本技術(shù)涉及一種用d-木糖生物合成尿囊素的方法，屬于代謝工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、尿囊素是衍生自嘌呤分解代謝途徑的雜環(huán)氮化合物。它是一種重要的精細化學(xué)品，在制藥、化妝品和農(nóng)業(yè)工業(yè)領(lǐng)域具有許多應(yīng)用。在醫(yī)藥方面：尿囊素具有促進細胞生長，加快傷口愈合，軟化角質(zhì)蛋白等生理功能，是皮膚創(chuàng)傷的良好愈合劑和抗?jié)兯巹?，可用作緩解和治療皮膚干燥癥、鱗屑性膚疾患、皮膚潰瘍、消化道潰瘍及炎癥，對骨髓炎、糖尿病、肝硬化、痤瘡均有較好療效。在化妝品方面：由于尿囊素是一種兩性化合物，能結(jié)合多種物質(zhì)形成復(fù)鹽，具有避光、殺菌防腐、止痛、抗氧化作用，能使皮膚保持水份，滋潤和柔軟，是美容美發(fā)等化妝品的特效添加劑，促進組織生長、細胞新陳代謝，軟化角質(zhì)層蛋白。在農(nóng)業(yè)方面：尿囊素是優(yōu)良的植物生長調(diào)節(jié)劑，可刺激植物生長，對小麥、柑桔、水稻、蔬菜、大豆等均有顯著增產(chǎn)效果，并有固果，早熟作用。此外，尿囊素也是生產(chǎn)各種復(fù)合肥料(包括慢效肥料和微量元素肥料)必不可少的原料。

2、尿囊素主要通過從植物內(nèi)提取或化學(xué)合成生產(chǎn)。由于成本和環(huán)境問題，更需要探索從可再生原料中生物合成尿囊素的方法——綠色生物制造，這種方法是以微生物為主體，核心是酶催化技術(shù)和微生物發(fā)酵技術(shù)，利用基因改造等技術(shù)可以充分利用工業(yè)生產(chǎn)的側(cè)線產(chǎn)品及廢棄物，使之轉(zhuǎn)化成為預(yù)期產(chǎn)物，如飼料、食品、藥品、能源、復(fù)合材料等具有高附加值的工業(yè)產(chǎn)品，是“原料綠色、過程綠色、產(chǎn)品綠色”的新型制造業(yè)，即生產(chǎn)過程中只需給予穩(wěn)定碳源(葡萄糖、乳糖等糖類)。生產(chǎn)過程也不會產(chǎn)生任何有害物質(zhì)以及最終產(chǎn)品也是綠色安全的。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述問題，本發(fā)明旨在提供一種利用d-木糖生物合成尿囊素的方法。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

3、一種利用d-木糖生物合成尿囊素的方法，其是以大腸桿菌為底盤宿主菌，通過過表達黃嘌呤脫氫酶基因xdha、黃嘌呤脫氫酶基因xdhb、黃嘌呤脫氫酶基因xdhc、尿酸降解雙功能蛋白基因pucl和5-羥基異尿酸水解酶基因pucm，構(gòu)建由d-木糖生物合成尿囊素的途徑；通過過過表達s-腺苷甲硫氨酸合酶基因metk、(r)-s-腺苷-l-蛋氨酸水解酶基因rsamh、腺苷脫氨酶基因add和嘌呤核苷磷酸化酶基因xapa基因，以提高大腸桿菌利用d-木糖生物合成尿囊素的中間產(chǎn)物次黃嘌呤的積累，進而提高尿囊素的產(chǎn)量，實現(xiàn)利用d-木糖高效生物合成尿囊素。

4、進一步的，上述方法包括以下步驟：

5、s1：構(gòu)建過表達黃嘌呤脫氫酶基因xdha、黃嘌呤脫氫酶基因xdhb和黃嘌呤脫氫酶基因xdhc的重組質(zhì)粒pet-xdhabc；構(gòu)建過表達尿酸降解雙功能蛋白基因pucl和5-羥基異尿酸水解酶基因pucm的重組質(zhì)粒prsf-puclm；構(gòu)建過表達s-腺苷甲硫氨酸合酶基因metk、(r)-s-腺苷-l-蛋氨酸水解酶基因rsamh、腺苷脫氨酶基因add和嘌呤核苷磷酸化酶基因xapa基因的重組質(zhì)粒pacyc-metk-rsamh-add-xapa；

6、s2：將重組質(zhì)粒pet-xdhabc、重組質(zhì)粒prsf-puclm和重組質(zhì)粒pacyc-metk-rsamh-add-xapa同時轉(zhuǎn)化至e.coli?jm109(de3)，得重組菌e.coli?jm109(de3)(pet-xdhabc；prsf-puclm；pacyc-metk-rsamh-add-xapa)；

7、s3：將重組菌e.coli?jm109(de3)(pet-xdhabc；prsf-puclm；pacyc-metk-rsamh-add-xapa)在含d-木糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，得含有尿囊素的發(fā)酵產(chǎn)物。

8、進一步的，上述方法還包括：通過敲除次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因hpt和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因apt，以實現(xiàn)碳源的合理控制，進而提高大腸桿菌的d-木糖產(chǎn)尿囊素得率，最終實現(xiàn)利用d-木糖高效生物合成尿囊素。

9、進一步的，上述方法包括以下步驟：

10、s1：構(gòu)建過表達黃嘌呤脫氫酶基因xdha、黃嘌呤脫氫酶基因xdhb和黃嘌呤脫氫酶基因xdhc的重組質(zhì)粒pet-xdhabc；構(gòu)建過表達尿酸降解雙功能蛋白基因pucl和5-羥基異尿酸水解酶基因pucm的重組質(zhì)粒prsf-puclm；構(gòu)建過表達s-腺苷甲硫氨酸合酶基因metk、(r)-s-腺苷-l-蛋氨酸水解酶基因rsamh、腺苷脫氨酶基因add和嘌呤核苷磷酸化酶基因xapa基因的重組質(zhì)粒pacyc-metk-rsamh-add-xapa；

11、s2：以e.coli?jm109?de3為底盤宿主菌，利用λ-red同源重組技術(shù)依次敲除次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因hpt、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因apt，得重組菌e.coli?jm109(de3)(δhpt；δapt)；將重組質(zhì)粒pet-xdhabc、重組質(zhì)粒prsf-puclm和重組質(zhì)粒pacyc-metk-rsamh-add-xapa同時轉(zhuǎn)化至e.coli?jm109(de3)(δhpt；δapt)，得重組菌e.coli?jm109(de3)(pet-xdhabc；prsf-puclm；pacyc-metk-rsamh-add-xapa；δhpt；δapt)；

12、s3：將重組菌e.coli?jm109(de3)(pet-xdhabc；prsf-puclm；pacyc-metk-rsamh-add-xapa；δhpt；δapt)在含d-木糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，得含有尿囊素的發(fā)酵產(chǎn)物。

13、進一步的，上述黃嘌呤脫氫酶基因xdha的序列號是wp_008146355.1，上述黃嘌呤脫氫酶基因xdhb的序列號是wp_008091634.1，上述黃嘌呤脫氫酶基因xdhc的序列號是wp_003254321.1，上述尿酸降解雙功能蛋白基因pucl的序列號是xp_020071435.1，上述5-羥基異尿酸水解酶基因pucm的序列號是xp_020071389.1，上述s-腺苷甲硫氨酸合酶基因metk的序列號是wp_001062128.1，上述(r)-s-腺苷-l-蛋氨酸水解酶基因rsamh的序列號是wp_011905304.1，上述腺苷脫氨酶基因add的序列號是wp_000567490.1，上述嘌呤核苷磷酸化酶基因xapa的序列號是wp_000084573.1，上述次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因hpt的序列號是np_414667.4，上述腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因apt的序列號是np_415002.1。

14、進一步的，上述發(fā)酵培養(yǎng)的方法為：將e重組菌在lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至指數(shù)生長期，隨后，按2vol％的接種量轉(zhuǎn)接到裝有50ml含20g/l?d-木糖和10mm?l-甲硫氨酸的m9y培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，加入終濃度0.08m的iptg，在25℃、220rmp發(fā)酵培養(yǎng)。

15、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

16、本發(fā)明證明了大腸桿菌以d-木糖為底物生物合成尿囊素的能力。為了克服細胞生長慢、碳分配不均、關(guān)鍵酶的不穩(wěn)定、產(chǎn)量低等挑戰(zhàn)，本發(fā)明采用了多方面的方法，這包括碳通量重定向、發(fā)酵條件優(yōu)化，最終使尿囊素的產(chǎn)量和得率得到明顯提高。