本發(fā)明屬于代謝工程和合成生物學(xué)，具體涉及高產(chǎn)可發(fā)酵糖的嗜甲烷基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、可發(fā)酵糖是指能夠被微生物轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物的一類糖類，主要包括蔗糖、葡萄糖和果糖等糖類物質(zhì)，作為一種可再生能源和原材料，可發(fā)酵糖已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品、農(nóng)業(yè)及化工產(chǎn)業(yè)中。

2、當(dāng)前，可發(fā)酵糖的生產(chǎn)主要來(lái)自農(nóng)業(yè)種植，例如通過壓榨甘蔗或甜菜獲得含糖汁液，經(jīng)磷酸鈣處理去除雜質(zhì)，過濾，濃縮結(jié)晶精煉，得到蔗糖，蔗糖再通過進(jìn)一步分解制備果糖和葡萄糖。這種生產(chǎn)方式存在以下問題：1）產(chǎn)量和質(zhì)量不穩(wěn)定。生產(chǎn)周期長(zhǎng)，占地面積大，資源利用率低，易受到氣候影響；通過蔗糖分解制備葡萄糖和果糖需要消耗大量的酵素，同時(shí)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化效率較低，難以得到高純度的果糖和葡萄糖；2）環(huán)境污染嚴(yán)重。提取精煉過程需要消耗大量的化學(xué)試劑并產(chǎn)生大量的廢水和固體廢棄物，對(duì)環(huán)境造成污染。因此迫切需要一種能夠高產(chǎn)可發(fā)酵糖且能夠減少環(huán)境污染的方式。

3、甲烷是一種重要的能源資源和溫室氣體，是天然氣、頁(yè)巖氣、沼氣等的主要成分，有效利用甲烷對(duì)于全球氣候變化具有重要影響。隨著生物技術(shù)，尤其是合成生物學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，生物制造正在以全新的生產(chǎn)方式重塑制造業(yè)。微生物發(fā)酵生產(chǎn)可發(fā)酵糖具有明顯的優(yōu)勢(shì)：微生物繁殖快、生長(zhǎng)條件溫和、生長(zhǎng)周期短、能在短時(shí)間內(nèi)累積大量的生物量、生產(chǎn)成本低且易于改造等。但是目前尚未有通過微生物將甲烷轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供高產(chǎn)可發(fā)酵糖的嗜甲烷基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，用以解決傳統(tǒng)可發(fā)酵糖生產(chǎn)工藝產(chǎn)量、質(zhì)量不穩(wěn)定，環(huán)境污染嚴(yán)重的技術(shù)問題。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

3、本發(fā)明的第一個(gè)方面，公開了高產(chǎn)可發(fā)酵糖的嗜甲烷基因工程菌，通過在好氧性嗜甲烷菌中表達(dá)生產(chǎn)可發(fā)酵糖的基因，得到高產(chǎn)可發(fā)酵糖的嗜甲烷基因工程菌；

4、其中，所述可發(fā)酵糖為蔗糖、果糖或葡萄糖。

5、優(yōu)選地，所述好氧性嗜甲烷菌為 methylotuvimicrobium?buryatense5gb1、 methylomicrobium?alcaliphilum20z、 alkalicoccus?glycogeneswonf2802，或胞外多聚物甲烷圖瓦微菌（ methylotuvimicrobium?sanxanigenens）ng09。 alkalicoccus? glycogeneswonf2802的保藏編號(hào)為cgmcc?no.28614；胞外多聚物甲烷圖瓦微菌（ methylotuvimicrobium?sanxanigenens）ng09，保藏編號(hào)為cgmcc?no.30951。

6、優(yōu)選地，當(dāng)可發(fā)酵糖為蔗糖時(shí)，通過同源重組的方法，在好氧性嗜甲烷菌的 ams位點(diǎn)導(dǎo)入外源蔗糖透性酶基因 cscb，得到高產(chǎn)蔗糖的嗜甲烷基因工程菌。

7、優(yōu)選地，當(dāng)可發(fā)酵糖為果糖時(shí)，通過同源重組的方法，在好氧性嗜甲烷菌的 frk位點(diǎn)導(dǎo)入內(nèi)源α-淀粉酶基因 ams，得到高產(chǎn)果糖的嗜甲烷基因工程菌。

8、優(yōu)選地，當(dāng)可發(fā)酵糖為葡萄糖時(shí)，通過同源重組的方法，在好氧性嗜甲烷菌的 ams位點(diǎn)導(dǎo)入外源蔗糖透性酶基因 cscb，得到高產(chǎn)蔗糖的嗜甲烷基因工程菌；在高產(chǎn)蔗糖的嗜甲烷基因工程菌的 gm位點(diǎn)導(dǎo)入外源胞外蔗糖水解酶基因 sacc，得到嗜甲烷菌工程菌g01；將重組質(zhì)粒pawp89- gi轉(zhuǎn)入嗜甲烷菌工程菌g01中，得到高產(chǎn)葡萄糖的嗜甲烷基因工程菌。

9、本發(fā)明的第二個(gè)方面，公開了上述高產(chǎn)可發(fā)酵糖的嗜甲烷基因工程菌在生產(chǎn)可發(fā)酵糖中的應(yīng)用。

10、本發(fā)明的第三個(gè)方面，公開了一種生產(chǎn)可發(fā)酵糖的方法，將上述高產(chǎn)可發(fā)酵糖的嗜甲烷基因工程菌接種于無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到可發(fā)酵糖；

11、其中，所述可發(fā)酵糖為蔗糖、果糖或葡萄糖。

12、優(yōu)選地，發(fā)酵至24?h時(shí)，將無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中nacl的濃度提高1%~5%，繼續(xù)發(fā)酵。

13、優(yōu)選地，發(fā)酵過程中持續(xù)通入甲烷進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

14、本發(fā)明的第四個(gè)方面，公開了上述方法得到的可發(fā)酵糖作為碳源在微生物發(fā)酵中的應(yīng)用。

15、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

16、本發(fā)明提供的高產(chǎn)可發(fā)酵糖的嗜甲烷基因工程菌，以具有生長(zhǎng)速度快，遺傳改造成熟等特點(diǎn)的好氧性嗜甲烷菌作為宿主菌，通過對(duì)好氧性嗜甲烷菌體內(nèi)的糖代謝路徑進(jìn)行遺傳改造，構(gòu)建高產(chǎn)可發(fā)酵糖的嗜甲烷基因工程菌。該嗜甲烷基因工程菌以甲烷為唯一碳源和能源生產(chǎn)可發(fā)酵糖，能將甲烷轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖，有效提高了利用甲烷合成可發(fā)酵糖的得率和效率，拓寬了糖類供應(yīng)來(lái)源，建立了可持續(xù)、低成本、不受區(qū)域限制的原料糖制備新路線，對(duì)于降低原料成本、促進(jìn)生物煉制技術(shù)體系產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程具有重要意義，為發(fā)酵糖的商業(yè)化生產(chǎn)提供一種低碳生物合成新途徑，具有很好的工業(yè)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用前景，將其應(yīng)用在可發(fā)酵糖的生產(chǎn)中，能夠?qū)崿F(xiàn)嗜甲烷菌利用甲烷合成可發(fā)酵糖。

17、進(jìn)一步地，生產(chǎn)蔗糖時(shí)，通過敲除宿主菌（好氧性嗜甲烷菌）中的 ams基因，以阻斷蔗糖的分解；導(dǎo)入蔗糖透性酶基因 cscb，將胞內(nèi)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，使得到的嗜甲烷基因工程菌能夠以甲烷為唯一碳源和能源，高產(chǎn)蔗糖。

18、進(jìn)一步地，生產(chǎn)果糖時(shí)，通過敲除宿主菌（好氧性嗜甲烷菌）中的 frk基因，以阻斷果糖被轉(zhuǎn)化為果糖激酶；導(dǎo)入內(nèi)源α-淀粉酶基因 ams，以強(qiáng)化果糖合成前體的供應(yīng)，使得到的嗜甲烷基因工程菌能夠以甲烷為唯一碳源和能源，高產(chǎn)果糖。

19、進(jìn)一步地，生產(chǎn)葡萄糖時(shí)，通過在宿主菌（好氧性嗜甲烷菌）中敲除 ams基因，導(dǎo)入蔗糖透性酶基因 cscb，構(gòu)建能高產(chǎn)蔗糖的嗜甲烷基因工程菌；然后以高產(chǎn)蔗糖的嗜甲烷基因工程菌為宿主菌，敲除其中的 gm基因，導(dǎo)入外源胞外蔗糖水解酶基因 sacc及葡萄糖異構(gòu)酶基因 gi，使得到的嗜甲烷基因工程菌能夠以甲烷為唯一碳源和能源，高產(chǎn)葡萄糖。在該糖代謝路徑中，利用蔗糖生產(chǎn)葡萄糖，能夠縮短反應(yīng)路徑，提高生產(chǎn)效率。

20、本發(fā)明提供的一種生產(chǎn)可發(fā)酵糖的方法，將高產(chǎn)可發(fā)酵糖的嗜甲烷基因工程菌接種于無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，通過在發(fā)酵至24?h時(shí)提高無(wú)機(jī)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基中nacl的濃度，能夠提高可發(fā)酵糖的產(chǎn)量。