本發(fā)明涉及生物，具體的，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)myc/mycn/mycl擴(kuò)增的三色探針試劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肺癌是我國(guó)目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，患病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。小細(xì)胞肺癌（small?cell?lung?cancer,?sclc）是一種惡性度高、預(yù)后較差的肺癌亞型，既往文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)ycl基因擴(kuò)增是sclc的預(yù)后不良標(biāo)志物（qin,?j.,?et?al.,?mycl1?amplificationand?expression?of?l-myc?and?c-myc?in?surgically?resected?small-cell?lungcarcinoma.?pathology?oncology?research?:?por,?2021.?27:p.?1609775）。國(guó)外的研究表明，這種mycl擴(kuò)增可能是位于染色體外環(huán)狀dna（ecdna）上，并與不良預(yù)后相關(guān)（pongor,l.s.,?et?al.,?extrachromosomal?dna?amplification?contributes?to?small?celllung?cancer?heterogeneity?and?is?associated?with?worse?outcomes.?cancerdiscovery,?2023.）。

2、最近還有文獻(xiàn)報(bào)道，ecdna介導(dǎo)的myc家族基因擴(kuò)增，包括myc、mycn、mycl，能促進(jìn)sclc的化療耐藥，此外，申請(qǐng)人前期發(fā)表的工作提示，具有myc/mycn/mycl擴(kuò)增的sclc的免疫細(xì)胞尤其是t細(xì)胞減少，呈現(xiàn)出顯著的免疫抑制性（zhang,?j.?et?al.?p3.13d.04extrachromosomal?myc-paralogs?amplification?defines?immunosuppressivemicroenvironment?with?metastatic?potential?in?small?cell?lung?cancer.?journalof?thoracic?oncology,?volume?19,?issue?10,?s360?-?s361），因此包括mycl在內(nèi)的染色體外myc家族的擴(kuò)增有望作為廣泛期sclc免疫聯(lián)合化療的生物標(biāo)志物。

3、目前，myc家族基因的擴(kuò)增金標(biāo)準(zhǔn)采用fish來(lái)測(cè)定，然而，市面上的成熟探針多為myc或mycn單色探針（如淋巴瘤中myc探針，神經(jīng)母細(xì)胞瘤m中mycn單色探針已經(jīng)獲批用于臨床診斷），目前市面上尚無(wú)自主研發(fā)的myc/mycn/mycl三色探針，無(wú)法對(duì)單次肺癌樣本同時(shí)開展myc/mycn/mycl基因擴(kuò)增的測(cè)定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種用于同時(shí)檢測(cè)myc/mycn/mycl基因擴(kuò)增的三色探針，以及myc/mycn/mycl探針在制備用于診斷小細(xì)胞肺癌及其預(yù)后預(yù)測(cè)的試劑的應(yīng)用。

2、本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供一種用于同時(shí)檢測(cè)myc/mycn/mycl基因擴(kuò)增的三色探針，所述三色探針包括mycl基因橘紅色探針，mycn基因綠色探針，myc基因青色探針。所述mycl基因橘紅色探針大小為326kb，覆蓋區(qū)域?yàn)椋篶hr1:40,211,639-40,537,125（grch37/hg19），根據(jù)設(shè)計(jì)選取探針標(biāo)記模板（ctd-2325j8、rp11-318g20）；所述mycn基因綠色探針大小為335kb，覆蓋區(qū)域?yàn)椋篶hr2:15,900,537-16,235,457（grch37/hg19），根據(jù)設(shè)計(jì)選取探針標(biāo)記模板（ctd-2014f22、rp11-635a14、rp11-120j4）；所述myc基因青色探針大小為630kb，覆蓋區(qū)域?yàn)椋篶hr8:128,428,219-129,036,660（grch37/hg19），根據(jù)設(shè)計(jì)選取探針標(biāo)記模板（ctd-2005d17、rp11-1145o20、ctd-3057e17、rp11-125a17）。

3、本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供上述三色探針的制備方法，具體為，將選取的bac克隆菌液（ctd-2325j8、rp11-318g20、ctd-2014f22、rp11-635a14、rp11-120j4、ctd-2005d17、rp11-1145o20、ctd-3057e17、rp11-125a17）進(jìn)行菌液擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒dna，質(zhì)粒dna做為探針標(biāo)記模板，利用dnase?1、dna聚合酶以及熒光染料進(jìn)行探針標(biāo)記。

4、本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供上述三色探針在制備用于檢測(cè)小細(xì)胞肺癌的試劑中的應(yīng)用。

5、本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供上述三色探針在制備用于診斷小細(xì)胞肺癌預(yù)后預(yù)測(cè)的試劑盒中的應(yīng)用。

6、在一種實(shí)施方式中，上述試劑和/或試劑盒在0℃以下運(yùn)輸。-20℃±5℃避光密封保存，有效期為12個(gè)月，凍融次數(shù)不超過10次不影響產(chǎn)品性能，但應(yīng)避免不必要的反復(fù)凍融。開蓋后，可在2-8℃避光密封保存24小時(shí)，長(zhǎng)期保存應(yīng)在-20±5℃避光密封保存。

7、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益的技術(shù)效果：

8、1）本發(fā)明首次推出三色探針，同時(shí)檢測(cè)myc/mycn/mycl家族基因用于臨床診斷，極大降低了檢測(cè)成本；

9、2）本發(fā)明針對(duì)sclc的fish圖像中的myc/mycn/mycl染色，具有良好的特異性和敏感性，可用于判讀臨床樣本myc/mycn/mycl基因擴(kuò)增情況；

10、3）本研究已經(jīng)開展56例包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照在內(nèi)的myc/mycn/mycl探針測(cè)試，發(fā)現(xiàn)約10%（6/56）的患者存在myc/mycn/mycl基因擴(kuò)增，并可以作為生物標(biāo)志物提示小細(xì)胞肺癌的不良預(yù)后。

技術(shù)特征：

1.一種用于同時(shí)檢測(cè)myc、mycn和mycl基因擴(kuò)增的三色探針，其特征在于，所述三色探針包括mycl基因橘紅色探針，mycn基因綠色探針和myc基因青色探針，其中：

2.?如權(quán)利要求1所述的三色探針的制備方法，其特征在于，所述方法包括，將選取的bac克隆菌液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒dna，質(zhì)粒dna做為探針標(biāo)記模板，利用dnase?1、dna聚合酶以及熒光染料進(jìn)行探針標(biāo)記。

3.如權(quán)利要求1所述的三色探針在制備用于檢測(cè)小細(xì)胞肺癌的試劑中的應(yīng)用。

4.如權(quán)利要求1所述的三色探針在制備用于診斷小細(xì)胞肺癌預(yù)后預(yù)測(cè)的試劑盒中的應(yīng)用。

5.如權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑和/或試劑盒在0℃以下運(yùn)輸，-20℃±5℃避光密封保存。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)MYC/MYCN/MYCL擴(kuò)增的三色探針試劑及其應(yīng)用。所述三色探針包括MYCL基因橘紅色探針，MYCN基因綠色探針，MYC基因青色探針。所述MYCL基因橘紅色探針覆蓋區(qū)域?yàn)椋篶hr1:40,211,639?40,537,125（GRCh37/hg19），根據(jù)設(shè)計(jì)選取探針標(biāo)記模板（CTD?2325J8、RP11?318G20）；所述MYCN基因綠色探針覆蓋區(qū)域?yàn)椋篶hr2:15,900,537?16,235,457（GRCh37/hg19），根據(jù)設(shè)計(jì)選取探針標(biāo)記模板（CTD?2014F22、RP11?635A14、RP11?120J4）；所述MYC基因青色探針覆蓋區(qū)域?yàn)椋篶hr8:128,428,219?129,036,660（GRCh37/hg19）。該探針可利用單次肺癌樣本同時(shí)開展MYC/MYCN/MYCL基因擴(kuò)增的測(cè)定。

技術(shù)研發(fā)人員：李曉,楊帆,張經(jīng)緯,琚研,金岳圻,楊恩策,楊浩天,吳興源,袁梓航,曹浩飛
受保護(hù)的技術(shù)使用者：北京大學(xué)人民醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15