本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)，尤其涉及一種免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

1、腫瘤，又稱癌癥，是機(jī)體在各種致瘤因素作用下，局部組織的細(xì)胞異常增生而形成的新生物，常表現(xiàn)為局部腫塊。腫瘤細(xì)胞具有異常的代謝和功能，它生長(zhǎng)旺盛，不受機(jī)體控制的生長(zhǎng)，最終破壞機(jī)體各器官的正常功能從而導(dǎo)致機(jī)體死亡。傳統(tǒng)的治療手段包括手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療，研究表明，這些治療治愈腫瘤并不是殺死腫瘤細(xì)胞，而是當(dāng)腫瘤負(fù)荷明顯降低時(shí)，機(jī)體的免疫功能恢復(fù)，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。隨著腫瘤免疫治療的發(fā)展，具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞越來越受到科研工作人員的重視。腫瘤免疫細(xì)胞技術(shù)是通過將患者自體或異體的免疫細(xì)胞通過體外擴(kuò)增技術(shù)完成免疫細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)后再將免疫細(xì)胞重新輸入患者體內(nèi)的治療方法，具有殺傷力強(qiáng)、副作用小等優(yōu)勢(shì)。

2、免疫細(xì)胞的來源多樣，可以從外周血、骨髓、臍帶血等組織中分離。不同來源的免疫細(xì)胞具有不同的培養(yǎng)需求和特性。nk細(xì)胞又稱自然殺傷細(xì)胞，在人體全身巡邏的同時(shí)搜尋癌細(xì)胞及病毒感染細(xì)胞等對(duì)其進(jìn)行攻擊，在人體自然免疫中發(fā)揮著重要的作用。雖然nk細(xì)胞的抗癌效果的安全性和療效得到肯定，但是它僅占外周血淋巴細(xì)胞的10%-30%，因而如何獲得高純度、高質(zhì)量的nk細(xì)胞產(chǎn)品是nk治療的關(guān)鍵。目前，市場(chǎng)上已有nk細(xì)胞的培養(yǎng)方法，但其培養(yǎng)體系復(fù)雜、增殖能力及抗腫瘤活性效果不佳、部分培養(yǎng)體系存在安全風(fēng)險(xiǎn)等問題。

3、鑒于上述情況，開發(fā)一種新型、高效、操作簡(jiǎn)單的免疫細(xì)胞培養(yǎng)方法具有非常重要的意義的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

2、本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、一種免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

4、（1）向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加il-2、il-15、谷氨酰胺、華法林鈉得到活化培養(yǎng)基；

5、（2）向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加il-2、il-21、谷氨酰胺、色甘酸鈉、鹽膚木葉提取物得到增殖培養(yǎng)基；

6、（3）向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加抗cd3抗體、透明質(zhì)酸得到包被液，將培養(yǎng)容器用包被液處理；

7、（4）取外周血分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞，將分離得到的外周血單個(gè)核細(xì)胞用所述活化培養(yǎng)基重懸，接種至步驟（3）處理后的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，收集細(xì)胞；

8、（5）將步驟（4）收集的細(xì)胞用增殖培養(yǎng)基重懸，接種至步驟（3）處理后的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，收集免疫細(xì)胞。

9、優(yōu)選地，以終濃度計(jì)，所述活化培養(yǎng)基中各組分的濃度為：il-2800-1200iu/ml、il-150.05-0.1μg/ml、谷氨酰胺1-5μg/ml、華法林鈉130-145ng/ml。

10、優(yōu)選地，以終濃度計(jì)，所述增殖培養(yǎng)基中各組分的濃度為：il-2800-1200iu/ml、il-21100-500iu/ml、谷氨酰胺1-3.5μg/ml、色甘酸鈉0.5-1μg/ml、鹽膚木葉提取物0.1-0.3μg/ml。

11、優(yōu)選地，所述免疫細(xì)胞為nk細(xì)胞。

12、優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為rpmi-1640培養(yǎng)基。

13、優(yōu)選地，以終濃度計(jì)，所述包被液中抗cd3抗體的濃度為200μg/ml、透明質(zhì)酸的濃度為1mg/ml。

14、優(yōu)選地，所述步驟（4）的接種密度為3-5×106個(gè)/ml，培養(yǎng)時(shí)間為6d；培養(yǎng)期間每2d補(bǔ)加一次活化培養(yǎng)基，使細(xì)胞密度維持在6-8×105個(gè)/ml。

15、優(yōu)選地，所述步驟（5）的具體操作為：將步驟（4）收集的細(xì)胞用增殖培養(yǎng)基重懸，以1-3×106個(gè)/ml的密度接種至步驟（3）處理后的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，飽和濕度，5%co2；從第5天開始，每2d補(bǔ)充用于培養(yǎng)免疫細(xì)胞的增殖培養(yǎng)基，使細(xì)胞密度維持在6-8×105個(gè)/ml，培養(yǎng)時(shí)間為14d，收集免疫細(xì)胞。

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要在于：

17、本發(fā)明通過提供一種免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法，提高了該免疫細(xì)胞的擴(kuò)增能力、促炎因子產(chǎn)生能力、以及nk細(xì)胞的腫瘤殺傷率，為細(xì)胞臨床應(yīng)用提供了優(yōu)質(zhì)的培養(yǎng)方案。此外，本發(fā)明的方法配置簡(jiǎn)單，添加物均為商品化的藥品及生物制劑、質(zhì)量安全、可控。

技術(shù)特征：

1.一種免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，以終濃度計(jì)，所述活化培養(yǎng)基中各組分的濃度為：il-2?800-1200iu/ml、il-15?0.05-0.1μg/ml、谷氨酰胺1-5μg/ml、華法林鈉130-145ng/ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，以終濃度計(jì)，所述增殖培養(yǎng)基中各組分的濃度為：il-2?800-1200iu/ml、il-21?100-500iu/ml、谷氨酰胺1-3.5μg/ml、色甘酸鈉0.5-1μg/ml、鹽膚木葉提取物0.1-0.3μg/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述免疫細(xì)胞為nk細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為rpmi-1640培養(yǎng)基。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，以終濃度計(jì)，所述包被液中抗cd3抗體的濃度為200μg/ml、透明質(zhì)酸的濃度為1mg/ml。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟（4）的接種密度為3-5×106個(gè)/ml，培養(yǎng)時(shí)間為6d；培養(yǎng)期間每2d補(bǔ)加一次活化培養(yǎng)基，使細(xì)胞密度維持在6-8×105個(gè)/ml。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟（5）的具體操作為：將步驟（4）收集的細(xì)胞用增殖培養(yǎng)基重懸，以1-3×106個(gè)/ml的密度接種至步驟（3）處理后的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，飽和濕度，5%co2；從第5天開始，每2d補(bǔ)充用于培養(yǎng)免疫細(xì)胞的增殖培養(yǎng)基，使細(xì)胞密度維持在6-8×105個(gè)/ml，培養(yǎng)時(shí)間為14d，收集免疫細(xì)胞。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法。所述培養(yǎng)方法包括以下步驟：將培養(yǎng)容器用包被液處理、將外周血單個(gè)核細(xì)胞用活化培養(yǎng)基培養(yǎng)、將活化后的細(xì)胞用增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)、收集得到免疫細(xì)胞。本發(fā)明通過提供一種免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法，提高了該免疫細(xì)胞的擴(kuò)增能力、促炎因子產(chǎn)生能力、以及NK細(xì)胞的腫瘤殺傷率，為細(xì)胞臨床應(yīng)用提供了優(yōu)質(zhì)的培養(yǎng)方案。此外，本發(fā)明的方法配置簡(jiǎn)單，添加物均為商品化的藥品及生物制劑、質(zhì)量安全、可控。

技術(shù)研發(fā)人員：江曄,趙虹翔,高業(yè)勝,程志強(qiáng),滕波,宋泓緯
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海華顏醫(yī)藥科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/15