的多種提取物含有生物活性成分，這些成分能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，刺激免疫細(xì)胞的活性，如巨噬細(xì)胞、t細(xì)胞、b細(xì)胞等，使其更好地識(shí)別和處理抗原，從而增強(qiáng)免疫應(yīng)答，提高抗體的產(chǎn)生量和效價(jià)。免疫助劑與抗原混合使用時(shí)，能夠增強(qiáng)抗原的免疫原性，使機(jī)體對(duì)該抗原產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。在免疫過程中，機(jī)體可能會(huì)受到各種因素的影響而產(chǎn)生免疫抑制，如應(yīng)激反應(yīng)、炎癥等。免疫助劑中的某些成分具有抗炎、抗氧化等作用，能夠減輕機(jī)體的應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減少免疫抑制的發(fā)生，使免疫系統(tǒng)能夠更好地發(fā)揮作用，提高免疫效價(jià)。

25、三、魚腥草提取物在制備過程中，通過使用多種酶進(jìn)行酶解，如半纖維素酶、果膠酶、沙雷肽酶、角蛋白酶等，將魚腥草中的大分子物質(zhì)分解成小分子的高效活性成分。這些小分子活性成分更容易被機(jī)體吸收和利用，能夠更有效地刺激免疫系統(tǒng)，提高免疫效價(jià)。采用3kda超濾膜進(jìn)行超濾，得到小于3kda的組分，能夠去除一些大分子雜質(zhì)和可能存在的免疫抑制物質(zhì)，使提取物中的活性成分更加純凈和集中，從而增強(qiáng)了提取物對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激作用，提高免疫效價(jià)。

26、四、蓽茇提取物的制備過程中，先后使用纖維素酶、胃蛋白酶、無花果蛋白酶等進(jìn)行分步酶解，能夠使蓽茇中的有效成分充分釋放出來，并且將大分子物質(zhì)分解成小分子的特定活性成分和特定小分子肽，這些活性成分有助于提高機(jī)體免疫能力，且容易被機(jī)體吸收和利用，從而提高其對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激作用，進(jìn)而提高免疫效價(jià)。采用1kda和5kda超濾膜進(jìn)行超濾，截留1kda-5kda之間的組分，能夠富集和保留蓽茇中的有效成分，去除雜質(zhì)和無效成分，使提取物中的活性成分更加集中和純凈，增強(qiáng)了提取物對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激作用，從而提高免疫效價(jià)。

27、五、枳椇子提取物的制備過程中使用了半纖維素酶、果膠酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和角蛋白酶等多種酶進(jìn)行復(fù)合酶解，能夠?qū)㈣讞鹤又械拇蠓肿游镔|(zhì)如多糖、蛋白質(zhì)等分解成小分子的活性成分，這些小分子活性成分更加高效，具有更好的生物活性和免疫調(diào)節(jié)作用，能夠更有效地刺激免疫系統(tǒng)，提高免疫效價(jià)。通過分步調(diào)節(jié)ph并進(jìn)行不同酶的酶解反應(yīng)，能夠使枳椇子中的不同成分在各自適宜的條件下充分酶解，提高酶解效率和效果，使更多的有效成分被釋放出來，同時(shí)也有助于去除一些雜質(zhì)和可能存在的免疫抑制物質(zhì)，從而提高提取物的質(zhì)量和活性，進(jìn)而提高免疫效價(jià)。采用1kda和3kda超濾膜進(jìn)行超濾，截留1kda-3kda之間的組分，然后再加入乙醇進(jìn)行浸泡提取，能夠進(jìn)一步富集和純化枳椇子中的有效成分，去除大分子雜質(zhì)和一些不需要的成分，使提取物中的活性成分更加集中和純凈，增強(qiáng)了提取物對(duì)免疫系統(tǒng)的刺激作用，提高免疫效價(jià)。

28、六、魚腥草提取物、蓽茇提取物和枳椇子提取物配合使用具有免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同作用，分別作用于免疫系統(tǒng)的不同環(huán)節(jié)和細(xì)胞類型，如巨噬細(xì)胞、t細(xì)胞、b細(xì)胞等，通過協(xié)同作用，形成一個(gè)更加全面和有效的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，提高免疫效價(jià)。三者配合使用時(shí)，能夠在抗炎和抗氧化方面產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，為免疫系統(tǒng)創(chuàng)造一個(gè)更有利的內(nèi)環(huán)境，使免疫細(xì)胞能夠更好地發(fā)揮功能，提高免疫效價(jià)。三種提取物中的化學(xué)成分各不相同，存在成分互補(bǔ)的情況，不同提取物中的成分在體內(nèi)相互作用，產(chǎn)生具有免疫調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)，從而發(fā)揮協(xié)同增效的作用，提高免疫效價(jià)。