本技術(shù)涉及生物醫(yī)學(xué)，具體而言，涉及一種雙靶點嵌合抗原受體聯(lián)合pd-1與il-21融合蛋白。

背景技術(shù)：

1、car-t細(xì)胞治療是一種通過基因工程技術(shù)改造的t細(xì)胞免疫治療方法，能夠特異性識別并殺傷腫瘤細(xì)胞。car-t療法最初在血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如急性淋巴細(xì)胞白血?。╝ll）和大b細(xì)胞淋巴瘤中取得了顯著療效。然而，實體瘤由于其復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境（tme）以及腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，往往使得car-t細(xì)胞治療面臨較大挑戰(zhàn)。

2、實體瘤中的腫瘤微環(huán)境通常具有免疫抑制特性，例如免疫細(xì)胞的功能抑制、免疫抑制因子（如tgf-β、il-10等）的積累、腫瘤血管的異常以及腫瘤細(xì)胞的抗原異質(zhì)性等。這些因素使得car-t細(xì)胞在腫瘤內(nèi)部的滲透、擴增以及持久性大大受限，且腫瘤抗原的變化也容易導(dǎo)致單一靶點car-t細(xì)胞的抗腫瘤效果不穩(wěn)定。

3、胰腺癌（pancreatic?cancer）是一種惡性程度極高的癌癥，其治療難度大，尤其是因為該病常在晚期才被發(fā)現(xiàn)，并且耐藥性強、轉(zhuǎn)移性強。目前，免疫療法（如car-t療法）作為一種前沿治療策略，已成為胰腺癌治療的潛在希望。針對胰腺癌的car-t療法目前主要集中在兩類靶點：cldn18.2（claudin?18.2）和msln（mesothelin）。

4、pd-1/pd-l1?阻斷療法是腫瘤免疫治療領(lǐng)域的重大突破，通過解除腫瘤對?t?細(xì)胞的抑制來恢復(fù)抗腫瘤免疫應(yīng)答。pd-1?阻斷后成功的抗腫瘤免疫反應(yīng)需要重新激活和增殖腫瘤微環(huán)境?(tme)?中存在的抗原經(jīng)驗?cd8?+?t?細(xì)胞。在這方面，γ?c家族細(xì)胞因子，尤其是?il-2、il-15?和?il-21，在調(diào)節(jié)?cd8?+?t?細(xì)胞反應(yīng)的幅度和功能方面發(fā)揮著重要作用。其中il-21通過誘導(dǎo)早期分化表型在記憶性?cd8?+?t?細(xì)胞的發(fā)育和維持中起關(guān)鍵作用。

5、對于基于細(xì)胞因子的療法，存在許多挑戰(zhàn)，包括藥代動力學(xué)障礙和副作用。大多數(shù)細(xì)胞因子，包括?il-21，對多種細(xì)胞類型（包括免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞）發(fā)揮作用。在生理條件下，細(xì)胞因子以旁分泌和自分泌方式以及較短的半衰期將其作用限制在特定靶細(xì)胞上。全身施用細(xì)胞因子通常治療效果不佳并引起副作用，因為細(xì)胞因子還可以激活反調(diào)節(jié)途徑并通過作用于不同的靶細(xì)胞引起毒性，同時激活免疫細(xì)胞以增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本技術(shù)涵蓋如下技術(shù)方案：

2、雙靶點嵌合抗原受體，其胞外域從n端到c端依次包括下述任意一種：cigg?scfv-msln?scfv、cigg?scfv-cldn18.2?scfv；其中“-”為連接肽；其還包含鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)；并且在所述胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)的n端還融合有pd-1?scfv和il-21；其中：

3、所述cigg?scfv的重鏈互補決定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no：1~3所示，輕鏈互補決定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no：4~6所示；

4、所述msln?scfv的重鏈互補決定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no：7~9所示，輕鏈互補決定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no：10~12所示；

5、所述cldn18.2?scfv的重鏈互補決定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no：13~15所示，輕鏈互補決定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no：16~18所示；

6、所述pd-1?scfv的重鏈互補決定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no：19~21所示，輕鏈互補決定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no：22~24所示；

7、所述il-21的氨基酸序列如seq?id?no：25所示。

8、分離的核酸，其能夠表達(dá)得到如上所述的雙靶點嵌合抗原受體。

9、含有如上所述核酸的載體。

10、表達(dá)有如上所述雙靶點嵌合抗原受體的免疫細(xì)胞。

11、藥物組合物，其包含如上所述的免疫細(xì)胞。

12、如上所述的免疫細(xì)胞在制備用于殺傷cigg陽性、且同時msln或cldn18.2陽性的腫瘤細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。

13、有益效果：

14、本技術(shù)設(shè)計并構(gòu)建了雙靶點car-t聯(lián)合pd-1抑制劑（pd-1?scfv）和il-21的治療方案，其結(jié)合了免疫治療的多重機制，具有顯著的技術(shù)優(yōu)點。這種組合策略主要通過增強t細(xì)胞的抗腫瘤效果、克服免疫逃逸、提高car-t細(xì)胞的持久性等方式，彌補單一治療的局限性。

15、這種組合治療的具體技術(shù)優(yōu)點至少包括：

16、1.增強car-t細(xì)胞的持久性和效能：

17、il-21的作用：il-21是一種t細(xì)胞和自然殺傷（nk）細(xì)胞增殖因子，具有促進t細(xì)胞持續(xù)增殖、增強效應(yīng)功能和延長其生存時間的作用。il-21能有效抑制t細(xì)胞衰竭（exhaustion），改善car-t細(xì)胞的耐受性，并延長其在腫瘤微環(huán)境中的活性。雙靶點car-t的協(xié)同作用：通過聯(lián)合il-21，雙靶點car-t細(xì)胞能夠在腫瘤微環(huán)境中保持較長時間的活躍狀態(tài)，增強t細(xì)胞的殺傷作用，并對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生更強的抗原特異性攻擊。這有助于解決單一靶點car-t細(xì)胞在持續(xù)免疫抑制環(huán)境中的持久性差的問題。

18、2.?克服免疫逃逸機制

19、pd-1抑制劑的作用：腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)pd-l1與t細(xì)胞表面的pd-1受體結(jié)合，抑制t細(xì)胞的活性和增殖，這是一種常見的免疫逃逸機制。pd-1抑制劑（如nivolumab或pembrolizumab）通過阻斷pd-1/pd-l1通路，解除對t細(xì)胞的免疫抑制，從而增強car-t細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。

20、雙靶點car-t與pd-1抑制劑的協(xié)同作用：在雙靶點car-t的基礎(chǔ)上，聯(lián)合使用pd-1抑制劑可以有效解除腫瘤微環(huán)境中對car-t細(xì)胞的免疫抑制，使car-t細(xì)胞更加活躍和高效。這種組合策略能夠顯著提高治療效果，尤其是在對抗一些具有強免疫逃逸能力的實體瘤（如胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌等）時。

21、3.?提高腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷效率

22、雙靶點的優(yōu)勢：使用雙靶點car-t，能夠同時靶向兩種不同的抗原，這使得car-t細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中能更加全面地識別腫瘤細(xì)胞，減少腫瘤細(xì)胞通過下調(diào)單一抗原逃逸免疫監(jiān)視的可能性。尤其是在腫瘤異質(zhì)性較強的情況下，雙靶點car-t能夠覆蓋更多的腫瘤細(xì)胞亞群。

23、il-21與雙靶點car-t的協(xié)同作用：il-21可以增強雙靶點car-t細(xì)胞的功能，使其在腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷上更具持續(xù)性和高效性。這一組合不僅可以增強car-t細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，還能夠加強對腫瘤微環(huán)境的適應(yīng)性，進一步提升療效。

24、4.減少car-t細(xì)胞的衰竭

25、免疫衰竭的挑戰(zhàn)：長期在腫瘤微環(huán)境中，car-t細(xì)胞容易發(fā)生免疫衰竭，表現(xiàn)為細(xì)胞功能喪失、增殖能力下降、細(xì)胞毒性減弱等。而il-21的引入能夠有效抑制t細(xì)胞的衰竭，促進car-t細(xì)胞的活性和效應(yīng)功能。il-21的作用不僅僅局限于t細(xì)胞的增殖，還能調(diào)節(jié)car-t細(xì)胞的代謝、抗衰竭等方面，提高細(xì)胞效能和存活率。

26、pd-1抑制與il-21的聯(lián)合：聯(lián)合使用pd-1抑制劑和il-21能夠從兩個方面加強car-t細(xì)胞的免疫效應(yīng)。pd-1抑制劑解除免疫檢查點抑制，使car-t細(xì)胞能更好地發(fā)揮其抗腫瘤作用；il-21則直接增強t細(xì)胞的耐受性和持續(xù)效能，防止其快速衰竭。通過這兩種機制的聯(lián)動，能夠有效提高car-t細(xì)胞的抗腫瘤能力和治療持久性。

27、5.?減少副作用和增強靶向性

28、減少單一靶點治療的副作用：由于雙靶點car-t同時識別兩個抗原，能夠更加精確地靶向腫瘤細(xì)胞，避免對正常細(xì)胞的誤傷，減少副作用的發(fā)生。此外，il-21通過增強car-t細(xì)胞的免疫反應(yīng)，不僅使其殺傷腫瘤細(xì)胞的效果更好，還能降低腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險。

29、pd-1抑制對副作用的管理：pd-1抑制劑雖然可能導(dǎo)致一定的免疫相關(guān)副作用，但聯(lián)合治療可以通過提高car-t細(xì)胞的治療效率，減少治療所需的劑量，降低免疫相關(guān)副作用的發(fā)生風(fēng)險。此外，il-21對car-t細(xì)胞的增強作用也可以在一定程度上減輕t細(xì)胞受到免疫抑制的影響，提高治療的安全性和耐受性。

30、6.?提高療效的個性化治療潛力

31、療效增強與腫瘤異質(zhì)性：對于腫瘤異質(zhì)性較高的患者，雙靶點car-t聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)療法能夠最大限度地減少抗原喪失或免疫逃逸的風(fēng)險，提高治療的適應(yīng)性和療效。