本發(fā)明涉及生物檢測試劑，特別涉及一種豬輪狀病毒間接酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

1、豬輪狀病毒(porcine?rotavirus,porv)是造成仔豬病毒性腹瀉的主要病因之一。豬輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科、輪狀病毒屬，該病毒流行范圍廣泛，在多個國家均有感染的報道，目前已在世界范圍內(nèi)形成流行趨勢。豬輪狀病毒多感染10～60日齡仔豬，發(fā)病率高達(dá)80％，新生仔豬感染該病毒后的死亡率可達(dá)100％。仔豬感染該病毒后，主要出現(xiàn)精神萎靡、嘔吐、食欲下降、持續(xù)腹瀉等癥狀，并易出現(xiàn)繼發(fā)性細(xì)菌感染，造成仔豬的生長發(fā)育遲緩；嚴(yán)重者糞便帶血，脫水死亡。近年來，也出現(xiàn)很多大豬和種豬隱形感染的報道，主要影響其生長發(fā)育，增大豬場淘汰率，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2、粘膜作為豬全身分布最廣的免疫系統(tǒng)，其即可誘導(dǎo)局部免疫應(yīng)答又可誘導(dǎo)全身免疫應(yīng)答，免疫效果好，尤其是初生仔豬由于無法進(jìn)行疫苗免疫，乳汁粘膜免疫在其抵抗外部抗原入侵發(fā)揮重要的作用，而乳汁黏膜免疫主要是哺乳仔豬通過母乳從母體中獲得抗體而達(dá)到的。乳汁黏膜免疫主要起作用的抗體為siga，是作為評價黏膜免疫重要指標(biāo)。siga是參與粘膜免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)因子，它們是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，在免疫應(yīng)答中起著重要作用。siga能夠抗病毒、中和毒素及其它生物活性抗原，具有廣泛的免疫保護(hù)作用。在porv感染的情況下，siga可能通過在腸道黏膜表面形成保護(hù)層，幫助阻止病毒的黏附和侵入，從而為豬只提供一定程度的被動免疫保護(hù)。

3、目前比較常見的porv實驗室診斷方法包括電鏡觀察技術(shù)(em)、病毒中和試驗、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)、膠體金免疫層析技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)等。這些方法雖都有各自的優(yōu)點，但也存在耗時較長、檢測難度大、檢測結(jié)果不確定性、所需設(shè)備條件和不適合活體檢測等缺點。其中elisa具有簡便、快速、敏感、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點。相比其他方法，該方法對實驗條件的要求更加寬松，更適應(yīng)于基層實驗室檢測；操作簡單，不嚴(yán)格要求檢測人員的技術(shù)水平；更適應(yīng)于大規(guī)模樣品檢測，可用于檢測臨床樣品或用于流行病學(xué)調(diào)查。然而，目前所用的elisa方法均是用來檢測igg抗體。由于豬輪狀病毒感染后，igg抗體產(chǎn)生相對較慢；且研究表明，全身的體液免疫對該病原的免疫保護(hù)作用不大。相反，腸道局部產(chǎn)生的黏膜免疫和細(xì)胞免疫能產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)效果。因此，建立siga的elisa檢測方法更適用于該病的早期診斷與主動免疫后免疫指標(biāo)。

4、porv基因組由11個雙股rna節(jié)段組成，編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白(vp1，vp2，vp3，vp4，vp6和vp7)及6種非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp1，nsp2，nsp3，nsp4，nsp5和nsp6)。其中編碼結(jié)構(gòu)蛋白vp6的基因組序列高度保守，且具有抗原特異性、免疫原性和轉(zhuǎn)錄活性，能夠參與病毒轉(zhuǎn)錄，并與其他蛋白發(fā)生相互作用，指導(dǎo)結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的合成，對于病毒感染細(xì)胞、病毒復(fù)制和發(fā)揮致病功能都十分重要。vp6蛋白是病毒中含量最多的蛋白，約占病毒粒子質(zhì)量的50～60％。大量研究表明，vp6蛋白的特異性抗體在防止輪狀病毒感染過程中起到了重要作用。基于以上特性，該蛋白非常適合用于porv檢測的各類相關(guān)免疫學(xué)試驗。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種檢測豬輪狀病毒的間接酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。本發(fā)明利用結(jié)構(gòu)蛋白vp6，建立了一種敏感性強(qiáng)、特異性好、穩(wěn)定性佳的間接siga-elisa檢測方法，以便更快、更加準(zhǔn)確、更加簡便的實現(xiàn)檢測，為豬輪狀病毒的綜合防控提供技術(shù)支持。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明的豬輪狀病毒間接酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的抗原vp6純化蛋白，制備過程如下：

4、在ncbi上下載豬porv的vp6基因序列(genbank：mt874988)并發(fā)送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行質(zhì)粒合成。將獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，并篩選出含kan+抗性的優(yōu)勢單菌落后增菌培養(yǎng)。在iptg中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，而后進(jìn)行超聲破碎。采用全自動蛋白純化儀對該重組蛋白進(jìn)行純化，收集蛋白并進(jìn)行水煮制樣，通過sds-page電泳驗證該蛋白，并置于-80℃保存。使用western?blot方法對獲得的純化蛋白進(jìn)行驗證，該重組蛋白能夠與小鼠抗輪狀病毒血清反應(yīng)。

5、本發(fā)明提供了一種豬輪狀病毒間接酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，所述試劑盒包括酶標(biāo)板、一抗稀釋液、酶標(biāo)二抗工作液、tmb顯色液、終止液、洗滌工作液，所述的酶標(biāo)板的微孔條上預(yù)包vp6純化蛋白抗原；

6、所述vp6純化蛋白抗原包被量為0.25～2μg/ml；

7、所述一抗稀釋液為pbst，所述一抗稀釋度為1∶(150～600)；

8、所述酶標(biāo)二抗工作液為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬iga，所述二抗稀釋度為1∶(5000～40000)；

9、所述酶標(biāo)板封閉液為2％?bsa；

10、進(jìn)一步，所述vp6純化蛋白抗原包被量為0.25～0.5μg/ml，所述一抗稀釋度為1∶(150～300)，所述二抗稀釋度為1∶(30000～40000)。

11、進(jìn)一步，所述vp6純化蛋白抗原包被量為0.25μg/ml，所述一抗稀釋度為1∶150，所述二抗稀釋度為1∶30000。

12、進(jìn)一步，所述顯色液為tmb顯色液，所述終止液為2mm?h2so4，所述洗滌液為磷酸鹽緩沖液。

13、本發(fā)明還提供了所述的間接酶聯(lián)免疫試劑盒檢測豬輪狀病毒的方法，其特征在于，檢測程序如下：

14、(1)包被：使用包被緩沖液將豬輪狀病毒的vp6純化蛋白稀釋后，在96孔聚苯乙烯酶聯(lián)反應(yīng)板的每個反應(yīng)孔中加100μl，37℃孵育1～2小時或4℃過夜孵育；棄包被液，洗滌工作液洗滌3次，拍干；

15、(2)封閉：加入封閉液2％?bsa250μl/孔，37℃孵育1～2.5h；棄封閉液，洗滌液洗滌3次，拍干；

16、(3)一抗孵育：使用一抗稀釋液pbst將陽性對照、陰性對照和待檢樣本按照比例稀釋；取100μl稀釋好的陽性對照、陰性對照和待檢樣本分別加入其對應(yīng)的反應(yīng)孔中，37℃條件下孵育30～60min；棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌工作液洗3次，拍干；

17、(4)酶標(biāo)二抗孵育：將酶標(biāo)二抗按照比例進(jìn)行稀釋，取100μl加入各個反應(yīng)孔中，37℃條件下孵育30～60min。棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌工作液洗3次，拍干；

18、(5)顯色：在各個反應(yīng)孔中加入100μl?tmb顯色液，37℃條件下反應(yīng)5～20min；

19、(6)終止：在各個反應(yīng)孔中加入50μl?2mm?h2so4終止液，混勻；

20、(7)讀數(shù)：在elisa檢測儀上，于450nm處測各孔o(hù)d值；

21、(8)判定：當(dāng)待檢樣本od450≥0.4912，判定該樣本為陽性；待檢樣本od450＜0.4912，判定該樣本為陰性。

22、進(jìn)一步，封閉時間為2～2.5h。優(yōu)選地，封閉時間為2h。

23、進(jìn)一步，一抗孵育時間為30～45min。優(yōu)選地，一抗孵育時間為30min。

24、進(jìn)一步，二抗孵育時間為30～45min，優(yōu)選地，30min。

25、進(jìn)一步，顯色時間為10～15min，優(yōu)選10min。

26、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果在于：

27、本發(fā)明以輪狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白vp6為抗原，建立了一種vp6間接siga-elisa檢測試劑盒，該試劑盒敏感性強(qiáng)、特異性好、穩(wěn)定性佳，能夠?qū)崿F(xiàn)更快、更加準(zhǔn)確、更加簡便的檢測，為豬輪狀病毒的綜合防控提供了技術(shù)支持。

28、本發(fā)明操作簡單，對實驗人員的操作技能要求較低；對設(shè)備的要求簡單，該檢測過程僅使用基礎(chǔ)混合物、洗滌實驗步驟和簡單的設(shè)備(酶標(biāo)儀)，易于在基層實驗室進(jìn)行；檢測過程用到的試劑簡單易得，降低了檢測成本，易于進(jìn)行大規(guī)模檢測；數(shù)據(jù)分析簡單，結(jié)果明確，易于解釋。