本發(fā)明涉及多肽合成，具體涉及一種從2-氯三苯甲基氯樹脂中綠色切割保護(hù)肽的方法。

背景技術(shù)：

1、多肽長肽序列的合成面臨諸多挑戰(zhàn)，尤其是在化學(xué)合成領(lǐng)域（如固相合成）。多肽長片段合成的核心瓶頸在于固相合成中偶聯(lián)效率的指數(shù)衰減，疏水聚集導(dǎo)致的溶解性障礙，以及二硫鍵精準(zhǔn)配對和翻譯后修飾的復(fù)雜性。此外，rp-hplc對肽段的純化分辨率下降，質(zhì)譜表征靈敏度不足，使得雜質(zhì)分離和結(jié)構(gòu)驗(yàn)證困難。

2、為解決長肽合成中的技術(shù)瓶頸，片段合成策略在工業(yè)應(yīng)用中展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢：其一，通過分段合成短肽再定向連接，可有效克服傳統(tǒng)固相合成法的長度瓶頸；其二，短肽特性允許對磷酸化、糖基化等翻譯后修飾進(jìn)行定點(diǎn)精準(zhǔn)引入，避免長鏈合成中的副反應(yīng)干擾；其三，短肽片段更易通過溶劑優(yōu)化或保護(hù)基修飾解決疏水聚集問題，提升反應(yīng)均一性；其四，模塊化組合模式加速了多肽藥物結(jié)構(gòu)優(yōu)化進(jìn)程，單個片段庫可快速生成數(shù)百種功能變體。該技術(shù)現(xiàn)已成為胰島素類似物、抗菌肽等復(fù)雜結(jié)構(gòu)多肽工業(yè)化生產(chǎn)的主流方案。

3、片段合成技術(shù)雖然優(yōu)勢顯著，但仍面臨關(guān)鍵性技術(shù)挑戰(zhàn)，其核心難點(diǎn)在于固相合成過程中樹脂載體與肽鏈的分離問題。由于合成反應(yīng)是在樹脂表面進(jìn)行，必須確保短肽片段能夠以完整結(jié)構(gòu)和高效率從固相載體上完全裂解，同時保留特定的活性官能團(tuán)（如c端羧基或n端氨基）用于后續(xù)片段連接。這一過程存在三個主要技術(shù)障礙：首先，傳統(tǒng)強(qiáng)酸裂解條件可能導(dǎo)致部分敏感氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基（如三苯甲基trt）發(fā)生斷裂；其次，不完全裂解會殘留樹脂結(jié)合的肽鏈片段，嚴(yán)重影響后續(xù)連接反應(yīng)的效率。除此之外，傳統(tǒng)工業(yè)生產(chǎn)中普遍采用的搖床式或釜式樹脂裂解工藝，該工藝需要長達(dá)2-3?h的裂解反應(yīng)時間，導(dǎo)致整體生產(chǎn)周期延長；另一方面，反應(yīng)完成后必須經(jīng)過多步繁瑣的后處理工序，包括樹脂過濾、乙醚沉淀、離心分離等操作步驟。這種低效的工藝流程不僅增加了時間成本，還容易造成產(chǎn)物損失和批次間質(zhì)量波動，嚴(yán)重制約了規(guī)模化生產(chǎn)的效率。當(dāng)前產(chǎn)業(yè)界正積極探索連續(xù)流反應(yīng)器和自動化分離系統(tǒng)等創(chuàng)新工藝，以期突破這一生產(chǎn)瓶頸。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有工業(yè)使用三氟乙酸裂解體系（tfa-dcm）會影響肽鏈從樹脂上的裂解，以及傳統(tǒng)裂解工藝的時間漫長、操作繁瑣等缺陷，提供了一種從2-氯三苯甲基氯樹脂中綠色切割保護(hù)肽的方法。

2、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種從2-氯三苯甲基氯樹脂中綠色切割保護(hù)肽的方法。本發(fā)明使用1%?v/v甲酸-dcm，5%v/v乙酸-dcm，5%v/v乳酸-dcm以及10%v/v甲酸-苯甲醚從2-ctc樹脂上裂解受保護(hù)的肽片段。并且自行搭建了一套連續(xù)流動循環(huán)裂解裝置并且驗(yàn)證使用連續(xù)流動相關(guān)技術(shù)裂解樹脂上的肽鏈。具體技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明提供了一種從2-氯三苯甲基氯樹脂中綠色切割保護(hù)肽的方法，包括如下步驟：在2-氯三苯甲基氯樹脂上，按照多肽肽序依次連接氨基酸，得到樹脂肽；將切割液與所述的樹脂肽混合，實(shí)現(xiàn)樹脂肽中保護(hù)肽的切割；其中所述的切割液為弱酸溶液。

4、其中，所述的弱酸溶液包括甲酸溶液、乙酸溶液或乳酸溶液中的任意一種。

5、其中，所述的弱酸溶液，其溶劑包括二氯甲烷（dcm）、碳酸二甲酯（dmc）、對二甲苯（px）、甲苯（tol）或苯甲醚（ano）中的任意一種或多種的組合。

6、其中，所述的弱酸溶液，弱酸溶質(zhì)的體積濃度為1%~10%。

7、優(yōu)選的，所述的弱酸溶液，為1%?v/v甲酸-dcm、5%v/v乙酸-dcm、5%v/v乳酸-dcm或10%?v/v甲酸-ano中的任意一種。

8、其中，所述的切割液的用量以每mg樹脂肽中混合5~15?μl切割液計，優(yōu)選為每mg樹脂肽中混合10~15?μl切割液。

9、其中，所述的混合，混合方式為直接混合或者連續(xù)流混合，優(yōu)選為連續(xù)流混合，所述的連續(xù)流混合按照如下方法進(jìn)行：將所述的樹脂肽經(jīng)溶脹處理后裝入制備柱，循環(huán)泵入切割液，實(shí)現(xiàn)混合。

10、其中，所述的連續(xù)流混合過程中，切割液的溫度為40~50?℃，優(yōu)選為45?℃。

11、其中，所述的溶脹處理，使用的溶劑為二氯甲烷，處理時間為30~60?min。

12、其中，所述的循環(huán)泵入，將流經(jīng)樹脂肽的切割液反復(fù)泵入制備柱，泵入速度為1~5ml/min，泵入時間為30~75?min。優(yōu)選45~75?min。

13、優(yōu)選的，所述的樹脂肽的制備具體包括如下步驟：

14、（1）將所述的2-氯三苯甲基氯樹脂置于二氯甲烷中溶脹；

15、（2）將多肽肽序的第一個氨基酸fmoc-aa-oh在二氯甲烷中溶解，并加入n-n’二異丙基乙胺得到混合溶液；

16、（3）將步驟（1）制備得到的樹脂和步驟（2）制備得到的混合溶液混合，進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行封閉，封閉完成后加入哌啶溶液去除fmoc；

17、（4）重復(fù)步驟（2）~（3），按照多肽肽序依次連接fmoc保護(hù)的氨基酸基團(tuán)，得到所述的樹脂肽。

18、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的多肽包括但不限于太子參肽、胸腺5肽、司美格魯肽片段（1-5）和替爾泊肽片段（15-21）中的任意一種。其肽序分別如下：

19、太子參肽：fmoc-gly-phe-ile-pro-pro-leu-gly-oh；

20、胸腺5肽：fmoc-tyr(tbu)-val-asp(otbu)-lys(boc)-arg(pbf)-oh；

21、司美格魯肽片段（1-5）：fmoc-his(trt)-aib-glu(otbu)-gly-thr(tbu)-oh；

22、替爾泊肽片段（15-21）：fmoc-asp(tbu)-lys(boc)-ile-ala-gln(trt)-aib-ala-oh。

23、有益效果：

24、本發(fā)明的研究數(shù)據(jù)表明，在固相合成多肽的過程中，切割保護(hù)肽時使用甲酸和乙酸體系相較于傳統(tǒng)三氟乙酸（tfa）展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢：不僅腐蝕性和生物累積毒性顯著降低，更值得注意的是，完全綠色無害的食品級乳酸在樹脂肽裂解中的應(yīng)用效果顯著，這些綠色有機(jī)酸經(jīng)過2h溫和反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)90%以上的裂解效率，同時保持98%以上的肽鏈結(jié)構(gòu)完整性，這一指標(biāo)遠(yuǎn)超tfa體系（通常伴隨5-15%的氨基酸保護(hù)基斷裂）。此外，溶劑系統(tǒng)的綠色化改造同樣取得進(jìn)展：苯甲醚作為二氯甲烷（dcm）的安全替代品，在保持相似溶解性能的同時，其急性毒性和環(huán)境影響因子顯著優(yōu)于傳統(tǒng)dcm溶劑。

技術(shù)特征：

1.一種從2-氯三苯甲基氯樹脂中綠色切割保護(hù)肽的方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的弱酸溶液包括甲酸溶液、乙酸溶液或乳酸溶液中的任意一種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的弱酸溶液，其溶劑包括二氯甲烷、碳酸二甲酯、對二甲苯、甲苯或苯甲醚中的任意一種或多種的組合。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述弱酸溶液中，弱酸溶質(zhì)的體積濃度為1%~10%。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的切割液的用量以每mg樹脂肽中混合5~15?μl切割液計。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的連續(xù)流混合過程中，切割液的溫度為40~50?℃。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的溶脹處理，使用的溶劑為二氯甲烷，處理時間為30~60?min。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的循環(huán)泵入，將流經(jīng)樹脂肽的切割液反復(fù)泵入制備柱，泵入速度為1~5?ml/min，泵入時間為30~75?min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及多肽合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從2?氯三苯甲基氯樹脂中綠色切割保護(hù)肽的方法。本發(fā)明所述的方法包括如下步驟：在2?氯三苯甲基氯樹脂上，按照多肽肽序依次連接氨基酸，得到樹脂肽；將切割液與所述的樹脂肽混合，實(shí)現(xiàn)樹脂肽中保護(hù)肽的切割；其中所述的切割液為弱酸溶液。所述的弱酸溶液包括甲酸溶液、乙酸溶液或乳酸溶液中的任意一種，均為綠色有機(jī)酸，所述的弱酸溶液的溶劑也是綠色溶劑，本發(fā)明所述的方法切割效率高，同時能保持98%以上的肽鏈結(jié)構(gòu)完整性，同時本發(fā)明還利用了連續(xù)流切割樹脂肽，進(jìn)一步提高了切割效率。

技術(shù)研發(fā)人員：蘇賢斌,尹照軒,夏超
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京工業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15