本發(fā)明涉及生物工程，具體而言，涉及一種重組表達(dá)載體、重組菌、大麻二酚類似物o-1821合成方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、大麻素是源于植物大麻(cannabis?sativa)的一類次生代謝產(chǎn)物的總稱，其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的潛力已被廣泛研究。大麻素因其在緩解疼痛、抑制炎癥、減輕焦慮、治療癲癇和代謝疾病等方面的顯著效果，逐漸成為藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。其中，o-1821(也稱為cannabidiorcol、cbdo或cbd-c1)是大麻二酚(cbd)的一種結(jié)構(gòu)類似物。o-1821表現(xiàn)出對大麻素受體(cb)的較低親和力，但作為瞬時(shí)受體電位通道(trp通道)的激動(dòng)劑，能夠通過多種信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。此外，o-1821在神經(jīng)保護(hù)和抗氧化方面也顯示出潛在療效。然而，已有研究表明，高濃度的o-1821可能會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，提示需要更加精準(zhǔn)的劑量調(diào)控與應(yīng)用探索。

2、大麻根霉酸(cannabigerorcinic?acid,cbgoa)和苔色酸(orsellinic?acid，osa)是o-1821的兩個(gè)關(guān)鍵前體化合物，二者均具有重要的藥理特性。苔色酸作為一種天然化合物，已被證實(shí)具有抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等生物學(xué)活性。大麻根霉酸則因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能，在大麻素合成及藥物研發(fā)中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。然而，傳統(tǒng)通過植物提取方式獲取這些大麻素及其前體的工藝，受制于高昂的成本、有限的資源供給以及周期性生產(chǎn)的不確定性，極大限制了其工業(yè)化生產(chǎn)和廣泛藥用開發(fā)。

3、微生物代謝工程的發(fā)展為大麻素的可持續(xù)生產(chǎn)提供了新的解決方案。通過設(shè)計(jì)合成特定的代謝通路，微生物細(xì)胞工廠能夠在控制條件下高效生產(chǎn)目標(biāo)化合物。尤其是非傳統(tǒng)微生物平臺(tái)的應(yīng)用，為突破傳統(tǒng)生產(chǎn)的瓶頸提供了全新的可能性。

4、解脂耶氏酵母(yarrowia?lipolytica)是一種具有高脂肪酸代謝能力和遺傳工程靈活性的非傳統(tǒng)酵母。與傳統(tǒng)模式微生物(如釀酒酵母)相比，解脂耶氏酵母在丙二酰輔酶a(malonyl-coa)和異戊二烯焦磷酸(ipp)通量上具有顯著優(yōu)勢，使其成為復(fù)雜天然產(chǎn)物(如大麻素)生物合成的理想平臺(tái)。然而，目前利用解脂耶氏酵母合成大麻素及其類似物的研究仍處于起步階段，特別是針對o-1821及其前體化合物(如大麻根霉酸和苔色酸)的高效生產(chǎn)研究尚屬空白，阻礙了這些高附加值化合物在醫(yī)藥領(lǐng)域的開發(fā)與應(yīng)用。

5、鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種重組表達(dá)載體、重組菌、大麻二酚類似物o-1821合成方法及其應(yīng)用，以推動(dòng)大麻素類藥物的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程和臨床應(yīng)用前景。

2、本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種重組表達(dá)載體，其包括：第一表達(dá)載體、第二表達(dá)載體和第三表達(dá)載體；

4、所述第一表達(dá)載體包括苔色酸合成酶armb基因；所述第二表達(dá)載體包括來源于植物大麻的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶tcspt4基因和來源于鏈霉菌的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶nphb(y288a/g286s)突變體基因；所述第三表達(dá)載體包括來源于植物大麻的大麻二酚酸合酶突變體cbdas(g183v/n482w)基因。

5、第二方面，本發(fā)明還提供了一種重組菌或重組細(xì)胞，其包括上述的重組表達(dá)載體。

6、第三方面，本發(fā)明還提供了重組表達(dá)載體或上述的重組菌或重組細(xì)胞在大麻二酚類似物o-1821合成、大麻根霉酸或苔色酸合成中的應(yīng)用。

7、第四方面，本發(fā)明還提供了一種大麻二酚類似物o-1821的合成方法，其包括如下步驟：其包括如下步驟：將上述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化底盤菌株，并對轉(zhuǎn)化后的菌中的選擇標(biāo)記進(jìn)行消除，篩選獲得重組菌；培養(yǎng)所述重組菌或培養(yǎng)上述的重組菌。

8、第五方面，本發(fā)明還提供了一種解脂耶氏酵母工程菌株的構(gòu)建方法，構(gòu)建方法包括：

9、將上述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染解脂耶氏酵母菌株的感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)得到陽性轉(zhuǎn)化子。

10、本發(fā)明具有以下有益效果：

11、本發(fā)明通過模塊化代謝工程和基因優(yōu)化設(shè)計(jì)，重建解脂耶氏酵母內(nèi)的大麻二酚類似物o-1821及其前體大麻根霉酸和苔色酸從頭合成途徑，實(shí)現(xiàn)以上產(chǎn)物在酵母中的生物合成。本發(fā)明提供的重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至底盤菌株的感受態(tài)細(xì)胞后可實(shí)現(xiàn)苔色酸合成酶基因、來源于植物大麻的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶tcspt4基因、來源于鏈霉菌的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶nphb(y288a/g286s)突變體基因和來源植物大麻的大麻二酚酸合酶突變體cbdas(g183v/n482w)基因的共表達(dá)，實(shí)現(xiàn)o-1821及其前體大麻根霉酸和苔色酸的從頭合成。首先，可通過優(yōu)化內(nèi)源性丙二酰輔酶a和香葉基二磷酸(gpp)的代謝通量，增強(qiáng)了關(guān)鍵酶的催化效率。其次，引入了凝聚相囊泡狀酶活性濃縮體-雙異戊烯基轉(zhuǎn)移酶協(xié)同表達(dá)系統(tǒng)，協(xié)同表達(dá)雙異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(tcspt4和nphb)，顯著提高了苔色酸轉(zhuǎn)化為大麻根霉酸的效率，實(shí)現(xiàn)了o-1821及其前體化合物的高效合成。與設(shè)計(jì)前的底盤菌株相比，本發(fā)明提供的解脂耶氏酵母工程菌株實(shí)現(xiàn)了苔色酸、大麻根霉酸和大麻二酚類似物o-1821的從無到有的高效合成，有助于解脂耶氏酵母工程菌株成為復(fù)雜天然產(chǎn)物(如大麻素)生物合成的理想平臺(tái)，推動(dòng)了這些高附加值化合物在醫(yī)藥領(lǐng)域的開發(fā)與應(yīng)用。

技術(shù)特征：

1.重組表達(dá)載體，其特征在于，其包括：第一表達(dá)載體、第二表達(dá)載體和第三表達(dá)載體；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述苔色酸合成酶的氨基酸序列如seq?id?no.5所示，所述來源于植物大麻的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶tcspt4的氨基酸序列如seqid?no.6所示，所述來源于鏈霉菌的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶nphb(y288a/g286s)突變體的氨基酸序列如seq?id?no.7所示，所述來源于植物大麻的大麻二酚酸合酶突變體cbdas(g183v/n482w)的氨基酸序列如seq?id?no.8所示；

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述第一表達(dá)載體上的所述苔色酸合成酶armb基因的5’端具有啟動(dòng)子，3’端均具有與所述啟動(dòng)子相對應(yīng)的終止子；所述異戊烯基轉(zhuǎn)移酶tcspt4基因的5’端具有啟動(dòng)子，3’端均具有與所述啟動(dòng)子相對應(yīng)的終止子；所述異戊烯基轉(zhuǎn)移酶nphb(y288a/g286s)突變體基因的5’端具有啟動(dòng)子，3’端均具有與所述啟動(dòng)子相對應(yīng)的終止子和所述大麻二酚酸合酶突變體cbdas(g183v/n482w)基因的5’端具有啟動(dòng)子，3’端均具有與所述啟動(dòng)子相對應(yīng)的終止子；

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體的骨架載體是pylxp或purlp。

5.一種重組菌或重組細(xì)胞，其特征在于，其包括權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組菌或重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組菌的底盤菌株為酵母菌；所述重組細(xì)胞為重組菌的感受態(tài)細(xì)胞；

7.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體或權(quán)利要求5-6任一項(xiàng)所述的重組菌或重組細(xì)胞在大麻二酚類似物o-1821合成、大麻根霉酸或苔色酸合成中的應(yīng)用。

8.一種大麻二酚類似物o-1821的合成方法，其特征在于，其包括如下步驟：將權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化亮氨酸leu和尿嘧啶ura雙缺陷型底盤菌株，并對轉(zhuǎn)化后的菌中的選擇標(biāo)記進(jìn)行消除，篩選獲得重組菌；培養(yǎng)所述重組菌或培養(yǎng)權(quán)利要求5-6任一項(xiàng)所述的重組菌或重組細(xì)胞；

9.一種工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括：

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的解脂耶氏酵母工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述解脂耶氏酵母菌株為尿嘧啶ura和亮氨酸leu雙缺陷型。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種重組表達(dá)載體、重組菌、大麻二酚類似物O?1821合成方法及其應(yīng)用，涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過多種創(chuàng)新策略顯著提升了合成效率。首先，可通過優(yōu)化內(nèi)源性丙二酰輔酶A和香葉基二磷酸的代謝通量，增強(qiáng)了關(guān)鍵酶的催化效率。其次，引入了凝聚相囊泡狀酶活性濃縮體?雙異戊烯基轉(zhuǎn)移酶協(xié)同表達(dá)系統(tǒng)，協(xié)同表達(dá)雙異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，顯著提高了苔色酸轉(zhuǎn)化為大麻根霉酸的效率，實(shí)現(xiàn)了O?1821及其前體化合物的高效合成。本發(fā)明在藥物研發(fā)、天然產(chǎn)物生物合成及生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力，為大麻素類化合物的可持續(xù)生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供了新途徑。

技術(shù)研發(fā)人員：徐鵬,洪宇翔
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣東以色列理工學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/22