本發(fā)明涉及生物技術(shù)和蛋白質(zhì)制備純化領(lǐng)域，具體地，涉及一種新型高純度、高活性cas酶及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、crispr-cas系統(tǒng)是近年來新開發(fā)的一種新型核酸檢測技術(shù)，在病原體檢測方面得到廣泛應(yīng)用。相對于其他基于pcr的檢測技術(shù)，基于crispr/cas的核酸檢測技術(shù)具有方便快捷、成本低廉、且無需昂貴設(shè)備和專業(yè)人員的優(yōu)點，具有開發(fā)成現(xiàn)場檢測工具的潛力。

2、cas核酸酶是crispr/cas系統(tǒng)中關(guān)鍵組分之一。對于蛋白酶，高純度是保證保真度和效率的關(guān)鍵。傳統(tǒng)cas核酸酶純化方式步驟繁瑣，耗時長(＞2d)，其中每個操作步驟均會影響蛋白產(chǎn)量和蛋白活性；最重要的一點是cas蛋白作為一類核酸結(jié)合蛋白，在菌體裂解后cas蛋白極易結(jié)合核酸造成核酸污染，無法用鎳離子親和層析完全去除。因此采用常規(guī)純化方式制備cas核酸酶常出現(xiàn)產(chǎn)量低、純度低、活性差等問題，極大地限制了crispr-cas檢測技術(shù)的開發(fā)。目前，本領(lǐng)域中出現(xiàn)了一種新穎的純化技術(shù)，即cl7/im7純化技術(shù)。對于核酸結(jié)合蛋白、膜蛋白、超大復(fù)合蛋白、表達量低的蛋白、難于分離純化的蛋白等，使用cl7/im7純化技術(shù)實現(xiàn)了高產(chǎn)量、高純度和高活性的制備。

3、綜上，本領(lǐng)域亟需一種利用cl7/im7純化技術(shù)制備高純度、高活性、無核酸酶污染的cas酶的方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種高活性cas酶，以及該酶的制備方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明的第一方面，提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白包括式i所示的結(jié)構(gòu)：

3、z1-z2-z3-z4-z5-z6-z7-z8(i)

4、式中，“-”為肽鍵或連接肽，

5、z1為翻譯增強元件，

6、z2為標(biāo)簽序列，

7、z3為無或接頭，

8、z4為lbcas12a序列，

9、z5為無或接頭，

10、z6為無或酶切位點，

11、z7為無或接頭，

12、z8為無或標(biāo)簽序列；

13、其中，z3、z5、z6、z7、z8不同時為無。

14、在另一優(yōu)選例中，所述翻譯增強元件為大腸桿菌翻譯增強元件。

15、在另一優(yōu)選例中，所述大腸桿菌翻譯增強元件具有如seq?id?no:1所示的氨基酸序列。

16、在另一優(yōu)選例中，所述z2為組氨酸標(biāo)簽。

17、在另一優(yōu)選例中，所述組氨酸標(biāo)簽為6×his標(biāo)簽。

18、在另一優(yōu)選例中，所述lbcas12a序列具有如seq?id?no:3所示的氨基酸序列。

19、在另一優(yōu)選例中，所述z5為接頭。

20、在另一優(yōu)選例中，所述z5的接頭具有如seq?id?no:4所示的氨基酸序列。

21、在另一優(yōu)選例中，所述酶切位點為hrv?3c酶的酶切位點。

22、在另一優(yōu)選例中，所述酶切位點具有如seq?id?no:5所示的氨基酸序列。

23、在另一優(yōu)選例中，所述z7為接頭。

24、在另一優(yōu)選例中，所述z7的接頭具有如seq?id?no:6所示的氨基酸序列。

25、在另一優(yōu)選例中，所述z8為cl7標(biāo)簽。

26、在另一優(yōu)選例中，所述cl7具有如seq?id?no:7所示的氨基酸序列。

27、在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白包括式ii所示的結(jié)構(gòu)：

28、z1-z2-z3-z4-z5-z6-z7(ii)

29、式中，“-”為肽鍵或連接肽，

30、z1為翻譯增強元件，

31、z2為標(biāo)簽序列，

32、z3為lbcas12a序列，

33、z4為接頭，

34、z5為酶切位點，

35、z6為接頭，

36、z7為標(biāo)簽序列；

37、其中，所述翻譯增強元件具有如seq?id?no:1所示的氨基酸序列，所述z2的標(biāo)簽序列為組氨酸標(biāo)簽，所述lbcas12a序列具有如seq?id?no:3所示的氨基酸序列，所述z4的接頭具有如seq?id?no:4所示的氨基酸序列，所述酶切位點具有如seq?id?no:5所示的氨基酸序列，所述z6的接頭具有如seq?id?no:6所示的氨基酸序列，所述z7為cl7標(biāo)簽。

38、在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白包括式iii所示的結(jié)構(gòu)：

39、z1-z2-z3-z4-z5(iii)

40、式中，“-”為肽鍵或連接肽，

41、z1為翻譯增強元件，

42、z2為標(biāo)簽序列，

43、z3為lbcas12a序列，

44、z4為接頭，

45、z5為酶切位點片段；

46、其中，所述翻譯增強元件具有如seq?id?no:1所示的氨基酸序列，所述標(biāo)簽序列為組氨酸標(biāo)簽，所述lbcas12a序列具有如seq?id?no:3所示的氨基酸序列，所述z4的接頭具有如seq?id?no:4所示的氨基酸序列。

47、在另一優(yōu)選例中，所述酶切位點片段具有如levlfq(seq?id?no:9)所示的氨基酸序列。

48、在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白的酶活性顯著增加。

49、在另一優(yōu)選例中，所述“顯著增加”是指，與lbcas12a商品酶的酶活性a0相比，所述融合蛋白的酶活性a1，在反應(yīng)5min時滿足a1/a0≥200％。

50、在另一優(yōu)選例中，所述“顯著增加”是指，與lbcas12a商品酶的酶活性a0相比，所述融合蛋白的酶活性a1，在反應(yīng)30min時滿足a1/a0≥130％。

51、在另一優(yōu)選例中，所述lbcas12a商品酶包括：購自neb的lbcas12a商品酶。

52、在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白具有熱穩(wěn)定性。

53、在另一優(yōu)選例中，所述熱穩(wěn)定性是通過比較將-80℃保存的所述融合蛋白在室溫下放置不同時間后的酶活性獲得的。

54、在另一優(yōu)選例中，與室溫下放置0小時的所述融合蛋白的酶活性h0相比，室溫下放置24小時的所述融合蛋白的酶活性h1，滿足：h1/h0≥95％。

55、在另一優(yōu)選例中，與室溫下放置0小時的所述融合蛋白的酶活性h0相比，室溫下放置48小時的所述融合蛋白的酶活性h2，滿足：h2/h0≥95％。

56、在另一優(yōu)選例中，所述室溫為25℃。

57、在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白具有穩(wěn)定性。

58、在另一優(yōu)選例中，所述穩(wěn)定性是通過比較將所述融合蛋白在不同溫度下放置不同時間后的酶活性獲得的。

59、在另一優(yōu)選例中，與-80℃保存的所述融合蛋白的酶活性s0相比，-20℃保存5個月的所述融合蛋白的酶活性s1，滿足：s1/s0≥80％。

60、在另一優(yōu)選例中，與-80℃保存的所述融合蛋白的酶活性s0相比，凍融兩次的所述融合蛋白的酶活性s2，滿足：s2/s0≥80％。

61、本發(fā)明的第二方面，提供了一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白。

62、本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，所述載體包括本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸。

63、在另一優(yōu)選例中，所述載體包括：質(zhì)粒載體、病毒載體、脂質(zhì)體載體、dna載體、rna載體。

64、在另一優(yōu)選例中，所述載體為質(zhì)粒載體。

65、在另一優(yōu)選例中，所述質(zhì)粒載體為pcold。

66、在另一優(yōu)選例中，所述質(zhì)粒載體具有如seq?id?no:8所示的核苷酸序列。

67、在另一優(yōu)選例中，所述質(zhì)粒載體包括：標(biāo)記基因、操縱子。

68、在另一優(yōu)選例中，所述標(biāo)記基因包括：氨芐青霉素抗性基因。

69、在另一優(yōu)選例中，所述氨芐青霉素抗性基因具有如seq?id?no:10所示的氨基酸序列。

70、在另一優(yōu)選例中，所述操縱子包括：乳糖操縱子。

71、在另一優(yōu)選例中，所述乳糖操縱子具有如seq?id?no:11所示的氨基酸序列。

72、本發(fā)明的第四方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包括本發(fā)明第三方面所述的載體、或染色體中整合有本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸、或表達本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白。

73、在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞包括：原核細(xì)胞、真核細(xì)胞。

74、在另一優(yōu)選例中，所述原核細(xì)胞包括大腸桿菌。

75、在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞不含所述hrv?3c酶的酶切位點。

76、在另一優(yōu)選例中，將所述載體遞送至所述宿主細(xì)胞的方法包括：熱擊法、電轉(zhuǎn)化法、化學(xué)轉(zhuǎn)化法、基因槍法。

77、在另一優(yōu)選例中，將所述載體遞送至所述宿主細(xì)胞的方法為熱擊法。

78、本發(fā)明的第五方面，提供了一種酶制劑，所述酶制劑包括本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白。

79、在另一優(yōu)選例中，所述酶制劑還包括藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

80、在另一優(yōu)選例中，所述酶制劑含有≥95％的所述融合蛋白。

81、本發(fā)明的第六方面，提供了一種本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白、本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸、本發(fā)明第三方面所述的載體、本發(fā)明第四方面所述的宿主細(xì)胞或本發(fā)明第五方面所述的酶制劑的用途，用于核酸檢測。

82、本發(fā)明的第七方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白、本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸、本發(fā)明第三方面所述的載體、本發(fā)明第四方面所述的宿主細(xì)胞、本發(fā)明第五方面所述的酶制劑。

83、在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括標(biāo)簽或說明書，所述說明書注明了所述試劑盒用于核酸檢測。

84、本發(fā)明的第八方面，提供了一種本發(fā)明第一方面所述融合蛋白的制備方法，包括步驟：

85、(1)在合適的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第四方面所述的宿主細(xì)胞，從而得到本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白。

86、在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)條件包括：培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)濃度、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)時長、誘導(dǎo)劑。

87、在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)溫度為15±1℃，較佳地為15℃。

88、在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)濃度為0.2±0.02mm，較佳地為0.2mm。

89、在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為220±10rpm，較佳地為220rpm。

90、在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)時長為16-18小時。

91、在另一優(yōu)選例中，所述誘導(dǎo)劑為iptg。

92、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟：

93、(2)分離純化步驟(1)所得的融合蛋白。

94、在另一優(yōu)選例中，從含有裂解的所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物中分離純化所述融合蛋白。

95、在另一優(yōu)選例中，裂解所述宿主細(xì)胞的方法包括溶菌酶裂解法。

96、在另一優(yōu)選例中，在步驟(2)中，包括步驟：

97、(2.1)對未分離純化的所述融合蛋白進行第一次層析，加入蛋白酶，獲得所述融合蛋白和所述蛋白酶的混合物；

98、(2.2)對所述混合物進行第二次層析，獲得所述融合蛋白。

99、在另一優(yōu)選例中，在步驟(2.1)中，利用cl7/im7親和層析柱進行所述第一次層析。

100、在另一優(yōu)選例中，所述蛋白酶為hrv?3c酶。

101、在另一優(yōu)選例中，在步驟(2.2)中，利用gst層析柱進行所述第二次層析。

102、在另一優(yōu)選例中，在步驟(2.1)中，還包括復(fù)性所述cl7/im7親和層析柱。

103、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。