本發(fā)明屬于單克隆抗體領(lǐng)域，具體涉及大口黑鱸cd6抗原結(jié)合肽、及其單克隆抗體和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

0、技術(shù)背景

1、大口黑鱸（micropterus?salmoides）又名加州鱸，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大、集約化程度的不斷提高，大口黑鱸疾病日趨嚴(yán)重，尤其是由唯氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等革蘭氏陰性菌引起的細(xì)菌病，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，除了使用抗生素外尚無其他有效辦法，嚴(yán)重的制約了該養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

2、清道夫受體富半胱氨酸超家族（srcr-sf）是先天性免疫系統(tǒng)中一類重要的模式識別受體(pattern?recognition?receptor，prr)，通過識別各種不同來源的病原相關(guān)分子模式(pamps)發(fā)揮廣泛的生物功能。cd6屬于b型srcr-sf，是淋巴細(xì)胞特異性表面受體，主要表達(dá)于t細(xì)胞和b-1細(xì)胞細(xì)胞膜上,能與許多pamps（如革蘭氏陰性菌lps等）相互作用，在機(jī)體抗細(xì)菌感染中發(fā)揮著重要的免疫識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。srcr-sf蛋白發(fā)揮識別功能是通過其srcr結(jié)構(gòu)域與pamps結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。作為典型的b型srcr家族蛋白，人類cd163a和dmbt-1的srcr結(jié)構(gòu)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個保守的線性結(jié)合基序vevlxxxxw，是細(xì)菌結(jié)合的特定位點(diǎn)。但是大口黑鱸cd6的細(xì)菌結(jié)合肽段的功能研究仍為空白。因此，亟需開展大口黑鱸cd6與革蘭氏陰性菌lps的結(jié)合肽段的鑒定及其互作研究，對大口黑鱸抗病品種培育及靶向藥物的研發(fā)具有重要意義。

3、針對魚類病原菌受體的抗體開發(fā)，旨在通過設(shè)計(jì)和制備特異性抗體來干預(yù)細(xì)菌和宿主細(xì)胞的相互作用，從而抑制感染。同時，通過fc段激活魚體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對細(xì)菌的清除。此外，可以作為疫苗的補(bǔ)充策略，增強(qiáng)免疫效果；并開發(fā)基于抗體的快速檢測試劑，用于細(xì)菌感染的早期診斷。與傳統(tǒng)抗生素等相比，抗體療法不易引發(fā)耐藥性，為多重耐藥菌感染提供了新選擇，是預(yù)防和治療大口黑鱸病害的重要手段，也是未來魚類疾病防控的主流方向。

4、基于目前無大口黑鱸病原菌受體抗體的現(xiàn)狀，申請人利用序列比對預(yù)測得到兩段cd6細(xì)菌結(jié)合多肽基序，構(gòu)建并表達(dá)缺失以上結(jié)合多肽的重組蛋白，通過表面等離子共振技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證篩選。進(jìn)一步基于上述篩選出的lps結(jié)合肽段pd2作為抗原免疫小鼠并篩選得到了一株可特異性分泌鼠抗大口黑鱸cd6制備單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株mscd6-29a。本發(fā)明首次提供了特異性好、效價(jià)高、反應(yīng)靈敏、親和力強(qiáng)的大口黑鱸cd6單克隆抗體。該抗體可用于革蘭氏陰性菌感染的快速檢測和治療，并能幫助開發(fā)抗菌靶向藥物，特別是在多重耐藥性細(xì)菌感染的治療中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供了大口黑鱸cd6抗原結(jié)合肽，所述結(jié)合肽的氨基酸序列為seq?id?no.5所示。

2、本發(fā)明另一個目的在于提供了利用上述抗原結(jié)合肽制備的單克隆抗體。

3、本發(fā)明的最后一個目的在于提供了上述結(jié)合肽或單克隆抗體的應(yīng)用。

4、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

5、申請人自ncbi中選取不同物種的cd6序列，通過smart、meme、clustalw以及mega6.0軟件，多序列比對分析了大口黑鱸cd6與哺乳動物以及爬行類cd6胞外保守細(xì)菌結(jié)合肽段pd1和pd2的同源性，進(jìn)一步通過表面等離子共振檢測cd6與lps的結(jié)合基序?yàn)閏sgkveihrngswgtvc，即seq?id?no.5所示。

6、本發(fā)明的保護(hù)范圍包括：

7、seq?id?no.5所述肽段與蛋白標(biāo)簽融合得到的融合蛋白。

8、以上所述的融合蛋白，優(yōu)選的，為seq?id?no.6所示。

9、seq?id?no.5所述肽段或上述融合蛋白的編碼基因。

10、具有上述編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或離體的重組細(xì)胞。

11、利用上述肽段、融合蛋白、上述編碼基因，具有上述編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或離體的重組細(xì)胞制備的雜交瘤細(xì)胞株。

12、以上所述的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編號為：cctcc?no:c202587。

13、利用上述肽段、融合蛋白上述編碼基因，具有上述編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或離體的重組細(xì)胞制備的單克隆抗體。

14、以上所述的單克隆抗體，優(yōu)選的，為保藏編號為：cctcc?no:c202587的雜交瘤細(xì)胞分泌得到。

15、以上所述的雜交瘤細(xì)胞株或分泌的單克隆抗體在大口黑鱸cd6+分型中的應(yīng)用。

16、以上所述的雜交瘤細(xì)胞株或分泌的單克隆抗體在制備治療或預(yù)防大口黑鱸革蘭氏陰性菌感染的藥物中的應(yīng)用。

17、以上所述的雜交瘤細(xì)胞株或分泌的單克隆抗體在制備非治療性革蘭氏陰性菌體外抑制劑中的應(yīng)用。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

19、1.?本發(fā)明首次篩選出了大口黑鱸cd6與革蘭氏陰性菌lps的結(jié)合位點(diǎn)。

20、2.?本發(fā)明首次提供了特異性好、效價(jià)高、反應(yīng)靈敏、親和力強(qiáng)的大口黑鱸cd6單克隆抗體。

21、3.?本發(fā)明制備的大口黑鱸cd6單克隆抗體可以有效抑制細(xì)菌的增殖，同時可以用于大口黑鱸cd6+的分型。

技術(shù)特征：

1.?大口黑鱸cd6抗原結(jié)合肽，所述結(jié)合肽的氨基酸序列為seq?id?no.5所示。

2.?seq?id?no.5所述肽段與蛋白標(biāo)簽融合得到的融合蛋白。

3.?seq?id?no.5所述肽段或權(quán)利要求2所述融合蛋白的編碼基因。

4.具有權(quán)利要求3所述編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或離體的重組細(xì)胞。

5.利用權(quán)利要求1所述肽段、權(quán)利要求2所述融合蛋白、權(quán)利要求3所述編碼基因，具有權(quán)利要求3所述編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或離體的重組細(xì)胞制備的雜交瘤細(xì)胞株。

6.利用權(quán)利要求1所述肽段、權(quán)利要求2所述融合蛋白、權(quán)利要求3所述編碼基因，具有權(quán)利要求3所述編碼基因的表達(dá)盒、重組載體、重組微生物或離體的重組細(xì)胞制備的單克隆抗體。

7.?根據(jù)權(quán)利要求5所述的雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編號為：cctcc?no:c202587。

8.由權(quán)利要求7所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體。

9.權(quán)利要求7所述的雜交瘤細(xì)胞株或其分泌的單克隆抗體在大口黑鱸cd6+分型中的應(yīng)用。

10.權(quán)利要求7所述的雜交瘤細(xì)胞株或其分泌的單克隆抗體在制備治療或預(yù)防大口黑鱸革蘭氏陰性菌感染的藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于單克隆抗體技術(shù)領(lǐng)域，公開了大口黑鱸CD6抗原結(jié)合肽、及其單克隆抗體和應(yīng)用。本發(fā)明對大口黑鱸CD6的LPS結(jié)合肽段基序進(jìn)行了預(yù)測和重組突變蛋白表達(dá)，并通過表面等離子共振技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證篩選。進(jìn)一步基于上述篩選出的LPS結(jié)合肽段PD2作為抗原免疫小鼠并篩選得到了一株可特異性分泌鼠抗大口黑鱸CD6制備單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株MsCD6?29A。CD6單克隆抗體封閉大口黑鱸腎臟白細(xì)胞后，可顯著降低細(xì)菌的增殖。本發(fā)明首次提供了特異性好、效價(jià)高、反應(yīng)靈敏、親和力強(qiáng)的大口黑鱸CD6單克隆抗體。

技術(shù)研發(fā)人員：李逸群,張飛翔,范玉頂,周勇,江南,黃振宇
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15