專利名稱：一種多重競(jìng)爭(zhēng)性pcr定量基因表達(dá)譜分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)基因表達(dá)分析領(lǐng)域，尤其涉及一種基于熒光通用引物的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR定量基因表達(dá)譜分析方法。
背景技術(shù)：
目前已發(fā)現(xiàn)有些基因的表達(dá)差異與疾病發(fā)生、藥物反應(yīng)相關(guān)，這些基因能夠作為疾病的遺傳標(biāo)志。研究特定組織中基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)新的疾病遺傳標(biāo)志基因，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。人類復(fù)雜性狀疾病是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。糖尿病、癌癥、老年性性癡呆和精神分裂癥等疾病的遺傳機(jī)理和相關(guān)效應(yīng)基因仍未最終揭曉。通過(guò)全基因組轉(zhuǎn)錄圖譜來(lái)查找候選基因是復(fù)雜性疾病研究的重要步驟，也對(duì)進(jìn)一步理解人類復(fù)雜性疾病和分子藥物的研發(fā)提供了幫助。目前，已有研究將轉(zhuǎn)錄圖譜用于癌癥診斷和療效比較、腫瘤分類，預(yù)測(cè)腫瘤對(duì)化學(xué)治療藥劑的療效等臨床分析中。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因表達(dá)譜分析手段也迅速發(fā)展起來(lái)。cDNA芯片能成功的從各種反應(yīng)條件下篩選出差異表達(dá)的基因，且被作為候選基因進(jìn)行假設(shè)驗(yàn)證和功能分析。芯片技術(shù)優(yōu)勢(shì)是一次分析幾千至上萬(wàn)基因，可用于大規(guī)模的基因表達(dá)篩選，但同時(shí)存在定量準(zhǔn)確度低的缺陷，極高的實(shí)驗(yàn)成本亦限制其廣泛推廣?；虮磉_(dá)分析中最常用的技術(shù)就是實(shí)時(shí)定量PCR (Real-time quantitative PCR)，它具有Northern blot等技術(shù)所不具有的定量分析能力，可對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。其具有穩(wěn)定性好、靈敏度高和7個(gè)數(shù)量級(jí)的定量線性等優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)它也存在單管檢測(cè)通量小、樣本處理費(fèi)時(shí)費(fèi)力成本高等缺點(diǎn)。 雖然有研究表明哺乳動(dòng)物細(xì)胞約含3萬(wàn)個(gè)基因，平均每個(gè)細(xì)胞約有1萬(wàn)個(gè)基因參加表達(dá)，但是通常的狀況是，10到50個(gè)基因表達(dá)與一種特定的疾病相關(guān)，10到50個(gè)基因和一個(gè)特定的通路和藥物反應(yīng)相關(guān)。此外，考慮到多基因性狀(Multigenic traits)受到基因-環(huán)境相互作用影響。因此一種可針對(duì)10種或數(shù)十種基因表達(dá)鑒定的分析方法亟待開(kāi)發(fā)，可對(duì)不同環(huán)境下大量的樣本進(jìn)行多個(gè)基因分析。貝克曼GeXP多重基因表達(dá)分析系統(tǒng)作為芯片和 PCR技術(shù)的換代產(chǎn)品，將多重PCR技術(shù)和毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合，采用通用引物和特異引物相結(jié)合的方法，實(shí)現(xiàn)多重基因定量檢測(cè)，其優(yōu)勢(shì)在于可在同一樣本中對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)， 大大提高了反應(yīng)效率，節(jié)約臨床資源和成本。但擴(kuò)增過(guò)程中位點(diǎn)間擴(kuò)增效率易相互影響，一個(gè)基因的表達(dá)會(huì)影響其他基因，而且這種終點(diǎn)法檢測(cè)，不能完全反應(yīng)初始模板的濃度。美國(guó) Sequenom公司基于競(jìng)爭(zhēng)性PCR結(jié)合質(zhì)譜分離技術(shù)進(jìn)行mRNA定量分析。競(jìng)爭(zhēng)性PCR最早是 wang等人于1989年發(fā)明用于目標(biāo)基因表達(dá)量的確定，其理論基礎(chǔ)是人工合成一段內(nèi)對(duì)照序列，其與目標(biāo)基因序列相似，但存在長(zhǎng)度上的差異，兩者用共同引物進(jìn)行擴(kuò)增，具備類似的擴(kuò)增效率，因此兩種擴(kuò)增產(chǎn)物量比值可以真實(shí)反映摻入內(nèi)對(duì)照與目標(biāo)基因mRNA量的比， 這樣根據(jù)內(nèi)對(duì)照摻入量可以很好評(píng)估目標(biāo)基因mRNA的量。這種競(jìng)爭(zhēng)PCR技術(shù)運(yùn)用到基因表達(dá)分析中降低了位點(diǎn)擴(kuò)增效率差異以及實(shí)驗(yàn)操作和檢測(cè)環(huán)境等外界環(huán)境的影響，從而降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差，提高數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。但質(zhì)譜平臺(tái)中產(chǎn)物質(zhì)譜峰比較低，檢測(cè)準(zhǔn)確性需控制背景信號(hào)，且保證合適的樣本與內(nèi)對(duì)照用量比，同時(shí)整個(gè)過(guò)程中反應(yīng)步驟比較多，顯得較為繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目標(biāo)是要克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種成本低、定量通量較高、樣本需要量低、檢測(cè)靈敏性高的多基因表達(dá)分析方法。該方法是基于競(jìng)爭(zhēng)性PCR原理，結(jié)合熒光通用引物和多重嵌合特異引物使用，實(shí)現(xiàn)多重PCR擴(kuò)增以及包括毛細(xì)管電泳在內(nèi)的長(zhǎng)度差異片段分離，對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因及一個(gè)或以上的參照基因進(jìn)行同時(shí)定量，并以參照基因校正獲取每個(gè)目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一種基于熒光通用引物的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR定量基因表達(dá)譜分析方法，包括以下步驟(1)提供多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物，由至少一對(duì)通用熒光引物、至少一對(duì)位于待測(cè)基因上下游的嵌合特異引物和至少一對(duì)參照引物組成所述通用熒光引物長(zhǎng)度范圍為10 25bp,5'端用熒光標(biāo)記，且對(duì)待測(cè)基因組無(wú)特異性匹配；所述嵌合特異引物和所述參照引物的長(zhǎng)度范圍為32 46bp，3’端為15 25bp的特異引物序列段，5’端為所述通用引物序列； 所述參照引物針對(duì)待測(cè)基因組的非待測(cè)基因設(shè)計(jì)，且與待測(cè)基因無(wú)特異性匹配；所述多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物所產(chǎn)生的不同擴(kuò)增產(chǎn)物片段之間有可檢出的長(zhǎng)度差異；(2)定量合成內(nèi)對(duì)照DNA片段針對(duì)待測(cè)基因和參照基因的擴(kuò)增產(chǎn)物片段，合成相對(duì)應(yīng)的內(nèi)對(duì)照序列，并進(jìn)行精確定量；所述內(nèi)對(duì)照序列與所述待測(cè)基因和參照基因的擴(kuò)增產(chǎn)物片段相比插入或缺失至少:3bp的DNA片段；(3)多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR的反應(yīng)過(guò)程a)用oligo (dT)引物逆轉(zhuǎn)錄合成所述待測(cè)基因和參照基因的cDNA ；b)將所述cDNA與所述的定量?jī)?nèi)對(duì)照片段混合，加入所述的通用熒光引物、嵌合特異引物和參照引物進(jìn)行多重競(jìng)爭(zhēng)性熒光PCR擴(kuò)增；使上下游的嵌合特異引物將通用引物序列加到各基因擴(kuò)增片段兩端；并使用高濃度的熒光通用引物完成PCR反應(yīng)過(guò)程；c)根據(jù)熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度不同，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行檢測(cè)，獲得待測(cè)基因與參照基因和內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度信息與相應(yīng)的熒光強(qiáng)度信息；(4)數(shù)據(jù)分析計(jì)算待測(cè)基因擴(kuò)增產(chǎn)物( 和內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物(I)的熒光峰高或峰面積之比(S/I)；計(jì)算參照基因擴(kuò)增產(chǎn)物( 和內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物(I)的熒光峰高或峰面積之比(S/I)；將待測(cè)基因的比值(S/I)除以參照基因的比值(S/I)即可獲得樣本目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。所述分析方法的優(yōu)選方案之一為，所述通用熒光引物長(zhǎng)度范圍為18 20bp。所述分析方法的優(yōu)選方案之二為，所述嵌合特異引物和所述參照引物的長(zhǎng)度范圍為 38 40bp。所述分析方法的優(yōu)選方案之三為，多重PCR引物對(duì)應(yīng)的不同擴(kuò)增產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度差異為8 50bp。所述分析方法的優(yōu)選方案之四為，所述嵌合特異引物和所述參照引物的3’端的特異引物序列段長(zhǎng)度為18 20bp。所述分析方法的優(yōu)選方案之五為，所述的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物由一到四對(duì)不同熒光標(biāo)記的通用熒光引物、一到二十五對(duì)針對(duì)相同或不同待測(cè)基因的嵌合特異引物和一到三對(duì)針對(duì)相同或不同基因的參照引物組成。優(yōu)選地，所述的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物由一對(duì)通用熒光引物、一到五對(duì)針對(duì)不同待測(cè)基因的嵌合特異引物和一對(duì)參照引物組成。極端地，所述的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物由一對(duì)通用熒光引物、一對(duì)嵌合特異引物和一參照引物組成。所述分析方法的優(yōu)選方案之六為，所述的熒光通用引物的3’端為兩個(gè)堿基的固定組合，如ct、ag、tc、gc、gt等等，在同一多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR的反應(yīng)中保持一致。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供上述的分析方法在找尋差異基因中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是提供一種基于上述的分析方法的試劑盒，提供通用熒光引物、嵌合特異引物、參照引物和定量的內(nèi)對(duì)照DNAJP /或多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR的反應(yīng)的試劑。本發(fā)明在總結(jié)現(xiàn)有技術(shù)中各種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)自主創(chuàng)新研發(fā)，成功地試用于疾病相關(guān)基因研究等領(lǐng)域，并且有廣泛的潛在臨床應(yīng)用市場(chǎng)。本發(fā)明令人驚奇地發(fā)現(xiàn)具有以下優(yōu)點(diǎn)1、競(jìng)爭(zhēng)PCR技術(shù)的運(yùn)用。目標(biāo)/參照基因片段與內(nèi)對(duì)照基因片段間序列基本一致性，保證終擴(kuò)增產(chǎn)物真實(shí)反應(yīng)初始模板量比；內(nèi)對(duì)照降低了位點(diǎn)擴(kuò)增效率差異以及實(shí)驗(yàn)操作和檢測(cè)環(huán)境等外界環(huán)境的影響，從而降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差，提高數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性；2、熒光通用引物的使用。針對(duì)所有的檢測(cè)位點(diǎn)，應(yīng)用熒光通用引物，引物的3 ’端統(tǒng)一為兩個(gè)堿基如ct，保證了不同位點(diǎn)擴(kuò)增的同步性和起始效率的一致性，大大降低了 PCR 反應(yīng)的復(fù)雜性，同時(shí)大大降低了實(shí)驗(yàn)成本；3、多個(gè)基因位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)。采用的多重PCR體系可一次性對(duì)少量樣本多個(gè)基因同時(shí)檢測(cè)，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期，提高了實(shí)驗(yàn)效率。


圖1為一個(gè)參照基因和三個(gè)目標(biāo)基因的多重PCR的試驗(yàn)結(jié)果。圖2為圖1的多重PCR的試驗(yàn)的原理示意圖(分析過(guò)程中涉及兩組引物一組是多重上下游嵌合特異引物；另一組是熒光通用引物)。圖3為實(shí)施例1中樣本檢測(cè)結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解，實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式有同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。實(shí)施例1利用本發(fā)明所述的方法對(duì)20個(gè)正常人及20個(gè)哮喘病人進(jìn)行通路基因檢測(cè)，選取了疾病通路中的5個(gè)目標(biāo)基因IL4、IL13、IL4Ra、STAT6、FCERI α，1個(gè)參照基因GAPDH同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)步驟1、通用引物、嵌合特異引物的設(shè)計(jì)(1)通用引物的設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)原則保證上下游引物的TM值≤57°C，針對(duì)人基因組特異，避免通用引物帶來(lái)非特異產(chǎn)物，通用引物的長(zhǎng)度為18bp，上游通用引物 5，端用Fam熒光標(biāo)記。通用引物序列為上游5，-TTCGTCCGTTCCGTCTAC-3’ ；下游 5， -GTTCCGTCCATCGTTCGT-3，。(2)上下游嵌合特異引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)5個(gè)目標(biāo)基因和1個(gè)參照基因的cDNA序列(GAPDH)信息，設(shè)計(jì)了 6對(duì)18 20bp長(zhǎng)的序列作為嵌合特異引物3’端特異引物序列段，要求TM值> 62 ，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度在120 350bp之間，相鄰產(chǎn)物長(zhǎng)度的差至少為8bp。之后與通用引物組合成嵌合特異引物，且在通用引物的3’端插入ct兩個(gè)堿基。所有的引物均經(jīng)過(guò)Blast和Oligo mask軟件的分析，從而減少非特異擴(kuò)增和引物二聚體。表一目標(biāo)基因與參照基因嵌合特異引物序列
權(quán)利要求
1.一種基于熒光通用引物的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR定量基因表達(dá)譜分析方法，包括以下步驟(1)提供多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物，由至少一對(duì)通用熒光引物、至少一對(duì)位于待測(cè)基因上下游的嵌合特異引物和至少一對(duì)參照引物組成所述通用熒光引物長(zhǎng)度范圍為10 25bp，5’ 端用熒光標(biāo)記，且對(duì)待測(cè)基因組無(wú)特異性匹配；所述嵌合特異引物和所述參照引物的長(zhǎng)度范圍為32 46bp，3’端為15 25bp的特異引物序列段，5’端為所述通用引物序列；所述參照引物針對(duì)待測(cè)基因組的非待測(cè)基因設(shè)計(jì)，且與待測(cè)基因無(wú)特異性匹配；所述多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物所產(chǎn)生的不同擴(kuò)增產(chǎn)物片段之間有可檢出的長(zhǎng)度差異；(2)定量合成內(nèi)對(duì)照DNA片段針對(duì)待測(cè)基因和參照基因的擴(kuò)增產(chǎn)物片段，合成相對(duì)應(yīng)的內(nèi)對(duì)照序列，并進(jìn)行精確定量；所述內(nèi)對(duì)照序列與所述待測(cè)基因和參照基因的擴(kuò)增產(chǎn)物片段相比插入或缺失至少:3bp的DNA片段；(3)多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR的反應(yīng)過(guò)程a)用oligo(dT)引物逆轉(zhuǎn)錄合成所述待測(cè)基因和參照基因的cDNA ；b)將所述cDNA與所述的定量?jī)?nèi)對(duì)照片段混合，加入所述的通用熒光引物、嵌合特異引物和參照引物進(jìn)行多重競(jìng)爭(zhēng)性熒光PCR擴(kuò)增；使上下游的嵌合特異引物將通用引物序列加到各基因擴(kuò)增片段兩端；并使用高濃度的熒光通用引物完成PCR反應(yīng)過(guò)程；c)根據(jù)熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度不同，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行檢測(cè)，獲得待測(cè)基因與參照基因和內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度信息與相應(yīng)的熒光強(qiáng)度信息；(4)數(shù)據(jù)分析計(jì)算待測(cè)基因擴(kuò)增產(chǎn)物( 和內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物(I)的熒光峰高或峰面積之比(S/I)；計(jì)算參照基因擴(kuò)增產(chǎn)物( 和內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物(I)的熒光峰高或峰面積之比(S/I)；將待測(cè)基因的比值(S/I)除以參照基因的比值(S/I)即可獲得樣本目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述通用熒光引物長(zhǎng)度范圍為18 20bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述嵌合特異引物和所述參照引物的長(zhǎng)度范圍為38 40bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，多重PCR引物對(duì)應(yīng)的不同擴(kuò)增產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度差異為8 50bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述嵌合特異引物和所述參照引物的3’端的特異引物序列段長(zhǎng)度為18 20bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物由一到四對(duì)不同熒光標(biāo)記的通用熒光引物、一到二十五對(duì)針對(duì)相同或不同待測(cè)基因的嵌合特異引物和一到三對(duì)針對(duì)相同或不同基因的參照弓I物組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物由一對(duì)通用熒光引物、一到五對(duì)針對(duì)不同待測(cè)基因的嵌合特異引物和一對(duì)參照引物組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的熒光通用引物的3’端為兩個(gè)堿基的固定組合。
9.權(quán)利要求1所述的分析方法在找尋差異基因中的應(yīng)用。
10.一種基于權(quán)利要求1所述的分析方法的試劑盒，提供通用熒光引物、嵌合特異引物、參照引物和定量的內(nèi)對(duì)照DNAJP /或多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR的反應(yīng)的試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于熒光通用引物的多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR檢測(cè)基因表達(dá)譜分析方法，包括下列步驟(1)提供多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR引物，由至少一對(duì)通用熒光引物、至少一對(duì)位于待測(cè)基因上下游的嵌合特異引物和至少一對(duì)參照引物組成；(2)定量合成內(nèi)對(duì)照DNA片段；(3)多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR反應(yīng)過(guò)程；和(4)數(shù)據(jù)分析。本發(fā)明還提供基于以上分析方法的試劑盒，適用于5～25個(gè)基因的研究特定藥物反應(yīng)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等特定基因表達(dá)譜分析，是一種準(zhǔn)確的、中通量的、經(jīng)濟(jì)的基因表達(dá)分析方案。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102534042SQ201210066050
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月14日
發(fā)明者肖君華, 陸炯, 陳燁, 陳軼群 申請(qǐng)人:上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司