本發(fā)明屬于生物分析與檢測(cè)，具體涉及一種硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、臨床不孕癥是育齡夫婦面臨的一個(gè)普遍問(wèn)題，影響著相當(dāng)一部分人群，而男性因素在不孕癥案例中占有較大比例。根據(jù)臨床指南，對(duì)不孕夫婦進(jìn)行初步檢查時(shí)，精液質(zhì)量的分析是必不可少的環(huán)節(jié)；這一評(píng)估涵蓋了多個(gè)精液參數(shù)，如精液量、精子密度、活動(dòng)力以及形態(tài)等。盡管如此，仍有大量不育男性被歸類(lèi)為特發(fā)性不孕癥或無(wú)法確定具體原因，這類(lèi)不明原因的受精失敗仍然是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。遺憾的是，當(dāng)前臨床上仍缺乏可靠的病因?qū)W指標(biāo)來(lái)有效評(píng)估不孕男性的精子樣本。

2、精子可以利用氧化磷酸化(oxphos)和無(wú)氧糖酵解來(lái)合成三磷酸腺苷(atp)，為受精過(guò)程提供能量；精子面臨著ph值和o2含量等持續(xù)變化環(huán)境因素的影響。因此，在外部壓力下保持穩(wěn)定的能量獲取對(duì)于精子的成功受精至關(guān)重要。

3、硝基還原酶(ntr)是一種黃素還原酶，能夠在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)存在下將硝基芳香化合物還原為羥胺或氨基化合物。大量研究表明，缺氧可以導(dǎo)致硝基還原酶的表達(dá)增加，氧含量也影響精子的能量代謝。因此，ntr的變化能夠指示缺氧精子的代謝活性，開(kāi)發(fā)一種有效的檢測(cè)ntr的方法在不育精子的檢測(cè)中具有重要意義。

4、如何利用小分子熒光探針的非侵入性和可調(diào)節(jié)功能的優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)一種新型的、高特異性的硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針并將其用于制備檢測(cè)人類(lèi)精子以及活細(xì)胞中的硝基還原酶的試劑盒成為了研究領(lǐng)域的一大需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，該熒光探針對(duì)識(shí)別底物具有高度專一性和靈敏性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)缺氧細(xì)胞和精子中硝基還原酶含量變化的檢測(cè)。

2、為達(dá)到上述目的所采取的技術(shù)方案是，提供一種硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針，硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針具有如式i所示結(jié)構(gòu)：

3、

4、本發(fā)明還提供硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

5、(1)將2,4-二氯嘌呤及1-溴丙烷溶于有機(jī)溶劑中，在催化劑的作用下反應(yīng)，得第一中間體；

6、(2)將第一中間體及二甲胺溶于有機(jī)溶劑中，在催化劑的作用下反應(yīng)，得第二中間體；

7、(3)將第二中間體進(jìn)行vilsmeier反應(yīng)，得第三中間體；

8、(4)將第三中間體及4-甲基吡啶溶于有機(jī)溶劑中，在催化劑的作用下進(jìn)行回流反應(yīng)，得到第四中間體；

9、(5)將第四中間體和對(duì)硝基溴化芐溶解于有機(jī)溶劑中進(jìn)行回流反應(yīng)，即得如式i所示的硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針；其合成路線如下：

10、

11、優(yōu)選的，步驟(1)中有機(jī)溶劑為二甲基亞砜，反應(yīng)溫度為70～90℃，時(shí)間為5～7h；步驟(2)中二甲胺為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35～45％的二甲胺水溶液，有機(jī)溶劑為n,n-二甲基甲酰胺，反應(yīng)溫度為90～110℃，時(shí)間為45～50h；步驟(1)及步驟(2)中催化劑均為碳酸鉀。

12、更優(yōu)選的，步驟(1)反應(yīng)溫度為80℃，時(shí)間為6h；步驟(2)中二甲胺為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40％的二甲胺水溶液，反應(yīng)溫度為100℃，時(shí)間為48h。

13、更優(yōu)選的，步驟(1)中2,4-二氯嘌呤、1-溴丙烷及催化劑的摩爾比為1:6:1.5。

14、更優(yōu)選的，步驟(2)中第一中間體、二甲胺及催化劑的摩爾比為1:8:3。

15、優(yōu)選的，步驟(3)包括以下步驟：將n,n-二甲基甲酰胺置于-2～2℃下冷卻10～30min后，滴入三氯氧磷，于-2～2℃下攪拌25～35min后升溫至75～85℃，得vilsmeier試劑；用n,n-二甲基甲酰胺溶解第二中間體后滴入vilsmeier試劑中，于75～85℃攪拌反應(yīng)22～26h，得第三中間體。

16、更優(yōu)選的，步驟(3)包括以下步驟：將n,n-二甲基甲酰胺置于0℃下冷卻30min后，滴入三氯氧磷，于0℃下攪拌30min后升溫至80℃，得vilsmeier試劑；用n,n-二甲基甲酰胺溶解第二中間體后滴入vilsmeier試劑中，于80℃攪拌反應(yīng)24h，得第三中間體。

17、更優(yōu)選的，步驟(3)中第二中間體、三氯氧磷及vilsmeier試劑中的n,n-二甲基甲酰胺的摩爾比為1:10:15。

18、優(yōu)選的，步驟(4)中有機(jī)溶劑為n,n-二甲基甲酰胺，催化劑為叔丁醇鉀，反應(yīng)時(shí)間2～4h；步驟(5)中有機(jī)溶劑為甲苯，反應(yīng)時(shí)間8～12h。

19、優(yōu)選的，步驟(4)反應(yīng)時(shí)間3h；步驟(5)反應(yīng)時(shí)間12h。

20、更優(yōu)選的，步驟(4)中第三中間體、4-甲基吡啶及催化劑的摩爾比為1:2:3。

21、更優(yōu)選的，步驟(5)中第四中間體及對(duì)硝基溴化芐的摩爾比為1:1.5。

22、本發(fā)明還提供上述硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針在制備精子硝基還原酶檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

23、本發(fā)明還提供上述硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針在制備細(xì)胞缺氧檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

24、本發(fā)明還提供一種精子硝基還原酶檢測(cè)試劑盒，包括硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針。

25、本發(fā)明還提供一種細(xì)胞缺氧檢測(cè)試劑盒，包括硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針。

26、本發(fā)明采用上述技術(shù)方案的有益效果為：精子硝基還原酶檢測(cè)試劑盒使用過(guò)程中，硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針需要在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在下與硝基還原酶反應(yīng)，并發(fā)出綠色熒光；精子中硝基還原酶水平的檢測(cè)試劑是活體精子熒光成像水平上的檢測(cè)試劑，檢測(cè)試劑在活體精子熒光成像水平上檢測(cè)精子硝基還原酶的方法包括激光共聚焦拍照技術(shù)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)。此外，精子硝基還原酶檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞缺氧檢測(cè)試劑盒使用過(guò)程中，硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針的使用濃度為5μm。

27、本發(fā)明具有以下有益效果：

28、(1)本發(fā)明首次將嘌呤熒光骨架開(kāi)發(fā)為缺氧識(shí)別的熒光探針，其中識(shí)別底物為硝基還原酶；該探針在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸存在下，可與硝基還原酶反應(yīng)產(chǎn)生綠色熒光；該探針在與缺氧的細(xì)胞和精子共孵育后能發(fā)出綠色熒光，實(shí)現(xiàn)了對(duì)缺氧細(xì)胞和精子的生物成像，具有顯著的選擇性及檢測(cè)靈敏強(qiáng)度。

29、(2)本發(fā)明所提供的試劑盒成功的用于不育癥病人精子樣本的流式細(xì)胞術(shù)染色實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)精子樣本的檢測(cè)；相較于正常受試者精子樣本，不育癥病人精子在缺氧后硝基還原酶并未出現(xiàn)表達(dá)升高；本發(fā)明首次將硝基還原酶活性作為男性不育癥的檢測(cè)指標(biāo)，為男性不孕在精子病理生理學(xué)中提供有效的理論參考。

技術(shù)特征：

1.一種硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針，其特征在于，所述硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針具有如式i所示結(jié)構(gòu)：

2.權(quán)利要求1所述的硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

3.如權(quán)利要求2所述的硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中有機(jī)溶劑為二甲基亞砜，反應(yīng)溫度為70～90℃，時(shí)間為5～7h；所述步驟(2)中二甲胺為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35～45％的二甲胺水溶液，有機(jī)溶劑為n,n-二甲基甲酰胺，反應(yīng)溫度為90～110℃，時(shí)間為45～50h；所述步驟(1)及步驟(2)中催化劑均為碳酸鉀。

4.如權(quán)利要求2所述的硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)包括以下步驟：將n,n-二甲基甲酰胺置于-2～2℃下冷卻10～30min后，滴入三氯氧磷，于-2～2℃下攪拌25～35min后升溫至75～85℃，得vilsmeier試劑；用n,n-二甲基甲酰胺溶解第二中間體后滴入vilsmeier試劑中，于75～85℃攪拌反應(yīng)22～26h，得第三中間體。

5.如權(quán)利要求2所述的硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中有機(jī)溶劑為n,n-二甲基甲酰胺，催化劑為叔丁醇鉀，反應(yīng)時(shí)間2～4h；所述步驟(5)中有機(jī)溶劑為甲苯，反應(yīng)時(shí)間8～12h。

6.權(quán)利要求1所述的硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針在制備精子硝基還原酶檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

7.權(quán)利要求1所述的硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針在制備細(xì)胞缺氧檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

8.一種精子硝基還原酶檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針。

9.一種細(xì)胞缺氧檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物分析與檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針具有如式I所示的結(jié)構(gòu)；本發(fā)明還提供該硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的硝基還原酶響應(yīng)型熒光探針在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在下可與硝基還原酶反應(yīng)并發(fā)出綠色熒光，具有高度專一性和靈敏性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)缺氧細(xì)胞和精子中硝基還原酶含量變化的檢測(cè)。

技術(shù)研發(fā)人員：于抗抗,李坤,雷林,吳思嫻,許文明,余孝其
受保護(hù)的技術(shù)使用者：四川大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15