本發(fā)明涉及生物，特別涉及一種觀察卵鞘內(nèi)胚胎內(nèi)部活動(dòng)的方法。

背景技術(shù)：

1、隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展與研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的組織、器官的正常發(fā)育都要追溯到早期胚胎發(fā)生階段，特別是不同物種間同種器官的發(fā)育及演化調(diào)控機(jī)制，更是涉及到胚胎干細(xì)胞的初步分化及各組織器官原基的形成。因此，在不同物種中進(jìn)行早期胚胎發(fā)育的研究變得非常必要。然而，與傳統(tǒng)模式動(dòng)物(如小鼠、蟾蜍、斑馬魚、線蟲、果蠅等)不同的是，自然界中大部分動(dòng)物的胚胎(卵)都被硬質(zhì)的卵殼或卵鞘包裹著；這使得簡(jiǎn)單的固定處理，很難獲得滿足后續(xù)觀察的胚胎(卵)。此外，大部分的胚胎(卵)都具有一定的體積(厚度大于100μm)，通常情況下無(wú)法觀察到其內(nèi)部的細(xì)胞活動(dòng)；生物組織作為高渾濁度的光學(xué)介質(zhì)，激光在樣品中的有限穿透深度主要是生物組織對(duì)光的散射造成的；但通過(guò)使用光學(xué)清除劑和更一般的外源性試劑后，能夠減少生物組織中的散射、增強(qiáng)圖像對(duì)比度和增加成像穿透深度(costantini?et?al.，2019)。

2、作為卵生動(dòng)物中的一員，美洲大蠊產(chǎn)卵時(shí)會(huì)形成一個(gè)包裹著多個(gè)卵的卵囊(卵鞘)，這個(gè)卵鞘是主要由卵鞘結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生硬化和黑化而來(lái)，可以防止受精卵在溫暖和干燥的條件下失去水分并具有強(qiáng)大的防水抗腐蝕能力(du?et?al.，2020)。由于受精卵是一個(gè)充滿了卵黃、缺少骨架蛋白的組織，且多個(gè)卵并排緊貼在一起，在未經(jīng)處理的情況下直接剖開卵鞘會(huì)導(dǎo)致卵的破裂，無(wú)法獲得完整的單個(gè)卵。在以往的研究中，研究人員常使用熱固定的方法把卵鞘中的胚胎進(jìn)行固定，再剖開卵鞘以獲得單個(gè)胚胎。然而經(jīng)過(guò)水浴加熱后，胚胎中的蛋白會(huì)發(fā)生無(wú)法逆轉(zhuǎn)的變性，所以無(wú)法進(jìn)行免疫蛋白的標(biāo)記與觀察。此外，由于美洲大蠊的卵比較大(美洲大蠊單個(gè)卵的長(zhǎng)度約3.5mm、寬度約1mm、厚度約為1mm)，通過(guò)常規(guī)的免疫組織化學(xué)染色處理后，在激光共聚焦顯微鏡下只能觀察到距離胚胎表面約30-60μm深度的情況，無(wú)法觀察到胚胎內(nèi)部的細(xì)胞活動(dòng)。雖然在小鼠中已實(shí)現(xiàn)組織器官的清除和內(nèi)部深度成像的方案，但當(dāng)前并沒(méi)有觀察美洲大蠊早期胚胎內(nèi)部細(xì)胞活動(dòng)的方案報(bào)道。通過(guò)測(cè)試現(xiàn)在已有的scale、clarity、idisco、cubic、eci和c-eci等脂質(zhì)清除與透明化方案(hama?etal.，2011；chung?et?al.，2013；renier?et?al.，2014；susaki?et?al.，2014；tainaka?etal.，2014；susaki?et?al.，2015；klingberg?et?al.，2017；huang?et?al.，2019；masselinket?al.，2019；lesage?et?al.，2020)，這些方法均不能觀察到美洲大蠊早期胚胎內(nèi)部的細(xì)胞活動(dòng)。因此，目前對(duì)于如何觀察美洲大蠊早期胚胎內(nèi)部細(xì)胞活動(dòng)是無(wú)一可行的方案的，這極大地阻礙了生物學(xué)中早期胚胎發(fā)生的相關(guān)研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述技術(shù)問(wèn)題之一。

2、本發(fā)明第一方面提供一種卵鞘內(nèi)胚胎的化學(xué)固定方法，包括：

3、使用固定劑處理卵鞘，所述固定劑包含含有甲醛和triton?x-100的pbt緩沖液，所述pbt緩沖液為含有bsa和triton?x-100的pbs緩沖液，所述卵鞘為部分卵鞘被去除的卵鞘。

4、本發(fā)明中處理的卵鞘為未孵化的含有胚胎的卵鞘，卵鞘內(nèi)的胚胎，充滿了卵黃蛋白原等流體物質(zhì)，且骨架蛋白極少，僅靠卵膜維持基本的形態(tài)。并且一個(gè)卵鞘內(nèi)通常含有多個(gè)胚胎，每個(gè)胚胎緊貼在一起；直接剖開卵鞘會(huì)導(dǎo)致卵膜的撕裂，導(dǎo)致胚胎內(nèi)的物質(zhì)全部流出而損壞。并且卵鞘的存在，會(huì)阻礙固定液的滲透，無(wú)法如其他組織那般使用簡(jiǎn)單固定法。本發(fā)明中提供的固定方法，通過(guò)使用特定固定液配方，連同部分卵鞘結(jié)構(gòu)對(duì)胚胎進(jìn)行固定；可在保留一定卵鞘的條件下，固定好卵鞘中的胚胎(卵)。

5、在一些實(shí)施方式中，在使用固定劑處理卵鞘之前還包括剖開卵鞘兩端，露出卵鞘中的胚胎的步驟。該步驟的目的在于使固定劑滲透進(jìn)卵鞘中對(duì)卵鞘中的胚胎進(jìn)行固定。

6、在一些實(shí)施方式中，除了剖開卵鞘兩端，還在卵鞘中部扎一個(gè)孔以更好地使固定液的滲透進(jìn)行卵鞘中。

7、在一些實(shí)施方式中，在使用固定劑處理卵鞘之前還包括軟化卵鞘外面硬質(zhì)的外殼的步驟，比如使用次氯酸鈉溶液浸泡卵鞘的步驟，以消弱卵鞘的阻隔作用。

8、在一些實(shí)施方式中，所述pbt緩沖液為含有1-5g/l?bsa、5-15ml/l?triton?x-100的pbs緩沖液；

9、在一些實(shí)施方式中，所述固定劑由pbt緩沖液、甲醛和triton?x-100按照體積比(7-9):(1-3):(0.5-1.5)混合得到。

10、在一些實(shí)施方式中，使用固定劑處理卵鞘包括在20-30℃下將卵鞘置于固定劑中孵育。

11、在固定過(guò)程中，由于卵鞘的存在，溫度過(guò)低的固定時(shí)間會(huì)非常長(zhǎng)，溫度過(guò)高則會(huì)破壞胚胎的蛋白結(jié)構(gòu)完整，導(dǎo)致抗體標(biāo)記效果非常差。在20-30℃下進(jìn)行固定，既可以保證固定效率，也不會(huì)破壞蛋白結(jié)構(gòu)。

12、在一些實(shí)施方式中，使用固定劑處理卵鞘包括將卵鞘轉(zhuǎn)移至容器(如ep管)中，加入固定劑，于20-30℃搖床中孵育，搖床轉(zhuǎn)速為20-30rpm，固定時(shí)，每個(gè)容器最多可放兩個(gè)卵鞘。

13、在一些實(shí)施方式中，孵育時(shí)間為3-4天。

14、在一些實(shí)施方式中，所述卵鞘是指蜚蠊科昆蟲的卵鞘。

15、在一些實(shí)施方式中，所述蜚蠊科昆蟲包括美洲大蠊。

16、本發(fā)明第二方面提供一種觀察卵鞘內(nèi)胚胎內(nèi)部活動(dòng)的方法，包括使用第一方面的化學(xué)固定方法固定卵鞘內(nèi)胚胎。

17、在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括：

18、固定結(jié)束后分離固定好的胚胎，得到單個(gè)胚胎；

19、脫脂處理；

20、通透化處理；

21、免疫染色和/或核染色；

22、脫水處理；

23、透明化處理。

24、在一些實(shí)施方式中，分離固定好的胚胎時(shí)還包括剖除卵膜的步驟。

25、在一些實(shí)施方式中，所述脫脂處理包括：

26、將所述胚胎在稀釋的脫脂劑中孵育1-3小時(shí)，稀釋倍數(shù)為2-3；

27、將所述胚胎在脫脂劑中孵育1-3小時(shí)；

28、將所述胚胎在脫脂劑中孵育12-24小時(shí)；

29、將所述胚胎在稀釋的脫脂劑中孵育1-2小時(shí)，稀釋倍數(shù)為2-3；

30、所述脫脂劑含有尿素、四羥丙基乙二胺、triton?x-100。

31、在一些實(shí)施方式中，按質(zhì)量百分比計(jì)，所述脫脂劑中含有20％-30％的尿素，20％-30％的四羥丙基乙二胺，10％-20％的triton?x-100，余量水。

32、在一些實(shí)施方式中，所述脫脂處理包括：

33、(1)在放置有胚胎的容器中加入稀釋的脫脂劑，稀釋倍數(shù)為2-3，20-30℃搖床處理1-3小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為20-30rpm；

34、(2)棄掉稀釋的脫脂劑，加入脫脂劑，20-30℃搖床處理1-3小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為20-30rpm；

35、(3)棄掉脫脂劑，加入新的脫脂劑，20-30℃搖床處理12-24小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為20-30rpm；

36、(4)棄掉脫脂劑，加入稀釋的脫脂劑，稀釋倍數(shù)為2-3，20-30℃搖床處理1-2小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為20-30rpm。

37、在一些實(shí)施方式中，所述脫脂處理之前還包括使用清洗緩沖液清洗胚胎的步驟。

38、在一些實(shí)施方式中，所述清洗包括：將胚胎置于pbt緩沖液中，顛倒搖晃7-8次后，棄掉pbt緩沖液；加入pbt緩沖液，在20-30℃下清洗50-70分鐘，棄掉pbt緩沖液，重復(fù)該步驟1-3次。

39、在一些實(shí)施方式中，所述清洗包括：在放置有胚胎的容器中加入pbt緩沖液，顛倒搖晃7-8次后，棄掉pbt緩沖液；加入pbt緩沖液，20-30℃搖床處理50-70分鐘，搖床轉(zhuǎn)速為20-30rpm，棄掉pbt緩沖液，重復(fù)該步驟1-3次。

40、在一些實(shí)施方式中，所述脫脂處理之后還包括使用清洗緩沖液清洗胚胎的步驟。

41、在一些實(shí)施方式中，所述清洗包括：將胚胎置于pbt緩沖液中，顛倒搖晃7-8次后，棄掉pbt緩沖液；加入pbt緩沖液，在20-30℃下清洗50-70分鐘，棄掉pbt緩沖液，重復(fù)該步驟1-3次。

42、在一些實(shí)施方式中，所述清洗包括：在放置有胚胎的容器中加入pbt緩沖液，顛倒搖晃7-8次后，棄掉pbt緩沖液，重復(fù)該步驟1次；加入pbt緩沖液，20-30℃搖床處理50-70分鐘，搖床轉(zhuǎn)速為20-30rpm，棄掉pbt緩沖液，重復(fù)該步驟1-3次。

43、在一些實(shí)施方式中，所述通透化處理包括在20-30℃下將胚胎置于通透劑中孵育1-3小時(shí)；所述通透劑包含含有triton?x-100、dmso、甘氨酸和edta-na的pbs緩沖液。

44、在一些實(shí)施方式中，所述通透化處理包括在放置有胚胎的容器中加入通透劑，20-30℃搖床處理1-3小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為20-30rpm。

45、在一些實(shí)施方式中，所述通透劑為含有1-3μl/ml的triton?x-100、0.1-0.3ml/ml的dmso、0.01-0.03g/ml的甘氨酸、0.002-0.004g/ml的edta-na的pbs緩沖液。

46、在一些實(shí)施方式中，所述脫水處理包括將胚胎置于脫水劑中孵育脫水。

47、在一些實(shí)施方式中，所述脫水劑包含濃度梯度遞增的甲醇溶液。

48、在一些實(shí)施方式中，所述脫水劑包含體積百分濃度范圍為20％-100％的體積百分濃度梯度遞增的甲醇溶液，所述甲醇溶液由甲醇和pbs緩沖液混合得到。

49、在一些實(shí)施方式中，所述脫水處理包括在放置有胚胎的容器中加入體積百分濃度為20％、40％、60％、80％、100％、100％梯度甲醇脫水，每個(gè)梯度60分鐘，20-30℃搖床處理，搖床轉(zhuǎn)速為20-30rpm。

50、在一些實(shí)施方式中，所述透明化處理包括將胚胎置于透明化試劑中孵育，所述透明化試劑包含二芐醚。

51、在一些實(shí)施方式中，所述透明化處理包括將胚胎轉(zhuǎn)移至棕色容器中，加入二芐醚，靜置避光處理1-3小時(shí)。

52、在一些實(shí)施方式中，所述免疫染色和/或核染色包括：

53、(1)在放置有胚胎的容器中加入抗原封閉液，20-30℃搖床處理2小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為20-30rpm；

54、(2)孵育一抗：棄掉抗原封閉液，加入pbt緩沖液，再加入一抗(比如anti-α-tubulin大鼠單抗)，20-30℃搖床處理3天，搖床轉(zhuǎn)速為20-30rpm；

55、(3)棄掉一抗，加入pbt緩沖液，顛倒搖晃7-8次后，棄掉pbt緩沖液；重復(fù)此步驟1次；

56、(4)加入pbt緩沖液，在20-30℃搖床上處理60分鐘后，棄掉pbt緩沖液，搖床轉(zhuǎn)速為20-30rpm；重復(fù)此步驟2次；

57、(5)孵育熒光二抗與核酸染料：加入pbt緩沖液，再加入熒光二抗(比如cy3山羊抗大鼠igg)與核酸染料(比如sytox?green)；20-30℃避光搖床處理2-3天，搖床轉(zhuǎn)速為20-30rpm。

58、在一些實(shí)施方式中，所述包埋包括使用瓊脂糖包埋胚胎。

59、在一些實(shí)施方式中，所述包埋包括：將瓊脂糖加入pbs緩沖液，得到質(zhì)量濃度為0.8％瓊脂糖，融化后降溫至50℃，將胚胎放至膠中間，瓊脂糖室溫凝固后，將其放置于4℃繼續(xù)凝固15分鐘。

60、在一些實(shí)施方式中，在脫脂處理、通透化處理、免疫染色和/或核染色、脫水處理、透明化處理步驟中，放置有胚胎的容器中至多放置兩個(gè)胚胎。

61、在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括成像拍攝的步驟。

62、成像拍攝是指將樣品置于光片顯微鏡的樣品裝置中，使用光片顯微鏡配套的軟件設(shè)置好拍攝參數(shù)，先進(jìn)行快速拍攝和預(yù)成像；再根據(jù)樣品預(yù)成像的結(jié)果調(diào)整拍攝參數(shù)，對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)致的掃描并成像。

63、在一些實(shí)施方式中，所述卵鞘是指蜚蠊科昆蟲的卵鞘。

64、在一些實(shí)施方式中，所述蜚蠊科昆蟲包括美洲大蠊。

65、本發(fā)明第三方面提供一種試劑盒，包含固定劑，所述固定劑包含含有甲醛和triton?x-100的pbt緩沖液，所述pbt緩沖液為含有bsa和triton?x-100的pbs緩沖液。

66、在一些實(shí)施方式中，所述pbt緩沖液為含有1-5g/l?bsa、5-15ml/l?triton?x-100的pbs緩沖液。

67、在一些實(shí)施方式中，所述固定劑由pbt緩沖液、甲醛和triton?x-100按照體積比(7-9):(1-3):(0.5-1.5)混合得到。

68、在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒中還含有脫脂劑、通透劑、脫水劑和透明化試劑。

69、在一些實(shí)施方式中，所述脫脂劑含有尿素、四羥丙基乙二胺、triton?x-100。

70、在一些實(shí)施方式中，按質(zhì)量百分比計(jì)，所述脫脂劑中含有20％-30％的尿素，20％-30％的四羥丙基乙二胺，10％-20％的triton?x-100，余量水。

71、在一些實(shí)施方式中，所述通透劑包含含有triton?x-100、dmso、甘氨酸和edta-na的pbs緩沖液。

72、在一些實(shí)施方式中，所述通透劑為含有1-3μl/ml的triton?x-100、0.1-0.3ml/ml的dmso、0.01-0.03g/ml的甘氨酸、0.002-0.004g/ml的edta-na的pbs緩沖液。

73、在一些實(shí)施方式中，所述脫水劑包含濃度梯度遞增的甲醇溶液。

74、在一些實(shí)施方式中，所述脫水劑包含濃度范圍為20％-100％的濃度梯度遞增的甲醇溶液，所述甲醇溶液由甲醇和pbs緩沖液混合得到。

75、在一些實(shí)施方式中，透明化試劑包含二芐醚。

76、在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒中還含有pbt緩沖液；

77、在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒中還含有用于免疫染色和/或核染色的試劑。

78、在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒中用于免疫染色的試劑包含一抗、熒光二抗和抗原封閉液。所述一抗用于標(biāo)記目標(biāo)蛋白，所述熒光二抗是與所述一抗對(duì)應(yīng)的熒光抗體。

79、在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒中用于核染色的試劑包含核酸染料。所述核酸染料可以是任意可用于核酸染色的染料，比如sytox?green。

80、本發(fā)明第四方面提供第三方面的試劑盒在以下任意一方面的應(yīng)用：

81、固定卵鞘內(nèi)胚胎；

82、觀察卵鞘內(nèi)胚胎內(nèi)部活動(dòng)；

83、制備固定卵鞘內(nèi)胚胎的產(chǎn)品；

84、制備觀察卵鞘內(nèi)胚胎內(nèi)部活動(dòng)的產(chǎn)品。

85、在一些實(shí)施方式中，所述卵鞘是指蜚蠊科昆蟲的卵鞘；

86、在一些實(shí)施方式中，所述蜚蠊科昆蟲包括美洲大蠊。

87、本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種可以保持卵鞘內(nèi)胚胎的蛋白結(jié)構(gòu)的化學(xué)固定方法，據(jù)此獲得的胚胎在保持結(jié)構(gòu)的完整時(shí)能夠進(jìn)行免疫蛋白的標(biāo)記。

88、本發(fā)明還提供一種觀察卵鞘內(nèi)胚胎內(nèi)部細(xì)胞活動(dòng)的樣品制備方法，為卵生動(dòng)物早期胚胎發(fā)生的研究提供方法參考。