本發(fā)明屬于檢測領域，具體的涉及一種食品中雜環(huán)胺化合物的測試分析方法。

背景技術：

1、雜環(huán)胺是富含蛋白質的食品在高溫加熱過程中產生的一系列致癌、致突變的化合物，它們主要存在于烤肉、烤魚等高溫加熱的蛋白質食物中。雜環(huán)胺主要分為兩類，一類是氨基咪唑并氮雜芳烴(aia)，由肌酐、葡萄糖和氨基酸在150-250℃下經過美拉德反應生成；另一類是氨基咔啉，主要在高于250℃下(harman和norharman除外)，經由氨基酸和蛋白質裂解生成。

2、流行病學報告顯示，過量的雜環(huán)胺攝入會增加患食道癌、胃癌、結腸癌、胰腺癌等癌癥的風險。國際癌癥研究機構(iarc)已將某些特定的雜環(huán)胺定為致癌物，如2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(iq)被定為2a級致癌物，而2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶(phip)、2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(meiq)、2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(meiqx)等被定為2b級致癌物。癌癥對人類健康構成嚴重威脅，研究表明雜環(huán)胺可能誘發(fā)食道癌、胃癌和前列腺癌等。因此，在日常生活中，應盡量避免或減少攝入高溫加熱的富含蛋白質的食物，以降低患癌風險，除此之外，如何高效地檢測雜環(huán)胺的含量也成為檢測行業(yè)的研究熱點之一。

3、關于雜環(huán)胺的檢測，目前沒有統(tǒng)一的國家標準，專利文獻cn111679021b公開了一種用于檢測固體樣品中雜環(huán)胺的方法，可以簡單、快速、穩(wěn)定的測試雜環(huán)胺化合物，但是試劑盒的制備相對較為復雜，不利于大規(guī)模推廣，因此亟需一種高效、精確的雜環(huán)胺測試，來測試食品中的雜環(huán)胺含量。

技術實現思路

1、本發(fā)明提供了一種食品中雜環(huán)胺化合物的測試方法，包括：

2、s1、將冷凍的待測食品樣品解凍，稱取2g的樣品置于離心管中，加入內標中間液，加水均質混勻，再加第一有機溶劑，渦旋混合5-10min，然后離心處理，靜置，取有機相；

3、s2、將有機相置于離心管中，加入第二有機溶劑，均質混勻，渦旋混合5-10min，然后離心處理，得第二有機相；

4、s3、將凈化小柱進行活化，第二有機相使用活化后的凈化小柱進行純化，得到第三有機相；

5、s4、將第三有機相使用第三有機溶劑進行洗脫，收集洗脫液，水浴條件下氮氣催干，然后使用第四有機溶劑震蕩溶解殘渣，離心，取上清液，進行液相色譜-質譜/質譜分析測定。

6、作為一種可實施的案例，所述的內標中間液包括norharman-d7內標中間液。

7、作為一種可實施的案例，所述的凈化小柱為填充柱，填料包括500mg?mgso4，200mgpsa填料，80mg?c?18填料。

8、本發(fā)明中主要采用內標法進行雜環(huán)胺化合物分析測試，使用內標法進行含量分析具有提高分析準確度和精密度、縮短實驗時間、增強抗干擾能力、保持分析穩(wěn)定性以及廣泛適用性等優(yōu)點，本發(fā)明選擇與分析物相近但能完全分離的norharman-d7內標中間液，能夠校正提取、純化等步驟中的差異及儀器響應的變化。同時，本發(fā)明通過特定的有機溶劑和凈化小柱，以及優(yōu)化的離心、純化和洗脫條件，來降低諸如蛋白和脂肪的雜質對于目標檢測物雜環(huán)胺化合物的分析精度的干擾，進一步提高對食品樣品中雜環(huán)胺化合物含量的精確定量分析

9、作為一種可實施的案例，水和第一有機溶劑的體積比(2-5)：10。

10、作為一種可實施的案例，所述的第一有機溶劑包括：甲醇，乙腈，正己烷，甲酸銨中的一種或多種。

11、進一步的，所述的第一有機溶劑為乙腈和正己烷；乙腈和正己烷的體積比為1：1。

12、作為一種可實施的案例，所述的s1步驟中離心處理的溫度為3-5℃，離心處理的轉速為3000-5000rpm，離心處理的時間為3-5min。

13、作為一種可實施的案例，所述的第二有機溶劑包括：甲醇，乙腈，正己烷，甲酸銨中的一種或多種。

14、進一步的，所述的第二有機溶劑為乙腈。

15、作為一種可實施的案例，所述的s2步驟中離心處理的溫度為3-5℃，離心處理的轉速為3000-5000rpm，離心處理的時間為3-5min。

16、作為一種可實施的案例，所述的凈化小柱的活化方法包括：先使用甲醇洗滌，再使用純水洗滌。

17、作為一種可實施的案例，所述的s3步驟中的第二有機相的純化流速為0.3-0.5ml/min。

18、作為一種可實施的案例，所述的第三有機溶劑包括：甲醇，乙腈，正己烷，甲酸銨，氨水中的一種或多種。

19、進一步的，所述的第三有機溶劑為甲醇和氨水；甲醇和氨水的體積比為1：1。

20、作為一種可實施的案例，所述的第四有機溶劑包括：甲醇，乙腈，正己烷，甲酸銨，氨水中的一種或多種。

21、進一步的，所述的第四有機溶劑為甲酸銨。

22、作為一種可實施的案例，所述的s4步驟中離心處理的轉速為10000-20000rpm，離心處理的時間為5-15min。

23、作為一種可實施的案例，所述的液相色譜-質譜/質譜分析中，液相色譜的色譜條件包括：

24、色譜柱：c18柱，規(guī)格：100mm×3.0mm(內徑)，粒度：1.5-2μm。

25、流動相a：5-10mmol/l甲酸銨溶液；流動相b：甲酸質量濃度0.05-0.1wt％的乙腈溶液。

26、流速：0.2-0.5ml/min，梯度洗脫形式。

27、柱溫：25-30℃。

28、進樣量：5-10μl。

29、進一步的，所述的液相色譜-質譜/質譜分析中，液相色譜的色譜條件包括：

30、色譜柱：c18柱；規(guī)格：100mm×3.0mm，粒度：1.8μm。

31、流動相a：10mmol/l甲酸銨溶液；流動相b：甲酸質量濃度0.1wt％的乙腈溶液。

32、流速：0.25ml/min，梯度洗脫形式。

33、梯度洗脫條件如表1所示：

34、表1

35、

36、

37、柱溫：30℃。

38、進樣量：10μl。

39、作為一種可實施的案例，所述的液相色譜-質譜/質譜分析中，質譜的工作參數包括：

40、離子源：電噴霧esi，正離子；

41、掃描方式：多反應監(jiān)測mrm。

42、針對待測物的質譜碰撞能量參數詳見表2。

43、表2

44、

45、

46、作為一種可實施的案例，所述的液相色譜-質譜/質譜分析的步驟包括：定性測定，定量測定。

47、作為一種可實施的案例，所述的定性測定包括：在液相色譜-質譜/質譜定性測量中，如果樣品中的色譜峰保留時間與標準品一致，并且樣品中離子對的相對豐度(相對于最強離子豐度的強度百分比)與濃度相當的標準工作溶液的相對豐度在允許的偏差范圍內(表3中給出)，可以判斷樣品中存在對應的雜環(huán)胺化合物。

48、表3

49、 相對離子豐度 >50％ >20％～50％ >10％～20％ ≤10％ 允許的相對偏差 ±20％ ±25％ ±30％ ±50％

50、作為一種可實施的案例，所述的定量測量包括：在定性確認存在目標檢測物后，選取響應值適宜的標準工作液進行色譜分析，標準曲線工作液有5個濃度水平。

51、標準工作液和待測液中14種物質的響應值均應在儀器線性響應范圍內。如果含量超過線性范圍，應用基質空白溶液稀釋到合適濃度后分析。

52、雜環(huán)胺化合物的含量根據下式計算可得：

53、

54、式中：

55、xi：試樣中雜環(huán)胺殘留量，單位為微克每千克(μg/kg)；

56、c：標準工作液中雜環(huán)胺的濃度，單位為納克每毫升(ng/ml)；

57、ci：從標準曲線上得到的雜環(huán)胺殘留量的溶液濃度，單位為納克每毫升(ng/ml)；

58、a：樣品中待分析物的面積；

59、asi：標準工作液中內標物的峰面積；

60、v：樣液最終定容體積，單位為毫升(ml)；

61、csi：標準工作溶液中內標物的濃度，單位為納克每毫升(ng/ml)；

62、ai：樣品中內標分析物的面積；

63、as：標準工作液中待分析物的峰面積；

64、m：最終樣液代表的試樣質量，單位為克(g)。

65、有益效果

66、(一)本發(fā)明通過按3倍信噪比所對應的濃度來計算檢出限，確保了測試結果的高靈敏度。對于harman、norharman等多種雜環(huán)胺化合物，其檢出限達到了5μg/kg，相比傳統(tǒng)方法，檢出限更低，能夠更靈敏地檢測出食品中的痕量物質。

67、(二)本發(fā)明提供的檢測方法，對于14種待測雜環(huán)胺化合物的回收率均在85％以上，表明在分析過程中能夠有效地提取和檢測目標物質，減少了物質的損失和誤差，從而提高了分析的準確性。

68、(三)針對食品樣品基質復雜的問題，本方法采用特殊的凈化小柱進行預處理，有效降低了基質干擾；凈化小柱根據雜環(huán)胺特有的分子平面結構設計，同時兼具除蛋白和脂肪的功能，進一步提高了待測物質的回收率和檢出的陽性率。

69、(四)本發(fā)明采用內標法進行雜環(huán)胺化合物的分析測試，使用內標法具有提高分析準確度和精密度、縮短實驗時間、增強抗干擾能力等優(yōu)點。通過選擇與分析物相近但能完全分離的norharman-d7內標中間液，校正了提取、純化等步驟中的差異及儀器響應的變化，實現了對食品樣品中雜環(huán)胺化合物含量的可靠定量分析。

70、(五)本發(fā)明提供的測試分析方法不僅適用于上述提到的多種雜環(huán)胺化合物，還可能適用于其他類似結構的化合物分析；由于高靈敏度、高回收率和強抗干擾能力的特點，使得該方法在食品質量與安全監(jiān)測領域具有廣泛的適用性。