本發(fā)明涉及生物，具體涉及同源nv基因替換的重組減毒傳染性造血器官壞死病毒及其作為疫苗的應用。

背景技術(shù)：

1、傳染性造血器官壞死病毒（infectious?haematopoietic?necrosis?virus，ihnv），屬于彈狀病毒科（ rhabdoviridae），諾拉彈狀病毒屬（ novirhabdovirus），為單股負鏈rna病毒，其病毒基因組全長約為11?kb，包含六個基因，分別編碼病毒核蛋白（n）、磷蛋白（p）、基質(zhì)蛋白（m）、糖蛋白（g）、非結(jié)構(gòu)蛋白（nv）和聚合酶蛋白（l）。根據(jù)g蛋白基因序列可將世界范圍內(nèi)的ihnv分為u、m、l、e和j五種基因型。

2、傳染性造血器官壞死病（infectious?hematopoietic?necrosis,?ihn）是一種由傳染性造血器官壞死病毒引起的急性魚類傳染病，對大多數(shù)鮭科魚類易感。世界動物衛(wèi)生組織（oie）將其列為必須申報的進出口貿(mào)易動物疫病，在我國被列為二類動物疫病。

3、由于宿主的種類、病毒基因群及環(huán)境條件等因素不同，某些ihnv毒株可造成患病虹鱒死亡率高達90-100%，對鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失和威脅。疫苗是預防病毒病發(fā)生和惡化的重要手段，目前僅有加拿大有ihn疫苗上市，其他國家仍無疫苗可供使用。因此，發(fā)明一種安全、高效的疫苗對預防ihn具有非常重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供同源nv基因替換的重組減毒傳染性造血器官壞死病毒及其作為疫苗的應用。

2、第一方面，本發(fā)明要求保護一種重組減毒傳染性造血器官壞死病毒。

3、本發(fā)明所要求保護的重組減毒傳染性造血器官壞死病毒與傳染性造血器官壞死病毒sn1203株相比，差別僅在于將傳染性造血器官壞死病毒sn1203株基因組rna中的nv基因或其片段替換為傳染性造血器官壞死病毒blk94株基因組rna中的相應基因或其片段。

4、其中，所述傳染性造血器官壞死病毒sn1203株基因組rna對應的cdna序列為genbank:?mt242597.1。

5、在本發(fā)明的實施案例中，所述重組減毒傳染性造血器官壞死病毒具體為如下任一：

6、（a1）ihnvj-nvu；所述ihnvj-nvu與傳染性造血器官壞死病毒sn1203株相比，差別僅在于將傳染性造血器官壞死病毒sn1203株基因組rna中的nv基因替換為傳染性造血器官壞死病毒blk94株基因組rna中的nv基因。

7、（a2）ihnvj-nvau；所述ihnvj-nvu與傳染性造血器官壞死病毒sn1203株相比，差別僅在于將傳染性造血器官壞死病毒sn1203株基因組rna中的nv基因的5’端部分替換為傳染性造血器官壞死病毒blk94株基因組rna中的nv基因的5’端部分。

8、進一步地，所述傳染性造血器官壞死病毒sn1203株基因組rna中的nv基因的核苷酸序列如seq?id?no.1（序列是按照rna從3’到5’的方向列出的，其中t表示尿嘧啶核苷酸）所示；所述傳染性造血器官壞死病毒blk94株基因組rna中的nv基因的核苷酸序列如seq?idno.2（序列是按照rna從3’到5’的方向列出的，其中t表示尿嘧啶核苷酸）所示。相應地，在（a2）中，所述傳染性造血器官壞死病毒sn1203株基因組rna中的nv基因的5’端部分為seqid?no.1的第93-336位（序列是按照rna從3’到5’的方向列出的，其中t表示尿嘧啶核苷酸）；所述傳染性造血器官壞死病毒blk94株基因組rna中的nv基因的5’端部分為seq?id?no.2的第93-336位（序列是按照rna從3’到5’的方向列出的，其中t表示尿嘧啶核苷酸）。

9、更進一步地，在（a1）中，所述ihnvj-nvu與傳染性造血器官壞死病毒sn1203株相比，差別僅在于將傳染性造血器官壞死病毒sn1203株基因組rna中的seq?id?no.1所示的nv基因替換為傳染性造血器官壞死病毒blk94株基因組rna中的seq?id?no.2所示的nv基因。

10、更進一步地，在（a2）中，所述ihnvj-nvau與傳染性造血器官壞死病毒sn1203株相比，差別僅在于將傳染性造血器官壞死病毒sn1203株基因組rna中的seq?id?no.1所示的nv基因的第93-336位替換為傳染性造血器官壞死病毒blk94株基因組rna中的seq?id?no.2所示的nv基因的第93-336位。

11、第二方面，本發(fā)明要求保護一種制備前文第一方面中所述的重組減毒傳染性造血器官壞死病毒的方法。

12、本發(fā)明要求保護的制備前文第一方面中所述的重組減毒傳染性造血器官壞死病毒的方法，可包括如下步驟：將含有所述重組減毒傳染性造血器官壞死病毒的基因組rna對應的cdna序列的重組質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染bhk-21細胞，然后將培養(yǎng)上清接種到epc細胞，從而獲得所述重組減毒傳染性造血器官壞死病毒。

13、進一步地，在所述重組質(zhì)粒中，啟動所述重組傳染性造血器官壞死病毒的基因組rna對應的cdna序列表達的啟動子為t7啟動子。在所述重組質(zhì)粒中，終止所述重組傳染性造血器官壞死病毒的基因組rna對應的cdna序列表達的終止子為t7終止子。

14、進一步地，所述輔助質(zhì)粒共有4個：含有所述傳染性造血器官壞死病毒sn1203株基因組rna中n基因?qū)腸dna序列的輔助質(zhì)粒1；含有所述傳染性造血器官壞死病毒sn1203株基因組rna中p基因?qū)腸dna序列的輔助質(zhì)粒2；含有所述傳染性造血器官壞死病毒sn1203株基因組rna中nv基因?qū)腸dna序列的輔助質(zhì)粒3；含有所述傳染性造血器官壞死病毒sn1203株基因組rna中l(wèi)基因?qū)腸dna序列的輔助質(zhì)粒4。在本發(fā)明的實施案例中，所輔助質(zhì)粒1具體為將rihnv-sn1203?毒株的n基因pcr產(chǎn)物純化后連接入phelp載體后所得；所輔助質(zhì)粒2具體為將rihnv-sn1203?毒株的p基因pcr產(chǎn)物純化后連接入phelp載體后所得；所輔助質(zhì)粒3具體為將rihnv-sn1203?毒株的nv基因pcr產(chǎn)物純化后連接入phelp載體后所得；所輔助質(zhì)粒4具體為將rihnv-sn1203?毒株的l基因pcr產(chǎn)物純化后連接入phelp載體后所得。

15、進一步地，進行所述共轉(zhuǎn)染時，所述重組質(zhì)粒、所述輔助質(zhì)粒1、所述輔助質(zhì)粒2、所述輔助質(zhì)粒3和所述輔助質(zhì)粒4的質(zhì)量配比為2.0?：0.5：0.4：0.4：0.25。

16、進一步地，在所述方法中，轉(zhuǎn)染bhk-21細胞后還包括在37℃孵育7?h后，于15℃培養(yǎng)6天的步驟。然后將培養(yǎng)上清接種到單層epc細胞，當觀察到細胞病變效應后，收獲所述重組減毒傳染性造血器官壞死病毒。

17、第三方面，本發(fā)明要求保護如下任一生物材料：

18、（b1）含有前文第一方面中所述的重組減毒傳染性造血器官壞死病毒的離體動物細胞或重組菌；

19、（b2）含有前文第一方面中所述的重組減毒傳染性造血器官壞死病毒的基因組rna或cdna的載體；

20、（b3）含有前文第一方面中所述的重組減毒傳染性造血器官壞死病毒的疫苗。

21、第四方面，本發(fā)明要求保護如下任一應用：

22、（c1）前文第一方面中所述的重組減毒傳染性造血器官壞死病毒或前文第三方面中所述的生物材料在制備用于預防和/或治療由于傳染性造血器官壞死病毒感染所致疾病的產(chǎn)品中的應用；

23、（c2）前文第一方面中所述的重組減毒傳染性造血器官壞死病毒或前文第三方面中所述的生物材料在制備用于抑制傳染性造血器官壞死病毒感染的產(chǎn)品中的應用。

24、其中，所述產(chǎn)品可為疫苗或藥品。

25、在本發(fā)明的一個實施案例中，所述感染的對象為虹鱒魚。

26、本發(fā)明以ihnv亞群jc模式株sn1203（wtihnvj）全基因組cdna質(zhì)粒pihnvj為骨架，將其g、nv基因單獨或組合的基因片段替換為基因群u模式株blk94（wtihnvu）對應的基因片段，獲得質(zhì)粒pihnvj、pihnvj-gu、pihnvj-nvu、pihnvj-nvau、pihnvj-nvbu、pihnvj-g/nvu、將上述目的質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至細胞中，成功收獲重組嵌合病毒rihnvjrihnvj-gu、rihnvj-nvu、rihnvj-nvau、rihnvj-nvbu、rihnvj-g/nvu。將重組病毒感染虹鱒，其毒力與wtihnvj相比顯著降低，二次感染病毒后發(fā)現(xiàn)重組病毒rihnvj-nvu、rihnvj-nvau對虹鱒具有較好的免疫保護效果，可用于傳染性造血器官壞死病弱毒疫苗的研發(fā)，具有潛在應用價值。