本發(fā)明涉及抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體及其在基孔肯雅病毒檢測中的應(yīng)用，屬于免疫學(xué)。

背景技術(shù)：

1、基孔肯雅病毒（chikungunya?virus，chikv），屬于披膜病毒科（ togaviridae），甲病毒屬（ alphavirus）。甲病毒屬是一類包膜病毒，主要通過蚊蟲傳播，引起人類和動物重大疾病。甲病毒感染后，癥狀表現(xiàn)為從發(fā)燒或皮疹到顯著的炎癥病理，包括腦炎和嚴重關(guān)節(jié)炎。以東方/西方馬腦炎病毒（eeev/weev）和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（veev）為代表的一類甲病毒多侵襲神經(jīng)引起腦炎，而以基孔肯雅病毒（chikv）為代表的一類甲病毒則多引起急性關(guān)節(jié)炎。chikv引起基孔肯雅熱（chikungunya?fever，chikf），主要通過埃及伊蚊及白紋伊蚊進行傳播。chikv感染患者通常會表現(xiàn)39℃高燒、嚴重關(guān)節(jié)痛和肌痛，伴有皮疹，只有不到15%的患者為無癥狀感染，發(fā)熱與病毒血癥同時發(fā)生，急性感染持續(xù)時間通常為1?周，感染嚴重者可出現(xiàn)腦炎、腦病、心肌炎、肝炎和多器官衰竭，嚴重威脅公共衛(wèi)生及社會經(jīng)濟發(fā)展。

2、chikv病毒粒子形態(tài)為球狀，直徑70nm，內(nèi)層是240個衣殼蛋白組成的二十面體核衣殼結(jié)構(gòu)包裹的單股正鏈rna?基因組，基因組長約11.8?kb，包含兩個不連續(xù)的orf，5?'?端的orf編碼與病毒復(fù)制復(fù)合體相關(guān)的四種非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp1-4），3'?端的orf編碼五種結(jié)構(gòu)蛋白（c、e3、e2、6k和e1）。隨后核衣殼結(jié)構(gòu)被宿主派生的脂質(zhì)雙分子層所包圍。病毒粒子最外層是由三種結(jié)構(gòu)蛋白（e1、e2、e3）組成的包膜結(jié)構(gòu)，它們在質(zhì)膜上組裝，形成240個e1-e2異質(zhì)二聚體，接著被組裝成80個按t=?4二十面體對稱排列的異源三聚體刺突糖蛋白，位于病毒粒子表面。e3主要參與刺突的組裝；e2與細胞受體結(jié)合使病毒通過內(nèi)吞作用進入細胞；e1蛋白含有融合肽，在低ph條件下，e1-e2異質(zhì)二聚體結(jié)構(gòu)改變，融合肽表位暴露，從而促進膜融合，使核衣殼釋放入宿主細胞質(zhì)。同時，e1、e2作為包膜蛋白，免疫原性較強，是機體免疫系統(tǒng)最早識別的重要靶點。

3、chikv目前依然在大規(guī)模流行，我國防止該病毒病入侵的主要策略是加強該病毒的檢驗檢疫及早期防控。目前檢測chikv感染多為檢測chikv特異性igm和igg，病毒感染后，igm滴度持續(xù)上升，在發(fā)病后5-7天急性感染期可以被檢測到，igg可在發(fā)病后約1-2個星期內(nèi)檢測到，通常在病毒血癥消失后，并在今后的數(shù)月至數(shù)年內(nèi)均可檢測到，所以igm、igg分別用于急性感染期、恢復(fù)期標本的檢測。目前檢測chikv特異性抗原的研究相對較少，而檢測特異性抗原可以克服檢測特異性igm/igg存在的窗口期問題，實現(xiàn)病毒感染早期的快速檢測。

4、納米抗體(nanobody，nb)于1993年首次報道，發(fā)現(xiàn)在駱駝科動物血液中存在缺失輕鏈的“重鏈抗體”（heavy-chain?antibody），該抗體的可變區(qū)（(variable?domainofheavy?chain?ofheavy-chainantibody，vhh）保留了全部的抗原結(jié)合能力，被稱為單域抗體或者納米抗體（nanobody,?nb），分子量只有15?kda。和普通抗體相比，納米抗體分子量小，易于滲透進致密組織甚至是血腦屏障；結(jié)構(gòu)簡單，易于進行基因改造，在疾病的診斷及治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。vhh?最重要的特征之一就是免疫原性弱，生物相容性好，具有納摩爾級的親和力。另外，抗體vh和納米抗體vhh的序列同源性較高，對vhh區(qū)進行適當(dāng)?shù)母脑旒纯傻玫饺嗽椿募{米抗體,并且?vhh的高變區(qū)cdr3更長一些，使其更容易與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，且更緊密穩(wěn)定。相比于單鏈抗體，納米抗體內(nèi)部存在二硫鍵，使得其在惡劣條件（蛋白酶、極端ph等）下的穩(wěn)定性大大提高，可以通過吸入給藥用于疾病的治療。這些獨特的特性為vhh及其重組片段提供了眾多傳統(tǒng)抗體無法替代的優(yōu)勢，使它們成為免疫治療和免疫診斷發(fā)展過程中一個強有力的工具。

5、本發(fā)明的目的是提供一種特異靈敏檢測chikv感染的抗原檢測方法，并應(yīng)用于chikf的預(yù)防和控制。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于上述目的，本發(fā)明首先提供了一種抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體，所述抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體的重鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3區(qū)的氨基酸序列分別如seq?id?no.1的第26-33、51-58和97-115位所示；或者

2、所述抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體的重鏈可變區(qū)的cdr1、cdr2和cdr3區(qū)的氨基酸序列分別如seq?id?no.3的第26-33、51-57和96-112位所示。

3、本發(fā)明所述的納米抗體是一種只有重鏈的抗體，所述重鏈包括可變區(qū)和恒定區(qū)，所述可變區(qū)具有3個互補決定區(qū)（complementarity?determining?regions,?cdrs）：cdr1、cdr2和cdr3，具有高度可變性和多樣性。cdr區(qū)的序列多樣性決定了抗體的特異性和親和力，因為它們通過與抗原相互作用來識別和結(jié)合特定的抗原決定簇。

4、在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.1?所示，在本發(fā)明中，具有該可變區(qū)的納米抗體被命名為“n055”；或者，

5、所述的抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?idno.3所示，在本發(fā)明中，具有該可變區(qū)的納米抗體被命名為“10g4”。

6、其次，本發(fā)明提供了一種編碼上述的抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體的多核苷酸，編碼所述的抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體的重鏈可變區(qū)的多核苷酸的序列如?seqid?no.2?所示，在本發(fā)明中，納米抗體n055為具有該編碼序列的抗體，或者，

7、編碼所述的抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體的重鏈可變區(qū)的多核苷酸的序列如seq?id?no.4所示?，在本發(fā)明中，納米抗體10g4為具有該編碼序列的抗體。

8、第三，本發(fā)明提供了一種含有上述的編碼抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體的重鏈可變區(qū)的多核苷酸的載體。所述載體用于克隆和/或表達所述抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體的編碼基因，?在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述載體為pcdna3.4。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知曉的其它載體，尤其是真核細胞表達載體也可以用于本發(fā)明所述編碼基因的克隆和/或表達。

9、第四，本發(fā)明提供了一種含有上述編碼所述的抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體的重鏈可變區(qū)的多核苷酸的載體的宿主細胞。所述宿主細胞用于表達獲得上述的抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述宿主細胞為expi293f細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知曉的其它宿主細胞，尤其是真核宿主細胞也可以用于本發(fā)明所述納米抗體的表達。

10、第五，本發(fā)明提供了上述的抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體在制備治療和/或預(yù)防基孔肯雅病毒病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的納米抗體與基孔肯雅病毒e蛋白具有優(yōu)異的親和力，以及結(jié)合活性，能夠特異性靶向基孔肯雅病毒e蛋白，因此利用所述納米抗體的這些特性特異性抑制基孔肯雅病毒與宿主細胞的結(jié)合，或者，將治療性藥物特異性靶向感染病灶或者病原體以發(fā)揮臨床治療或者預(yù)防感染的作用，因此，本發(fā)明提供了上述的抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體在制備治療和/或預(yù)防基孔肯雅病毒病的藥物中的應(yīng)用。

11、第六，本發(fā)明提供了一種含有上述的抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體的檢測試劑盒?；诒景l(fā)明提供的納米抗體與基孔肯雅病毒e蛋白具有優(yōu)異的親和力，可以用于檢測樣本中可能存在的具有基孔肯雅病毒e蛋白的基孔肯雅病毒顆粒。所述檢測抗原為單抗體的檢測，即，所述納米抗體作為一抗與病原體特異性結(jié)合，再以二抗對所述結(jié)合進行檢測；也可以為雙抗體的組合檢測。

12、在一個優(yōu)選的實施方案中，所述檢測試劑盒為雙抗體夾心法免疫檢測試劑盒。本發(fā)明所述的雙抗體夾心法是一種常用的免疫學(xué)檢測技術(shù)，通常用于檢測大分子抗原，如蛋白質(zhì)、多肽等，其主要基于抗原與抗體的特異性結(jié)合的原理。利用兩種特異性抗體，即捕獲抗體和檢測抗體，夾住目標抗原。捕獲抗體首先被固定在固相載體（如微孔板、膜等）上，然后加入待測樣本。樣本中的目標抗原與捕獲抗體特異性結(jié)合，被固定在固相載體上。接著，加入標記的檢測抗體，該抗體與已結(jié)合在固相載體上的抗原的另一部位特異性結(jié)合，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物。最后，通過特定的檢測方法（如酶聯(lián)免疫吸附試驗中的顯色反應(yīng)）來檢測標記的檢測抗體，從而間接測定樣本中目標抗原的含量。

13、在本發(fā)明中，所述檢測試劑盒中捕獲抗體與檢測抗體的組合為重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.1?所示的抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體（n055）和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.3?所示的抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體（10g4）。在本發(fā)明提供的技術(shù)方案中，所述n055和10g4均可以作為捕獲抗體或檢測抗體使用，當(dāng)一種抗體作為捕獲抗體使用時，另一種抗體作為檢測抗體使用，即，本發(fā)明所述的捕獲抗體與檢測抗體的組合。

14、本發(fā)明所述的免疫檢測不限于所公開的酶聯(lián)免疫檢測，還可以包括但不限于放射性免疫檢測、化學(xué)發(fā)光免疫檢測等技術(shù)。

15、在一個具體的實施方案中，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.1?所示的抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體（n055）為捕獲抗體，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.3所示的抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體（10g4）為檢測抗體，在該技術(shù)方案中，n055-fc?以1?μg/ml包被，?10g4-fc以1:8000倍稀釋（0.09?ng/ml）為最優(yōu)選的工作濃度。在本發(fā)明的另一個可選的技術(shù)方案中，可以將n055作為檢測抗體，10g4作為捕獲抗體使用。

16、本發(fā)明在具體實施中，以上述的納米抗體n055和納米抗體10g4的c末端與人fc蛋白（氨基酸序列如seq?id?no.5所示）相融合的融合蛋白作為檢測抗體或捕獲抗體。?vhh偶聯(lián)fc是一種常規(guī)表達載體構(gòu)建方式，一方面是加入fc便于親和純化，另一方面，fc形成二聚體，有利于提高抗體與抗原的結(jié)合能力，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以選擇添加其它純化標簽達到相同的技術(shù)目的。

17、最后，本發(fā)明提供了一種抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體組合物，所述抗體組合物包括重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.1?所示的抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體（n055）和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.3?所示的抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體（10g4）。本發(fā)明的雙抗夾心法elisa檢測基孔肯雅病毒e蛋白的實施例驗證了兩種納米抗體針對e蛋白的不同抗原結(jié)合表位，因此兩種抗體作為抗體組合物使用時，可以同時結(jié)合同一個基孔肯雅病毒，進一步加大了對基孔肯雅病毒立體結(jié)構(gòu)的影響，以及對基孔肯雅病毒與其受體的結(jié)合效能的影響，或者，可以將不同或相同的治療藥物靶向到病毒，可以作為雞尾酒療法的參考方案，因此，本發(fā)明提供了含有所述兩種抗基孔肯雅病毒e蛋白的抗體的組合物。

18、本發(fā)明通過羊駝免疫以及噬菌體抗體庫篩選到兩株抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體，所述兩種納米抗體均具有獨特的重鏈可變區(qū)cdr區(qū)，其與基孔肯雅病毒具有優(yōu)異的結(jié)合活性，ec50?（半最大效應(yīng)濃度）分別為18.65?ng/ml?、8.78?ng/ml，與基孔肯雅病毒的親和力kd分別是2.9e-10、7.1e-10，優(yōu)異的結(jié)合活性和親和力顯示本發(fā)明提供的納米抗體在制備治療和/或預(yù)防基孔肯雅病毒病的藥物中的應(yīng)用。

19、本發(fā)明提供的兩株抗基孔肯雅病毒e蛋白的納米抗體可以結(jié)合基孔肯雅病毒中的不同抗原表位，因此，本發(fā)明提供了所述兩種納米抗體作為檢測抗體和捕獲抗體的組合用于雙抗體夾心法免疫檢測，在本發(fā)明構(gòu)建的雙抗體夾心elisa法檢測基孔肯雅病毒e蛋白的實施例中，檢測靈敏度為49?pg/ml，且與人血清中的同屬甲病毒weev、veev、eeev的包膜蛋白及人陰性血清均呈陰性反應(yīng)，特異性100%，在基孔肯雅病毒病的診斷和病原檢測中具有廣泛的應(yīng)用前景。