本發(fā)明屬于生物制藥和生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，具體涉及一種塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體、突變體編碼基因、含有該突變體編碼基因的重組載體、含有該突變體編碼基因的重組基因工程菌以及塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體在制備d-塔格糖中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、塔格糖(tagatose)是果糖的一種差向異構(gòu)體，其中五個(gè)碳分子和一個(gè)氧分子形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。它是一種在自然界中存在但較為稀有的天然六碳酮糖，甜味特性與蔗糖相似，而產(chǎn)生的熱量只為蔗糖的三分之一。塔格糖具有低能量、降血糖、改善腸道菌群、抗齲齒等優(yōu)點(diǎn)，因此在醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。

2、塔格糖在自然界中含量極低，目前主要通過(guò)化學(xué)或生物法進(jìn)行合成。化學(xué)法以d-半乳糖為原料，經(jīng)兩步反應(yīng)制備d-塔格糖。然而，化學(xué)法具有反應(yīng)條件劇烈不易控制、易產(chǎn)生污染、工藝復(fù)雜、副產(chǎn)物較多不利于分離純化等缺點(diǎn)。生物法制備d-塔格糖具有綠色環(huán)保、產(chǎn)物單一、分離純化簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，因此成為目前d-塔格糖合成的主要方法。目前主要采用雙酶法，即通過(guò)β-半乳糖苷酶與l-阿拉伯糖異構(gòu)酶雙酶協(xié)同催化乳糖合成d-塔格糖。該方法需要經(jīng)兩步反應(yīng)合成d-塔格糖：首先，β-半乳糖苷酶水解乳糖生成中間產(chǎn)物d-半乳糖，再經(jīng)l-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化合成d-塔格糖。但由于該方法的底物乳糖成本較高，且需要兩步反應(yīng)導(dǎo)致過(guò)程復(fù)雜；同時(shí)，受限于第一步乳糖水解導(dǎo)致底物的利用率較低，進(jìn)一步增加了該方法的成本。因此，尋找其它高效途徑合成d-塔格糖極具研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

3、塔格糖-4-差向異構(gòu)酶（tagatose-4-epimerase）能以廉價(jià)的d-果糖為底物通過(guò)差向異構(gòu)化反應(yīng)合成d-塔格糖，不僅具有環(huán)境友好、分離純化簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和的特點(diǎn)，還具有反應(yīng)單一、成本低等優(yōu)勢(shì)，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的d-塔格糖合成工藝步驟繁瑣、分離純化復(fù)雜、反應(yīng)條件劇烈，不易控制、制備成本高的缺陷，提供了一種塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體、突變體編碼基因、含有該突變體編碼基因的重組載體、含有該突變體編碼基因的重組基因工程菌，并將塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體應(yīng)用于制備d-塔格糖的工藝中。

2、為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、一種塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體，由序列如seq?id?no.1所示氨基酸經(jīng)定點(diǎn)突變而來(lái)，所述突變的位點(diǎn)為下列中的一個(gè)或多個(gè)：（1）第75位、（2）第140位、（3）第165位、（4）第361位。

4、作為優(yōu)選，一種塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體，由序列如seq?id?no.1所示氨基酸經(jīng)定點(diǎn)突變而來(lái)，所述突變的位點(diǎn)為下列中的一個(gè)或多個(gè)：（1）第75位、（2）第140位、（3）第165位、（4）第361位、（5）第69位、（6）第70位。

5、作為優(yōu)選，所述的塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體，由序列如seq?id?no.1所示氨基酸經(jīng)定點(diǎn)突變而來(lái)，所述突變的位點(diǎn)為下列中的一個(gè)或兩個(gè)：（1）第75位、（4）第361位。

6、作為優(yōu)選，所述突變體由序列如seq?id?no.1所示氨基酸經(jīng)下列之一或多個(gè)位點(diǎn)突變而得：（1）第75位谷氨酸突變?yōu)楸彼幔╡75a），（2）第140位脯氨酸突變?yōu)榱涟彼幔╬140l），（3）第165位精氨酸突變?yōu)楸彼幔╮165a），（4）第361位苯丙氨酸突變?yōu)榻M氨酸（f361h）。

7、作為優(yōu)選，所述突變體由序列如seq?id?no.1所示氨基酸經(jīng)下列之一或多個(gè)位點(diǎn)突變而得：（1）第75位谷氨酸突變?yōu)楸彼幔╡75a），（2）第140位脯氨酸突變?yōu)榱涟彼幔╬140l），（3）第165位精氨酸突變?yōu)楸彼幔╮165a），（4）第361位苯丙氨酸突變?yōu)榻M氨酸（f361h），（5）第69位精氨酸突變?yōu)楸彼幔╮69a），（6）第70位天冬酰胺突變?yōu)楸彼幔╪70a）。

8、作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述突變體由序列如seq?id?no.1所示氨基酸經(jīng)第75位谷氨酸突變?yōu)楸彼幔╡75a）、第361位苯丙氨酸突變?yōu)榻M氨酸（f361h）獲得，其氨基酸序列優(yōu)選如seq?id?no.3所示。

9、一種如上所述的塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體編碼基因，所述的塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體編碼基因優(yōu)選如seq?id?no.4?所示。

10、一種由如上所述的編碼基因構(gòu)建的重組載體。

11、一種由如上所述的重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。

12、本發(fā)明所述塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體是通過(guò)對(duì)野生型塔格糖-4-差向異構(gòu)酶進(jìn)行多個(gè)氨基酸的突變，從而提高其相對(duì)酶活。首先，本發(fā)明將野生型塔格糖-4-差向異構(gòu)酶編碼基因(序列如seq?id?no.2所示)與表達(dá)載體pet28a（+）連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。然后將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到e.coli?bl21（de3）中。以含有塔格糖-4-差向異構(gòu)酶編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒為模板，通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行基因改造，然后將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到e.coli?bl21（de3）中，得到含有塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體編碼基因的e.coli?bl21（de3）重組基因工程菌。對(duì)獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，將培養(yǎng)液分離得到含有重組塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體的菌體細(xì)胞，培養(yǎng)液與菌體分離得到塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體粗酶液。將突變體型塔格糖-4-差向異構(gòu)酶與野生型塔格糖-4-差向異構(gòu)酶的相對(duì)活性進(jìn)行比較，篩選得到活性更高的塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體。

13、如上所述的塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體在制備d-塔格糖中的應(yīng)用。

14、作為優(yōu)選，所述的應(yīng)用為：以含塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體經(jīng)超聲破碎后提取的粗酶或純化后的純酶為催化劑，以d-果糖為底物，在ni2+存在下，在ph值為7~9的磷酸鈉緩沖溶液中，70~80℃下反應(yīng)，反應(yīng)完全后，反應(yīng)液分離純化，獲得d-塔格糖。

15、作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述的應(yīng)用為：以含塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體經(jīng)超聲破碎后提取的粗酶或純化后的純酶為催化劑，以d-果糖為底物，以ph值為8的磷酸鈉緩沖溶液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在75℃，1mm?ni2+，1000rpm條件下反應(yīng)，反應(yīng)30min，反應(yīng)液分離純化，獲得d-塔格糖；其中，所述催化劑用量以濕菌體重量計(jì)為40g/l，所述底物的初始濃度為50g/l。

16、本發(fā)明所述含塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體編碼基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體按如下方法制備：將含有塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體編碼基因的重組基因工程菌接種至含有終濃度50μg/ml卡那霉素抗性的lb液體培養(yǎng)基，37℃，180rpm下培養(yǎng)10h，再以體積濃度2%接種量接種至新鮮的含有終濃度50μg/ml卡那霉素抗性的lb液體培養(yǎng)基中，于37℃，180rpm下培養(yǎng)至菌體od600達(dá)0.6-0.8，加入終濃度為0.1mm的iptg，28℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)12h后，4℃、8000rpm離心10min，棄去上清液，收集濕菌體。

17、本發(fā)明所述突變體型塔格糖-4-差向異構(gòu)酶粗酶的制備：將含塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體編碼基因的重組基因工程菌濕菌體按照0.2g濕菌體加9.8ml、50mm、ph7.0的磷酸鈉緩沖溶液重懸濕菌體，冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎（200w功率，持續(xù)1s，間歇2s，連續(xù)破碎15min），獲得細(xì)胞破碎液。將超聲破碎后獲得的細(xì)胞破碎液于8000rpm、4℃離心10min，所得到的上清即為所需的粗酶液。

18、因此，本發(fā)明具有以下有益效果：

19、本發(fā)明制備得到了對(duì)d-塔格糖具有高催化活力、高立體選擇性的塔格糖-4-差向異構(gòu)酶突變體，所得突變體具有反應(yīng)條件溫和、綠色環(huán)保、產(chǎn)物單一、分離純化簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。