專利名稱：抗微生物的膠原構(gòu)建體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于再生醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及從所加工的組織材料或基 質(zhì)制備的生物工程化的構(gòu)建體，該組織材料或基質(zhì)是動(dòng)物來源的。本發(fā)明的生物工程化 的構(gòu)建體是采用保持所加工的組織基質(zhì)的生物相容性、細(xì)胞相容性、強(qiáng)度和生物重塑性 能的方法制備的。為該生物工程化的構(gòu)建體賦予抗微生物性能，該構(gòu)建體用于移植、植 入、組織修復(fù)、創(chuàng)傷修復(fù)和重塑，或者用于哺乳動(dòng)物宿主中的其他用途。
背景技術(shù)：
簡介再生醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)領(lǐng)域?qū)⒐こ袒椒ê蜕茖W(xué)原理相結(jié)合起來，以便了 解正常及病理狀態(tài)下的哺乳動(dòng)物組織中結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。再生醫(yī)學(xué)和組織工程化 的目標(biāo)是開發(fā)并最終應(yīng)用生物代用品來保存、維持或改進(jìn)組織的功能。膠原是機(jī)體中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，約占機(jī)體總蛋白質(zhì)的三分之一。膠原構(gòu)成 皮膚、腱、骨和牙齒的有機(jī)物質(zhì)的大部分，而且在大多數(shù)其他機(jī)體結(jié)構(gòu)中作為纖維性內(nèi) 含物存在。膠原的一些性能包括高抗張強(qiáng)度；部分地由于螺旋結(jié)構(gòu)模擬潛在抗原決定簇 而產(chǎn)生的低抗原性；和低延展性、低半透性和低溶解性。此外，膠原是細(xì)胞附著的天然 物質(zhì)。這些和其他性能使得膠原成為組織工程化和制造可植入的生物相容性代用品和生 物重塑假體的合適材料。已經(jīng)對從被移植哺乳動(dòng)物組織中獲得膠原組織和組織構(gòu)造的方法以及用這些組 織和組織構(gòu)造構(gòu)建假體的方法進(jìn)行了廣泛研究，以用于創(chuàng)傷愈合、外科手術(shù)修復(fù)以及組 織或器官的替代。研究人員的持續(xù)目標(biāo)在于開發(fā)生物工程化的構(gòu)建體，該構(gòu)建體可成功 地用于提高患者所接受的衛(wèi)生保健的標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)明概述生物來源的膠原材料如腸粘膜下層可用于組織的修復(fù)或替換，并持續(xù)被開發(fā)和 改進(jìn)。給新的生物工程化的、可生物重塑的構(gòu)建體賦予抗微生物性能，以提高它們在 再生醫(yī)學(xué)中的優(yōu)良性能，再生醫(yī)學(xué)包括創(chuàng)傷愈合、組織的修復(fù)和替換。公開了處理豬 空腸近端的機(jī)械方法和化學(xué)方法，制備來源于腸粘膜下層的單一的、非細(xì)胞的腸膠原層 (ICL)，用該ICL制備具有抗微生物性能的薄片，用于治療、修復(fù)和替代。該加工去除 細(xì)胞和細(xì)胞碎片，而保留天然膠原組織基質(zhì)的結(jié)構(gòu)。用經(jīng)加工的組織基質(zhì)薄片制備具有 期望規(guī)格的單層和多層的層壓的、交聯(lián)構(gòu)建體。單層創(chuàng)傷敷料產(chǎn)品、層壓的多層補(bǔ)片用 于軟組織修復(fù)以及用作血管移植物的管狀構(gòu)建體的功效已經(jīng)被研究。經(jīng)加工的、腸道來 源的組織材料提供必需的物理支持，而產(chǎn)生最少的粘連，并且能夠整合到周圍天然組織 中，并被宿主細(xì)胞滲透。體內(nèi)生物重塑不包括這些構(gòu)建體的機(jī)械整合。該植入物的固有 性質(zhì)和功能性能是十分重要的參數(shù)，如彈性系數(shù)、縫合保持力和極性抗張強(qiáng)度，通過改 變層數(shù)和交聯(lián)條件等方式，使這些條件適合特定需求。將抗微生物性能引入到這些構(gòu)建 體中，控制或降低使用這些構(gòu)建體的處理部位的細(xì)菌活性。本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗微生物性能的生物工程化的膠原構(gòu)建體，其 包括源于如小腸粘膜下層的組織來源的片狀的純化膠原組織基質(zhì)層，或者經(jīng)加工的、源于小腸粘膜下層的腸道膠原層，它們均被抗微生物劑處理過。當(dāng)用本發(fā)明的生物工程 化的膠原構(gòu)建體作為創(chuàng)傷敷料處理哺乳動(dòng)物患者的傷口時(shí)，將該構(gòu)建體應(yīng)用于創(chuàng)面床上 以基本上覆蓋該傷口，給患者自身的皮膚組織提供一個(gè)濕潤的環(huán)境，以促進(jìn)皮膚組織再 生，同時(shí)該構(gòu)建體中的抗微生物劑控制或降低傷口中的細(xì)菌活性。構(gòu)建體具有生物相容 性是指該構(gòu)建體不具有細(xì)胞毒性，不會(huì)引起皮膚脫敏以及不會(huì)引起原發(fā)性皮膚炎癥。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，創(chuàng)傷敷料包括厚度約0.05mn到約0.07mm的經(jīng)加工的 腸道膠原片和一種抗微生物劑，該膠原片來源于小腸粘膜下層。鑒于該純化的組織基 質(zhì)的片狀幾何學(xué)特點(diǎn)，可以將它們疊加，然后將各層化學(xué)粘合在一起，得到多層的構(gòu)建 體。因此，其他的具體實(shí)施方案是包含雙層或更多層的純化組織基質(zhì)的構(gòu)建體，純化組 織基質(zhì)被粘合在一起而且經(jīng)過抗微生物劑的處理。本發(fā)明的構(gòu)建體可以是有網(wǎng)孔的、被 穿孔的或有窗的，以更適合創(chuàng)面床的大小，更好地排泄傷口滲出物，或者為了適應(yīng)上述 兩種需求。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于處理需要護(hù)理和處置的傷口，特別是需要抗微生物劑 介入和保護(hù)的傷口，該傷口包括如下創(chuàng)傷類型中的任何一種部分和完全厚度傷口、壓 迫性潰瘍、靜脈潰瘍、糖尿病潰瘍、慢性血管潰瘍、隧道/地雷傷口、外科手術(shù)傷口、 用于自體移植的供體部位傷口、Moh氏外科手術(shù)后傷口、激光手術(shù)后傷口、傷口開裂、 外傷傷口擦傷、破裂、二級燒傷、皮膚撕裂或者流液型傷口。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供用于處理和修復(fù)軟組織和器官的外科手術(shù)修復(fù)裝 置，如補(bǔ)片或者網(wǎng)膜，其包括雙層或更多層加工的、源于小腸粘膜下層的腸道膠原，其 層數(shù)可以在2到10之間，將這些腸道膠原粘合和交聯(lián)在一起，形成具有生物相容性和可 生物重塑的多層構(gòu)建體，當(dāng)將構(gòu)建體植入到受損或患病的軟組織時(shí)，同時(shí)發(fā)生可控制的 生物降解和足夠的活細(xì)胞替代，使得最初的植入假體被患者中的活細(xì)胞重塑。本發(fā)明的 另一個(gè)目的是提供處理需要修復(fù)和抗微生物劑介入的受損或患病的軟組織的方法，包括 植入一種假體，該假體包括包含兩層或多層疊加的、化學(xué)粘合的加工的、源于與抗微生 物劑接觸的小腸粘膜下層的腸道膠原，當(dāng)將該假體植入受損的或患病的軟組織時(shí)，同時(shí) 發(fā)生可控制的生物降解和適當(dāng)?shù)幕罴?xì)胞替代，使得最初的植入假體被患者中的活細(xì)胞重 塑。例如，需要修復(fù)的受損的或患病的軟組織是腹壁和胸壁缺陷、肌肉翻轉(zhuǎn)加固、直腸 和陰道下垂、骨盆底重建、疝氣、縫合線加固和重建過程。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及生物工程化的膠原構(gòu)建體(例如，假體、移植物)，包括片狀的純化 的膠原組織基質(zhì)層，該基質(zhì)層是經(jīng)加工的組織材料，來源于天然組織并被抗微生物劑處 理過，例如經(jīng)加工的、源于小腸粘膜下層的腸道膠原層。生物工程化的膠原構(gòu)建體可以 是單層的加工的組織基質(zhì)，或者是多層疊加的、粘合的加工的組織基質(zhì)。當(dāng)用本發(fā)明的 生物工程化的膠原構(gòu)建體處理哺乳動(dòng)物受試者的傷口時(shí)，將該構(gòu)建體應(yīng)用于創(chuàng)面床上以 基本上覆蓋該傷口，給患者自身的皮膚組織提供一個(gè)濕潤的環(huán)境以促進(jìn)皮膚組織再生， 同時(shí)抗菌成分控制或降低傷口中和傷口周圍的細(xì)菌活性。當(dāng)本發(fā)明的生物工程化的膠原 構(gòu)建體作為外科手術(shù)裝置時(shí)，將其植入到哺乳動(dòng)物受試者的植入部位，起到功能修復(fù)、 增強(qiáng)或替代機(jī)體部分或組織結(jié)構(gòu)的作用。抗微生物劑通過阻止細(xì)菌在構(gòu)建體上附著和增 殖，控制或降低傷口中或植入部位的細(xì)菌活性。本發(fā)明的抗菌構(gòu)建體具有生物相容性是指該構(gòu)建體不具有細(xì)胞毒性，不會(huì)引起皮膚脫敏以及不會(huì)引起原發(fā)性皮膚炎癥。本發(fā)明的假體也是“可生物重塑的”，是指發(fā)生可控制的生物降解，同時(shí)伴隨 宿主或患者的細(xì)胞提供內(nèi)源性的新基質(zhì)來重塑和替代，以產(chǎn)生新組織。因此，當(dāng)在本發(fā) 明的假體中摻入抗微生物劑并用作替代組織時(shí)，具有多種性能。第一，作為機(jī)體部分的 替代品或者傷口的覆蓋物。第二，當(dāng)作為機(jī)體部分的替代品時(shí)，起到作為宿主細(xì)胞向內(nèi) 生長的重塑模板的作用。第三，提供針對處理部位的局部抗微生物活性。本發(fā)明的假體材料是加工的、源于哺乳動(dòng)物膠原組織的純化的膠原組織基質(zhì)， 可將其自身或與經(jīng)過其他加工的、純化組織基質(zhì)粘合在一起，并使其具有抗微生物性 能，形成可用于移植或植入到需要處理的受試者機(jī)體的某個(gè)部位上的假體本發(fā)明包括用加工的組織材料制備組織工程化假體的方法，該方法無需用粘合 劑、縫合線或者釘子來將各層粘合在一起，而且能夠保持該假體的生物重塑性。術(shù)語
“加工的組織基質(zhì)”和“加工的組織材料”是指從動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物中獲得的天然 正常細(xì)胞組織，以機(jī)械方式清除掉附隨組織，并且以化學(xué)方式清除掉細(xì)胞、細(xì)胞碎片， 基本上不含有非膠原的細(xì)胞外基質(zhì)成分。加工的組織基質(zhì)基本上不含有并純化除去了非 膠原成分，保留了其天然的基質(zhì)結(jié)構(gòu)、組織、強(qiáng)度和形狀。用于制備本發(fā)明的生物工程 化的移植物的加工的組織材料成分來源于包含膠原的動(dòng)物組織，這種膠原組織的來源包 括但是不限于腸道、真皮、筋膜、包心膜、硬腦膜、胎盤和其他包含膠原組織基質(zhì)的 平面的或成面的構(gòu)造組織。這些組織的結(jié)構(gòu)和幾何學(xué)特點(diǎn)使得它們能夠容易地被清潔、 操作和裝配，用于制備本發(fā)明的生物工程化的移植物。根據(jù)本發(fā)明，技術(shù)人員能夠在其 他動(dòng)物來源中確定、獲得和處理具有類似平面結(jié)構(gòu)、幾何學(xué)特點(diǎn)和基質(zhì)組成的其他合適 組織來源。用于制備本發(fā)明的生物工程化的移植物的一種這種加工的組織基質(zhì)成分是源于 小腸粘膜下層的腸道膠原層。小腸的合適來源是哺乳動(dòng)物生物體，如人、奶牛、豬、綿 羊、狗山羊或者馬，而豬的小腸是容易獲得的來源。本發(fā)明的假體是采用經(jīng)加工的腸道膠原層(有時(shí)稱作為“腸道膠原層”或 "ICL")來制備的，該腸道膠原層是經(jīng)加工的、源于豬小腸粘膜下層的組織材料。在獲
取這種腸道膠原層的一種方法中，從哺乳動(dòng)物中收集小腸，粗略地將附屬的腸系膜組織 從小腸上分離。例如在與香腸包裝機(jī)中的那些輥?zhàn)宇愃频膶ο蜉佔(zhàn)又g，通過以機(jī)械方 式擠壓未被加工的腸道材料，除去肌層(被膜肌肉)和粘膜(被膜粘膜)。由于小腸的被 膜粘膜下層比周圍組織更硬，輥?zhàn)訉⑤^為柔軟的成分從粘膜下層中擠壓掉，得到以機(jī)械 方式清潔的組織基質(zhì)。在后面的實(shí)施例中，用刮腸機(jī)對豬小腸進(jìn)行機(jī)械清潔，然后在一 系列溶液中進(jìn)行化學(xué)清潔，得到經(jīng)加工的組織基質(zhì)。這種經(jīng)過機(jī)械清潔和化學(xué)清潔的源 于小腸粘膜下層的腸道膠原層在此被稱作為“ICL”，是用于制備本發(fā)明的抗菌構(gòu)建體的 一類經(jīng)加工的組織基質(zhì)或材料。從組成上看，經(jīng)加工的ICL組織材料是非細(xì)胞的I型端肽膠原，約為93%干燥重 量，具有少于約5%干燥重量的糖蛋白、粘多糖、蛋白多糖、脂質(zhì)、非膠原蛋白和核酸如 DNA和RNA，基本上不含有細(xì)胞和細(xì)胞碎片。經(jīng)加工的ICL組織材料大量保留了其基 質(zhì)結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度。重要的是，經(jīng)過清潔操作，部分保留了該組織基質(zhì)的生物相容性和生物 重塑性，不含有對膠原的生物重塑性起副作用的清潔劑殘留。因此，如同該組織在清潔操作中未被酶處理一樣，膠原分子保留了其端肽區(qū)。為了獲得經(jīng)加工的組織基質(zhì)，確定了適當(dāng)?shù)膭?dòng)物和組織來源。對組織進(jìn)行機(jī)械 處理和化學(xué)處理，除去附屬組織和非膠原成分，得到加工的組織基質(zhì)。作為一個(gè)例子， ICL是用于生產(chǎn)本發(fā)明的生物工程化的移植物假體的一類經(jīng)加工的組織基質(zhì)。遵照下文 描述的方法來處理組織，生成經(jīng)加工的組織基質(zhì)，用于制作包含ICL和抗微生物劑的生 物工程化的移植物假體。為了獲得豬ICL，用豬小腸粘膜下層作為本發(fā)明的生物工程化移植物假體的起始 材料。收集豬小腸，除去附屬組織，然后用刮腸機(jī)進(jìn)行機(jī)械清潔，結(jié)合機(jī)械作用和用水 洗滌，從被膜粘膜下層上強(qiáng)行地除去脂肪、肌肉和粘膜層。機(jī)械作用被描述成是當(dāng)完整 的腸子在一系列輥?zhàn)又g通過時(shí)，從被膜粘膜下層上擠壓并去掉相繼的各層。小腸粘膜 下層比周圍組織硬，輥?zhàn)訌恼衬は聦由蠈⑤^軟的成分?jǐn)D壓掉。技術(shù)人員能夠確定本領(lǐng)域 中的其他機(jī)械清潔手段，包括其他物理操作，例如刮擦、擠壓、壓縮和摩擦。進(jìn)行機(jī)械 清潔，使得僅保留腸道的粘膜下層，形成一種經(jīng)機(jī)械清潔的腸道。在機(jī)械清潔后進(jìn)行化學(xué)清潔處理，優(yōu)選在室溫下的無菌環(huán)境中進(jìn)行，從經(jīng)機(jī)械 清潔的腸道上除去細(xì)胞和基質(zhì)成分。從腸道內(nèi)腔的縱向切開經(jīng)機(jī)械清潔的腸道，然后切 成長度約15cm到50cm的切片。稱重后，將材料放到容器中，溶液與腸道材料的比例 為100 1 ν/ν。在最優(yōu)選的化學(xué)清潔處理中，如Abraham的美國專利US5,993,844和 US6,599,690中公開的方法，這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容在此被引入，在堿性條件下，如加入氫 氧化鈉(NaOH)，將膠原組織與有效量的螯合劑，例如乙二胺四乙酸鈉(EDTA)接觸；接 著與有效量的含鹽的酸，例如含氯化鈉的鹽酸(HCl)接觸；隨后與有效量的緩沖液，如 IM氯化鈉(NaCl)/IOmM磷酸緩沖生理鹽水(PBS)接觸；最后用水進(jìn)行洗滌。每個(gè)處 理步驟優(yōu)選使用旋轉(zhuǎn)的或搖動(dòng)的平臺，以提高化學(xué)溶液和洗滌溶液的作用。經(jīng)過清潔， 獲得經(jīng)加工的腸道膠原層，或經(jīng)機(jī)械和化學(xué)清潔加工的、源于小腸粘膜下層的組織基質(zhì) ICL0在洗滌后，從清潔容器中取出ICL，輕輕擠壓或擦拭，除去多余的水分。此時(shí)， 在被制備成假體之前，將ICL在-80°C下冷凍保存，在4°C的無菌磷酸溶液中保存，或者 進(jìn)行干燥。如果進(jìn)行干燥保存，將ICL薄片在一個(gè)平面上壓平，如放在平板，優(yōu)選多孔 的平板上或膜，如聚碳酸酯膜上，用解剖刀除去材料內(nèi)腔反面的任何淋巴附屬物，在室 溫和濕潤的條件下，在層流凈化罩中干燥ICL薄片。ICL是一種平面的薄片結(jié)構(gòu)，可用作為單層材料，或者被制作成作為假體的各種 類型的構(gòu)建體，假體形狀最終取決于其特定用途。為了形成本發(fā)明的多層假體，用一種 方法將ICL進(jìn)行層壓處理，使得在保留加工的基質(zhì)材料的生物相容性和生物重塑性的同 時(shí)，還保留其作為一種替代組織的強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)特征。加工的、源于組織的組織基質(zhì)保持 了天然組織基質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性，也就是說，起始材料的膠原基質(zhì)結(jié)構(gòu)仍然基本上是完整 的，并保持其物理性能，使得在植入時(shí)它具有許多固有的和功能的特點(diǎn)。在制備多層的 ICL層壓制品時(shí)，將ICL薄片疊加以與其他薄片接觸。無論是各層直接相互疊加在一起， 還是部分接觸或重疊來形成更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，接觸的部分是粘合的區(qū)域，各層在此相互 接觸。在作為機(jī)體部分的替代品的臨床應(yīng)用中，包括植入過程中和最初的康復(fù)階段，完 整構(gòu)建體中的粘合區(qū)域應(yīng)能夠經(jīng)受得起縫合和拉伸。在患者細(xì)胞定居并接著生物重塑假 體來形成新組織之前，粘合區(qū)域還應(yīng)該保持足夠的強(qiáng)度。
加工的組織基質(zhì)用作單層假體，或者被制備成平面的、管狀的或復(fù)雜形狀的多 層粘合假體。當(dāng)本發(fā)明的假體包含雙層或多層的經(jīng)加工的組織基質(zhì)時(shí)，將各層用化學(xué)交 聯(lián)劑交聯(lián)來使其粘合在一起。當(dāng)用化學(xué)交聯(lián)方法將多層加工的組織基質(zhì)粘合在一起時(shí)， 可以改變化學(xué)交聯(lián)程度，調(diào)整假體上的生物重塑速度，該速度是假體被重吸收并被宿主 細(xì)胞和組織替代的速度。換句話說，在本發(fā)明假體中的交聯(lián)程度越高，該假體被生物重 塑的速度越慢；相反，交聯(lián)程度越低，生物重塑的速度越快。外科手術(shù)指標(biāo)規(guī)定假體的 生物重塑的范圍和/或速度。例如，當(dāng)用單層構(gòu)建體作為創(chuàng)傷敷料時(shí)，該假體可以是經(jīng) 過化學(xué)交聯(lián)或未經(jīng)過化學(xué)交聯(lián)的。例如，作為外科手術(shù)修復(fù)補(bǔ)片或網(wǎng)膜，假體是交聯(lián)程 度低的多層構(gòu)建體，使得該假體將較快地被生物重塑。例如，作為支持超級易動(dòng)膀胱以 防止小便失禁的膀胱吊索，該假體是高度交聯(lián)的多層構(gòu)建體，使得該構(gòu)建體不被很快地 生物重塑，也就是說，該假體基本上保持同樣的構(gòu)造，使得其被植入的時(shí)間更長。當(dāng)呈現(xiàn)片狀時(shí)，膠原基質(zhì)或構(gòu)建體通常具有兩個(gè)相反的大面積表面。為了用 抗微生物劑處理加工的膠原基質(zhì)，應(yīng)用抗微生物劑時(shí)，將抗微生物劑與加工的膠原基質(zhì) 的兩面接觸，或結(jié)合到兩面上?？商娲?，利用加工的膠原基質(zhì)的纖維狀和吸收性能， 將抗微生物劑應(yīng)用到經(jīng)加工的膠原材料的內(nèi)部，應(yīng)用到經(jīng)加工的纖維狀組織基質(zhì)的空隙 中，例如將膠原基質(zhì)浸沒到含有抗微生物劑的溶液中，溶液通過吸收滲透到基質(zhì)中。將 抗微生物劑呈遞到多層構(gòu)建體內(nèi)部的另一種方法為處理單層的經(jīng)加工的組織基質(zhì)，然后 將各層疊加并粘合在一起。對于多層構(gòu)造而言，這些方法包括以任何順序?qū)嵤┯每刮?生物劑處理基質(zhì)薄片，將基質(zhì)薄片疊加形成多層并用交聯(lián)劑交聯(lián)該構(gòu)建體的制備步驟包 括如下步驟用抗微生物劑處理基質(zhì)薄片，將基質(zhì)薄片疊加形成多層，然后用交聯(lián)劑進(jìn) 行交聯(lián)；用抗微生物劑處理基質(zhì)薄片，用交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，然后將基質(zhì)薄片疊加形成多 層；用交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，用抗微生物劑處理基質(zhì)薄片，然后將基質(zhì)薄片疊加形成多層； 用交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，將基質(zhì)薄片疊加形成多層，然后用抗微生物劑處理基質(zhì)薄片；將基 質(zhì)薄片疊加形成多層，用交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，然后用抗微生物劑處理基質(zhì)薄片；或者將基 質(zhì)薄片疊加形成多層，用抗微生物劑處理基質(zhì)薄片，然后用交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)。在有些情 形下，在包被抗微生物劑之后對基質(zhì)進(jìn)行交聯(lián)可能不實(shí)用，因?yàn)橛行┛刮⑸飫?huì)被交 聯(lián)劑洗掉?？梢詫⑽唇?jīng)處理和經(jīng)處理的片層以不同排列疊加在一起，得到局部含有抗微生 物劑的假體。用于制備這種多層構(gòu)造的方法包括將經(jīng)抗微生物劑處理的組織基質(zhì)片層和 未經(jīng)處理的基質(zhì)片疊加在一起，形成多層構(gòu)建體，并將各層交聯(lián)。例如，至少疊加兩個(gè) 基質(zhì)片層，交聯(lián)并進(jìn)行抗菌處理，得到經(jīng)處理的基質(zhì)構(gòu)建體，然后將一層或多層未經(jīng)處 理的基質(zhì)薄片疊加到經(jīng)處理的基質(zhì)構(gòu)建體的上層表面或下層表面或者上下層表面上，接 著對該構(gòu)建體進(jìn)行交聯(lián)處理，得到組合的構(gòu)建體?？商娲?，至少疊加兩層未經(jīng)處理的 基質(zhì)薄片，交聯(lián)形成未經(jīng)處理的基質(zhì)構(gòu)建體，然后將一個(gè)或多個(gè)經(jīng)處理的基質(zhì)薄片疊加 到未經(jīng)處理的基質(zhì)構(gòu)建體的上表面或下表面或者上、下表面上，接著對該構(gòu)建體進(jìn)行交 聯(lián)處理，得到組合的基質(zhì)構(gòu)建體。在另一個(gè)實(shí)施例中，交替疊加經(jīng)處理的和未經(jīng)處理的 基質(zhì)薄片，然后交聯(lián)形成組合的構(gòu)建體。在另一個(gè)實(shí)施例中，交替地或以其他順序疊加 用兩種不同的抗微生物劑處理的基質(zhì)薄片，生成一種組合的構(gòu)建體。在另一個(gè)實(shí)施例 中，利用ICL材料的面，可以設(shè)定經(jīng)處理的和未經(jīng)處理的薄片之間的方向，或者薄片在組合的基質(zhì)構(gòu)建體中朝向經(jīng)處理的或未經(jīng)處理的基質(zhì)構(gòu)建體的方向。為了僅處理假體中所選擇的部分或區(qū)域，通過遮蓋不處理的表面部分，從而阻 止抗微生物劑與材料接觸，而表面的其他區(qū)域可以被處理，從而使得材料的部分表面可 以被抗微生物劑處理。將抗微生物劑定位于膠原基質(zhì)上的另一種方法為將膠原材料部分 浸沒在溶液槽或溶液池中，使得膠原基質(zhì)僅部分與抗微生物劑接觸，而其他部分未進(jìn)行 抗菌處理。將抗微生物劑定位于膠原基質(zhì)上的還有一種方法是將抗微生物劑噴灑或推進(jìn) 到材料的一個(gè)表面上，而不對反面進(jìn)行處理。將單層和多層的構(gòu)建體用抗微生物劑處理，使該構(gòu)建體具有抗微生物性能。將 整個(gè)或者部分構(gòu)建體與抗微生物劑接觸，將至少一種抗微生物劑應(yīng)用于到本發(fā)明的構(gòu)建 體上。優(yōu)選的抗微生物劑包括銀基抗微生物劑和基于化學(xué)品的抗微生物劑。組合物中還 含有抗生素?？梢杂媒M合試劑來處理膠原材料，提供廣譜的抗微生物活性，例如，銀基 抗微生物劑和基于化學(xué)品的抗微生物劑；基于化學(xué)品的抗微生物劑和抗生素；銀基抗微 生物劑和抗生素；或者三種試劑的組合。可以選擇銀基抗微生物劑，以賦予包含經(jīng)加工的組織基質(zhì)的假體以抗微生物性 能。通過幾種形式將銀應(yīng)用于膠原構(gòu)建體中。銀基抗微生物劑包括銀或含銀化合物，這 些化合物具有抗微生物活性，并且與膠原構(gòu)建體和患者相容。純銀也被稱作為元素銀或 貴金屬銀，相對無活性，在常溫下不與水或者氧氣發(fā)生反應(yīng)，而且不溶于弱酸和弱堿。也可以使用銀離子。一般認(rèn)為，離子形式的銀尚且不能產(chǎn)生抗微生物性能，其 抗微生物的可能性小于其他抗微生物劑。雖然不期望受任何理論的約束，離子形式的銀 通過直接影響細(xì)胞和細(xì)胞壁的呼吸和運(yùn)輸以及繁殖，來有效地抵抗細(xì)菌、酵母和真菌以 及細(xì)胞外的病毒。還可以使用其他形式的銀，包括但是不限于氧化銀；硝酸銀；磺 胺嘧啶銀(silver sulfazidine)(磺胺嘧啶銀⑴包含一種不溶的聚合物化合物，其作為抗微 生物劑和抗真菌劑時(shí)緩慢地釋放銀離子，可局部用于處理嚴(yán)重的燒傷，防止細(xì)菌感染)； 咪唑銀；磷酸鉀銀(arglaes) (AgKaP04)；膠態(tài)微粒銀；晶體銀，例如銀納米晶體，也被 稱作為“納米晶體銀”，這是給傷口或植入物部位遞送并持續(xù)釋放銀陽離子及其自由基 的另一種方法。按照數(shù)種不同的方法制備納米晶體銀(“納米銀”)組合物。一種方法為脈沖 等離子體方法，產(chǎn)生具有規(guī)則的晶格結(jié)構(gòu)的納米晶體，該晶格結(jié)構(gòu)缺乏原子雜亂但是具 有高保真度的均勻分布和形態(tài)學(xué)。脈沖等離子體方法利用兩個(gè)導(dǎo)電的加料棒。將這兩個(gè) 棒插入到充滿大氣壓力下的受控氣體的反應(yīng)室中，氣體最可能是惰性氣體如氬。將棒與 高壓、脈沖放電電源連接。通過加料棒從脈沖電源快速釋放電壓，來合成納米材料。高 壓放電使得原材料變成高溫、高壓的金屬等離子體。由于利用了獨(dú)特的氣體動(dòng)力學(xué)，等 離子體迅速擴(kuò)張到周圍氣體中，產(chǎn)生均勻的納米顆粒氣相懸浮液。用封閉的環(huán)狀系統(tǒng)連 續(xù)收集生成的納米顆粒。根據(jù)操作的參數(shù)，該方法制備的納米晶體銀顆粒的直徑為lOnm 到lOOnm。通常選擇在15nm到40nm之間，或者在20nm到25nm之間的顆粒用于本發(fā) 明中。制備納米銀組合物的其他方法包括Burrell的美國專利US6,719,987中描述的那些 方法。這些方法產(chǎn)生具有特征在于的原子雜亂的晶格的晶體。在Burrell的方法中，在 氣相中生成將要被沉淀的材料，例如通過蒸發(fā)或?yàn)R射生成，并將其輸送到一個(gè)溫度受控制的大空間中。材料的原子與工作氣體環(huán)境中的原子碰撞，損失能量并迅速地從汽相冷 凝到冰冷的底物上，例如液氮冷卻的指狀物上。通過限制擴(kuò)散的條件產(chǎn)生原子雜亂，使 得在材料中保留了足夠的原子雜亂。在-io°c到100°C的低底物溫度下；使用高于標(biāo)準(zhǔn) 值的工作氣壓；小于約30度的入射角；較高的產(chǎn)生高于正常原子流量的沉淀速度來沉淀 銀。通過所謂”摻雜”的方法或者通過在反應(yīng)室中摻入反應(yīng)氣體(即氧氣)，在金屬基 質(zhì)中存在不同原子或分子來達(dá)到原子雜亂的目的。按照該方法，氧氣是工藝氣體中的組 成部分。可以將基于化學(xué)品的抗微生物劑應(yīng)用于膠原構(gòu)建體中，以使構(gòu)建體具備抗微生 物性能。不作為窮舉，基于化學(xué)品的抗微生物劑可選自如下聚六亞甲基雙胍鹽酸鹽 (PHMB)；葡萄糖酸氯己定；二氨基聚雙胍，如US6,316,669中描述的那些，該文獻(xiàn)的 公開內(nèi)容在此被引入；蜂蜜；苯扎氯銨；三氯生(2，4，4'-三氯-2'-羥基二苯基 醚)；以及甲硅烷基季銨鹽(十八碳烷基二甲基三甲氧基甲硅烷基丙基氯化銨)。除了抗微生物劑外，膠原構(gòu)建體還包含一種抗生素?？股厥怯梢环N由微生物 產(chǎn)生的物質(zhì)，其殺死其他微生物或抑制其他微生物的生長。通常，抗生素是低分子量的 (非蛋白質(zhì))分子，作為次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的，主要由土壤中的微生物產(chǎn)生。大部分的 這種微生物形成某類孢子或其他潛伏細(xì)胞，一般認(rèn)為在抗生素的生成與孢子形成之間存 在某些聯(lián)系。其中，最有名的抗生素生產(chǎn)者是青霉菌屬和頭孢菌屬，它們是包括青霉素 和相關(guān)化合物在內(nèi)的日內(nèi)酰胺類抗生素的主要來源。在細(xì)菌中，放射菌屬，特別是鏈霉 菌，產(chǎn)生多種類型的抗生素，包括氨基糖苷，如鏈霉素，大環(huán)內(nèi)酯物，如紅霉素和四環(huán) 素。形成內(nèi)生孢子的桿菌生產(chǎn)多肽類抗生素，例如多粘菌素和桿菌肽。對于一定范圍內(nèi) 的微生物來說，抗生素具有殺滅作用，即“殺死”作用，或者具有靜止作用，是指一種 “抑制”作用?？股氐淖饔梅秶侵甘芷溆绊懙募?xì)菌或其他微生物的范圍?？股赜?br> 效抵抗原核生物，殺死或者抑制大范圍的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌，被稱作為“廣 譜”；那些主要抵抗革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌的被稱作為“窄譜”；而那些有 效抵抗單一生物體或疾病的是“限譜”。優(yōu)選使用的抗生素化合物是廣譜抗生素。將抗 生素化合物以組合方式提供給膠原構(gòu)建體，例如以窄譜的革蘭氏陽性化合物與窄譜的革 蘭氏陰性化合物的組合形式；但是，廣譜、窄譜和限譜的抗生素的任何組合都是可被使 用的。用于本發(fā)明中的抗生素包括內(nèi)酰胺(青霉素和頭孢菌素)，例如青霉素 G，頭孢菌素；半合成的青霉素(還包括克拉維酸(clavulanicacid))，例如氨芐青霉素、 羥氨芐青霉素以及甲氧苯青霉素；單環(huán)內(nèi)酰胺(monobactam)，例如氨曲南(aztreonam)； 羧基青霉烯(carboxypenem)，例如亞胺培南(imipenem)；氨基糖苷，例如鏈霉素；慶 大霉素；糖肽，例如萬古霉素；林肯霉素，例如氯潔霉素；大環(huán)內(nèi)酯，例如紅霉素；多 肽，例如多粘菌素；桿菌肽；多烯，例如兩性霉素；制霉菌素；利福霉素，例如利福 平；四環(huán)素，例如四環(huán)素；半合成的四環(huán)素，例如強(qiáng)力霉素；和氯霉素。經(jīng)加工的組織基質(zhì)單獨(dú)作為一個(gè)單層被用于單層假體中，或者用于制作具有雙 層或多層的假體。如果用作單層，將抗微生物劑與經(jīng)加工的組織基質(zhì)接觸，使基質(zhì)具有 抗微生物性能。在與抗微生物劑接觸之前或之后，將經(jīng)加工的組織基質(zhì)交聯(lián)，控制該材 料的生物重塑和生物降解的速度。換句話說，單層的抗微生物構(gòu)建體為單層并用抗微生物劑處理過；用交聯(lián)劑交聯(lián)的單層，然后用抗微生物劑處理；用抗微生物劑處理單 層，然后用交聯(lián)劑交聯(lián)。使用ICL制備包含雙層或多層經(jīng)加工的組織基質(zhì)的多層假體的方法已經(jīng)被公 開。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案涉及扁平的片狀假體以及制備和使用該片狀假體的 方法，該假體由雙層或多層粘合并交聯(lián)在一起的ICL組成，作為能夠被患者的細(xì)胞生物 重塑的可移植生物材料。鑒于ICL的扁平的片狀結(jié)構(gòu)，該假體容易被制作來包含任意層 數(shù)，優(yōu)選2 10層，更預(yù)選2 6層，層數(shù)取決于該構(gòu)建體的最終特定用途所需的強(qiáng)度 和大小。ICL具有沿著大體相同方向排列的結(jié)構(gòu)基質(zhì)纖維。進(jìn)行層疊時(shí)，可以改變各層 方向以調(diào)節(jié)經(jīng)加工的組織片層中的總體組織纖維方向。將薄片層疊，使得它們的纖維相 互平行或者以不同的角度定向。也可以將片疊加來形成一種構(gòu)建體，其具有跨越該假體 區(qū)域的連續(xù)的數(shù)層?？商娲?，由于疊加排列的最終尺寸受到腸道圓周的限制，可以將 各層以拼貼的方式交叉排列而得到一種片狀構(gòu)建體，其表面積大于原始材料尺寸，但是 跨越假體區(qū)域沒有連續(xù)的層?？梢砸霃?fù)雜的結(jié)構(gòu)特征，例如在片層之間穿過或者橫越 片層的管道或通道，形成管道結(jié)構(gòu)或網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在包括ICL的多層構(gòu)建體的制作中，當(dāng)以滅菌的ICL材料開始時(shí)，優(yōu)選采用無
菌環(huán)境和消毒工具來保證構(gòu)建體的無菌性。為了制備多層的ICL構(gòu)建體，將第一個(gè)無菌 的剛性支持部件，如剛性聚碳酸酯薄片放置在層流室的無菌場中。如果經(jīng)過機(jī)械和化學(xué) 的清潔處理，ICL薄片仍處于未水合狀態(tài)，可在水溶液中，例如在水或者磷酸緩沖生理鹽 水中對它們進(jìn)行水合處理。用無菌吸水布擦拭ICL薄片，從該材料上吸掉多余水分。如 果還不行，對ICL材料進(jìn)行修整，從內(nèi)腔反面的漿膜表面上除去任何的淋巴附屬物。將 第一個(gè)經(jīng)修整的ICL薄片放置在聚碳酸酯薄片上，用手捋平聚碳酸酯薄片以除去任何氣 泡、折疊和皺褶。將第二個(gè)經(jīng)修整的ICL薄片放置在第一個(gè)薄片上，再用手捋平聚碳酸 酯薄片以除去任何氣泡、折疊和皺褶。重復(fù)操作直到獲得用于特定用途的期望層數(shù)，優(yōu) 選2 10層。天然的管狀I(lǐng)CL具有面的特征在天然狀態(tài)下朝向腸道內(nèi)腔的內(nèi)粘膜表面以及 朝向腔外的相反的外漿膜表面。已知這些表面影響假體的手術(shù)后性能的特征，但是可以 進(jìn)行調(diào)整來提高裝置的性能。目前由于使用合成裝置，產(chǎn)生附著，使得有必要再進(jìn)行操 作來從周圍組織中除去該附著物。在具有雙層TCL的心包補(bǔ)片或者疝氣修復(fù)假體的制備 過程中，優(yōu)選這兩個(gè)層的粘合區(qū)域處于漿膜表面之間，這是由于粘膜表面已被證明能夠 在植入后防止手術(shù)后的附著產(chǎn)生。在其他具體實(shí)施方案中，優(yōu)選ICL補(bǔ)片假體的一個(gè)表 面是無粘著力的、非附著性的，而其他表面具有粘附到宿主組織上的親合力。在這種情 形下，假體具有一個(gè)粘膜表面和其他漿膜表面。在還有另一個(gè)具體實(shí)施方案中，優(yōu)選相 反表面能夠產(chǎn)生附著力，使與之任意側(cè)面接觸的組織長在一起，因此，該假體在構(gòu)建體 的兩側(cè)具有漿膜表面。如果構(gòu)建體是由雙層以上的薄片組成的，植入時(shí)僅兩個(gè)外層薄片 可能與其他機(jī)體結(jié)構(gòu)接觸，內(nèi)層可能對手術(shù)后的附著形成并不起作用，則內(nèi)層的方向較 不重要。在疊加完期望數(shù)量的ICL薄片后，通過將薄片一同脫水，在連接區(qū)域?qū)⑺鼈冋?合，也就是說，在薄片接觸之處粘合。盡管不期望受任何理論的約束，但是脫水時(shí)水分
12從ICL基質(zhì)的纖維之間被除去，引起ICL層的膠原纖維聚集在一起?？赡軐Φ谝粋€(gè)支持部 件的裸露面進(jìn)行脫水，或者在第一個(gè)支持部件和第二個(gè)支持部件之間進(jìn)行脫水，例如， 在進(jìn)行干燥處理之前，將第二個(gè)聚碳酸酯薄片放置在最上層的ICL上，施加少量壓力或 不施加壓力，固定在第一個(gè)支持部件上，使所有層以扁平的平面排列在一起。為了便于 脫水，支持部件是多孔的，以便氣體和水分通過，到達(dá)脫水層。在空氣中、真空中或者 通過化學(xué)手段，對片層進(jìn)行干燥處理，化學(xué)手段如使用丙酮或醇例如乙醇或異丙醇。脫 水到室內(nèi)濕度，在約10%相對濕度到約20%相對濕度之間，或更低；或者約10%到約 20%w/w的濕度，或更低。脫水是容易實(shí)施的，通過改變固定聚碳酸酯薄片的框架的角 度，直到ICL片層朝向源于層流室的氣流，在約20°C的室溫下和室內(nèi)濕度下處理至少約1 小時(shí)到24小時(shí)。盡管不是必需的，但是在一種實(shí)施方案中，在交聯(lián)之前對要脫水的片層進(jìn)行脫 水。將要脫水的ICL片層從多孔支持物上一同剝離下來，在水溶性再水合試劑中再水 合，優(yōu)選在水中再水合，將它們轉(zhuǎn)移到含有水溶性再水合試劑中，在約4°C到約20°C的 溫度下放置至少約10到約15分鐘，對這些片層進(jìn)行再水合處理，而無需將它們分離或分層。然后將疊加的ICL與交聯(lián)劑接觸，在粘合區(qū)域?qū)⒈幻撍恼澈掀瑢踊蛘弑幻撍?和再水合的粘合片層交聯(lián)在一起，優(yōu)選使用化學(xué)交聯(lián)劑交聯(lián)，以保護(hù)ICL材料的生物重 塑性。如上提及，脫水使得鄰近的ICL層的基質(zhì)中的膠原纖維聚集在一起，將那些片 層交聯(lián)在一起，在粘合片層的成分之間形成化學(xué)鍵。對粘合假體裝置進(jìn)行交聯(lián)還為該裝 置提供了強(qiáng)度和持久性，以改進(jìn)其操作性能。各種類型的交聯(lián)劑在本領(lǐng)域中是已知的， 并且可以被使用，例如核糖和其他糖、氧化劑和脫水加熱(DHT)方法。優(yōu)選的交聯(lián)劑 是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)。在另一種優(yōu)選方法中， 如Staros，J.V., Biochem.21, 3950-3955，1982中所述，將磺基_N_羥基琥珀酰亞胺加 入EDC交聯(lián)劑中。除了化學(xué)交聯(lián)劑之外，還可以使用基于纖維蛋白的膠水或者醫(yī)藥級 的粘合劑如聚氨酯、乙酸乙烯酯或聚環(huán)氧基，將片層粘合在一起。在最優(yōu)選的方法中， 將EDC溶解在水中，濃度優(yōu)選在約O.lmM到約100mM之間，更優(yōu)選在約l.OmM到約 10mM之間，最優(yōu)選為約l.OmM。除了水，磷酸緩沖生理鹽水或者2_[N_嗎啉代]乙磺 酸(MES)緩沖液也可以被用于溶解EDC?？梢詫⑵渌噭绫虼继砑拥饺芤?中，在水中至多為99%，典型地為50%，使得交聯(lián)更為一致和有效。這些試劑從層中除 去水分，使基質(zhì)纖維聚集在一起，促進(jìn)這些纖維之間的交聯(lián)。在交聯(lián)劑中，這些試劑與 水的比例可用于調(diào)控交聯(lián)。由于隨著時(shí)間推移，EDC會(huì)失去活性，因此EDC交聯(lián)溶液是 在使用前被立即配制的。為了將交聯(lián)劑與ICL接觸，將被脫水的、粘合的ICL層轉(zhuǎn)移到 容器如淺的盤子中，將交聯(lián)劑輕輕倒到盤子中，確保ICL片層被覆蓋并且不漂浮，在ICL 構(gòu)建體的片層下或中間沒有氣泡。將容器覆蓋，在約4°C到約20°C的溫度下，ICL片層 被交聯(lián)約4到約24小時(shí)，更優(yōu)選8到約16小時(shí)。通過溫度調(diào)控交聯(lián)，在較低溫度下， 反應(yīng)緩慢，因而交聯(lián)更為有效；在較高溫度下，EDC更不穩(wěn)定，交聯(lián)效率較低。在交聯(lián)后，倒出交聯(lián)劑并除去，將構(gòu)建體與洗滌劑接觸，在盤子中進(jìn)行沖洗來 除去交聯(lián)劑。優(yōu)選的洗滌劑是水或者其他水溶液。優(yōu)選地，將化學(xué)粘合的構(gòu)建體用等體 積的無菌水沖洗三次，每次約5分鐘，進(jìn)行充分沖洗。如本文所述，將構(gòu)建體與抗微生物劑接觸，可以通過分別接觸或處理各個(gè)經(jīng)加工的組織基質(zhì)，或者通過接觸或處理多層 的中間構(gòu)建體，來賦予該構(gòu)建體以抗微生物性能。用抗微生物劑處理單層或者多層的加 工的組織基質(zhì)的方法將隨著所用的抗微生物劑類型而改變，但是應(yīng)當(dāng)能夠保持經(jīng)加工的 組織基質(zhì)的可生物重塑性、生物力學(xué)性能和生物相容性。當(dāng)選擇納米晶體銀作為抗微生物劑時(shí)，通過使膠原基質(zhì)材料與納米晶體銀接 觸，將納米晶體應(yīng)用于膠原基質(zhì)材料中，通過將試劑懸浮在溶液中通過涂覆它，通過涂 覆加工的基質(zhì)材料來應(yīng)用抗微生物劑。將納米晶體銀分散在水、水溶液或者一種溶劑中 而形成分散的納米晶體銀的溶液。將ICL浸沒在裝有一定體積納米晶體銀溶液的盤子 中，使得當(dāng)ICL浸沒在其中時(shí)，納米晶體銀粘附到ICL上。在浸沒過程中，攪動(dòng)或攪拌 該溶液。然后從溶液中取出ICL，并將其放置在允許水或溶劑從含有結(jié)合的銀的TCL中 蒸發(fā)而產(chǎn)生含有納米晶體銀涂層的ICL構(gòu)建體的環(huán)境下。用于給ICL涂覆含有納米晶體 銀的分散體的其他方法包括噴灑并允許溶劑從ICL中蒸發(fā)。當(dāng)選擇PHMB作為抗微生物劑時(shí)，將PHMB添加到溶液中，使用在水中的 0.09%-0.5% v/v,將經(jīng)加工的組織基質(zhì)浸沒在溶液中，使得PHMB溶液浸透該基質(zhì)。在 足以使得溶液浸透經(jīng)加工的組織基質(zhì)的時(shí)間之后，從溶液中取出基質(zhì)并進(jìn)行干燥，使得 當(dāng)溶劑蒸發(fā)時(shí)，PHMB仍保留在基質(zhì)上。在制作多層、粘合的移植物假體之前或之后，對經(jīng)加工的組織基質(zhì)和構(gòu)建體進(jìn) 行處理或修飾，包括物理的或者化學(xué)的處理或修飾。對經(jīng)清潔的組織基質(zhì)和構(gòu)建體進(jìn) 行物理修飾，例如定形、通過拉伸和松弛進(jìn)行修整、或打孔、網(wǎng)狀化或穿孔。在進(jìn)行打 孔、網(wǎng)狀化或穿孔時(shí)，調(diào)整降低材料的總體張力，以便更好地適合于創(chuàng)面床大小，或者 更適合分泌物的流通和排出，或者對上述兩者都有利。也可以進(jìn)行化學(xué)修飾，如結(jié)合生 長因子、選擇的細(xì)胞外基質(zhì)成分、遺傳材料以及其他試劑，這些將對被處理的、被修復(fù) 的或者被替換的機(jī)體部分的生物重塑和修復(fù)產(chǎn)生影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮了構(gòu)建體所需的性能特征后，確定物理修飾組織基質(zhì)和 本發(fā)明的構(gòu)建體的方法。使用在膜面上按圖案排列有針頭、刀片或者釘栓的模具，以一 定穿孔形式提供該構(gòu)建體，該穿孔與構(gòu)建體的反面相通。將構(gòu)建體放置在平臺上，下壓 模具使得針頭、刀片或釘栓壓入構(gòu)建體中，抵達(dá)平臺，從而穿過構(gòu)建體。在產(chǎn)生裂縫 或網(wǎng)格模式的方法中，使用與在自體皮膚移植操作中通常使用的那些類似的皮膚嚙合裝 置。一種裝置是齊默爾皮膚嚙合器。用受激準(zhǔn)分子激光器(例如在KrF或ArF的波長下) 對構(gòu)建體進(jìn)行激光鉆孔，產(chǎn)生穿透整個(gè)假體的微米級的孔，有助于細(xì)胞向內(nèi)生長?？梢?在制備假體過程中的任何時(shí)候?qū)?gòu)建體進(jìn)行打孔、穿孔或激光鉆孔，但是優(yōu)選在凈化之 前進(jìn)行，或者在最后消毒后進(jìn)行。對于某些指標(biāo)，優(yōu)選該穿孔或激光鉆孔穿過假體的所 有片層，有助于細(xì)胞通過或液體排出。對于某些指示，優(yōu)選這些孔不穿過所有片層，使 得細(xì)胞能夠接近多層構(gòu)建體的內(nèi)部，或者有助于構(gòu)建體形成新血管。對單層構(gòu)建體進(jìn)行的其他物理修飾是穿孔或打孔，它們連通構(gòu)建體的兩側(cè)。對 單層構(gòu)建體進(jìn)行的另一種物理修飾是將該構(gòu)建體網(wǎng)狀化，這給構(gòu)建體提供了排列的類似 于網(wǎng)孔的裂縫模式。以一種模式產(chǎn)生裂縫，其網(wǎng)孔比例類似于皮膚嚙合器產(chǎn)生的比例， 例如由齊默爾產(chǎn)生的比例。網(wǎng)孔比例設(shè)定在1 1.5或2 1。為了制備抗微生物性能 的單層ICL構(gòu)建體，將ICL的粘膜面鋪展到光滑的聚碳酸酯薄片上，確保除去皺褶、氣泡和可見的淋巴附屬物。將ICL鋪展在聚碳酸酯薄片上，使尺寸最優(yōu)化。任選地，使材料 的整個(gè)表面充分干燥。然后將至少一種抗微生物劑應(yīng)用到該材料上。任選地，通過網(wǎng)狀 化或者穿孔，對材料進(jìn)行物理修飾，然后將其切割成一定尺寸，包裝，最后按照無菌規(guī) 范進(jìn)行滅菌。在可替代的具體實(shí)施方案中，在對材料進(jìn)行網(wǎng)狀化、穿孔或打孔的物理修 飾后，對材料進(jìn)行抗微生物的處理。制備經(jīng)加工的組織基質(zhì)，并用抗微生物劑包被，再將構(gòu)建體修整為期望的尺 寸。作為例證，可用的尺寸為約6平方英寸(約15.2cmX15.2cm)，但是可以制備成任意 大小，用于移植給患者。然后將抗微生物的加工的膠原基質(zhì)包裝在容器中，該容器可被密封，用于最終 滅菌、儲藏和分發(fā)?？梢詫⒖刮⑸锏募庸さ哪z原基質(zhì)以干燥或濕潤的狀態(tài)包裝在容器 中。優(yōu)選的包裝材料與抗微生物的處理以及膠原基質(zhì)相容，如果以濕潤狀態(tài)包裝時(shí)，與 保持產(chǎn)品處于濕潤狀態(tài)的試劑相容。如果將構(gòu)建體用光敏的抗微生物劑處理，例如銀基 抗微生物劑，可以使用防止光線透過或者使光線濾過的包裝材料來包裝產(chǎn)品，以防止抗 微生物活性下降和構(gòu)建體變色。最后用醫(yī)學(xué)殺菌裝置領(lǐng)域知曉的手段對構(gòu)建體進(jìn)行滅菌。優(yōu)選的滅菌方法為 按照US5,460,962，將構(gòu)建體與用足量的10N氫氧化鈉(NaOH)中和的無菌0.1%過乙酸 (PA)接觸，該文獻(xiàn)的公開內(nèi)容在此將被引入。在放置在搖動(dòng)平臺上的容器中，例如在1L Nalge容器中進(jìn)行凈化約18士2小時(shí)。然后將構(gòu)建體與三倍體積的無菌水接觸三次來進(jìn)行 洗滌，每次10分鐘。在更優(yōu)選的方法中，使用25-37kGy的伽馬射線照射來對ICL構(gòu)建 體進(jìn)行滅菌。伽馬射線照射顯著地但不是有害地降低楊氏模量、極限抗張強(qiáng)度以及收縮 溫度。伽馬射線照射后的機(jī)械性能仍足以在應(yīng)用范圍內(nèi)使用，伽馬射線被廣泛用于可植 入醫(yī)療裝置領(lǐng)域，是一種優(yōu)選手段。每次滅菌包括放射量測定指示劑，來證明該劑量在 特定范圍內(nèi)。用包裝材料以及與構(gòu)建體的組分相適應(yīng)的設(shè)計(jì)來包裝構(gòu)建體，并且確保在 存儲過程中的無菌狀態(tài)。優(yōu)選的包裝手段是一種雙層的可剝離的包裝，其中基礎(chǔ)包裝是 熱封的硬質(zhì)泡沫塑料襯墊包裝，其由乙二醇改進(jìn)的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PETG)盤子 組成，具有一個(gè)紙面的箔蓋，該箔蓋被封裝在由聚乙烯/對苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄 片組成的二級熱封袋中。將基礎(chǔ)包裝和二級包裝以及其中含有的ICL構(gòu)建體一同用伽馬 射線滅菌。本發(fā)明的假體可以是扁平的、管狀的，或者具有復(fù)雜的幾何結(jié)構(gòu)。加工成形的 假體的形狀可由其特定用途所決定。因此，當(dāng)形成本發(fā)明假體的粘合片層時(shí)，可以對模 型或者板面支持部件進(jìn)行改進(jìn)以提供期望的形狀。植入扁平的多層假體，修復(fù)、補(bǔ)充或 者替代患病的或受損的器官，例如腹壁、心包膜、疝氣和各種其他器官和結(jié)構(gòu)，包括但 是不限于骨骼、骨膜、軟骨膜椎間盤、關(guān)節(jié)軟骨、真皮、腸道、韌帶和腱。此外，扁平 的多層假體可用作血管或心臟內(nèi)的補(bǔ)片，或者作為心瓣膜的替代品。單層或多層的扁平的薄片假體被用于覆蓋受試者的傷口，形成濕氣隔離物，使 傷口部位輕松舒適，并且在傷口部位穩(wěn)定地開始愈合時(shí)提供抗微生物的活性。扁平的薄片也可被用作為器官支持物，例如，使用薄片作為器官的吊索用于支 持下垂或者超級易動(dòng)的器官，如膀胱或子宮。可以使用管狀的假體，如用于替換管狀器 官的橫截面，如血管系統(tǒng)、食道、氣管、腸道和輸卵管。這些器官具有基本的管狀，包括外表面和內(nèi)腔表面。此外，扁平的薄片和管狀結(jié)構(gòu)還可以被成形在一起而形成復(fù)雜結(jié) 構(gòu)，以替換或者補(bǔ)充心臟或血管的瓣膜。用于制作本發(fā)明的抗微生物的構(gòu)建體的ICL材料是生物相容的。按照用于醫(yī)療 裝置的生物評價(jià)的Tripartite和ISO-10993指導(dǎo)，對用ICL制備成的假體進(jìn)行生物相容性 測試?！吧锵嗳菪浴笔侵讣袤w是無細(xì)胞毒性的、血液相容的、無熱原的、不含內(nèi)毒素 的、非遺傳毒性的、不產(chǎn)生抗原的，并且不會(huì)引發(fā)皮膚敏化反應(yīng)，不會(huì)引發(fā)原發(fā)性皮膚 炎癥反應(yīng)，不會(huì)引起急性全身性毒性，并且不會(huì)引發(fā)亞慢性毒性。將在下文中對這些生 物相容性質(zhì)作更為詳細(xì)的討論。當(dāng)使用名為“細(xì)胞毒性的體外L929瓊脂覆蓋測試(L929 AgarOverlay Test for Cytotoxicity In Vitro)"的測試，對在測試產(chǎn)品中暴露期間的L929細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果表 明用ICL制備的構(gòu)建體產(chǎn)品無生物活性(0級)或細(xì)胞毒性。陽性對照產(chǎn)品(3級)和陰 性對照產(chǎn)品(0級)的細(xì)胞反應(yīng)驗(yàn)證了該系統(tǒng)的有效性。按照USP指南進(jìn)行檢測和評價(jià)。 本發(fā)明的假體被認(rèn)為是無細(xì)胞毒性的，滿足細(xì)胞毒性的體外L929瓊脂覆蓋測試的要求。按照改進(jìn)的ASTM提取方法，對本發(fā)明的假體進(jìn)行血液相容性測試(體外溶血 反應(yīng)，使用改進(jìn)的ASTM提取方法進(jìn)行體外測試)。按期望實(shí)施陽性和陰性對照，在研 究條件下，裝置提取物的平均溶血指數(shù)是0%。研究結(jié)果表明本發(fā)明的假體不會(huì)引起溶 血，是血液相容性的。按照目前用于熱原性檢測的USP操作，在兔子中對本發(fā)明的假體進(jìn)行熱原性測 試。在研究條件下，兔子體溫在觀察期間的總升高是在可接受的USP界限內(nèi)。結(jié)果證明 本發(fā)明的假體是無熱原性的。本發(fā)明的假體不含內(nèi)毒素，優(yōu)選地，含量動(dòng).06EU/ml(每 cm2的產(chǎn)品)。內(nèi)毒素是特定的熱原，是革蘭性陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁的一部分，由細(xì)菌脫落 并污染材料。本發(fā)明的假體不引發(fā)皮膚敏化反應(yīng)。還沒有文獻(xiàn)報(bào)道，用于清潔豬腸道膠原的 化學(xué)藥品會(huì)引發(fā)敏化反應(yīng)，或者將改變膠原而引發(fā)這種反應(yīng)。對由化學(xué)清潔的ICL形成 的本發(fā)明的假體進(jìn)行敏化反應(yīng)測試，結(jié)果指示該假體不會(huì)引發(fā)敏化反應(yīng)。本發(fā)明的假體不會(huì)引發(fā)原發(fā)性皮膚刺激反應(yīng)。對化學(xué)清潔的ICL進(jìn)行刺激測 試，結(jié)果表明由化學(xué)清潔的ICL形成的本發(fā)明的假體不會(huì)引發(fā)皮膚刺激反應(yīng)。對用于制備本發(fā)明的假體的化學(xué)清潔的TCL進(jìn)行急性系統(tǒng)性毒性和皮內(nèi)毒性測 試，其結(jié)果證明在所檢測的假體中沒有毒性。此外，在動(dòng)物植入試驗(yàn)中，沒有化學(xué)清潔 的豬腸道膠原會(huì)引起急性系統(tǒng)性毒性的證據(jù)。對含有豬腸道膠原的本發(fā)明的假體進(jìn)行亞慢性毒性測試，證實(shí)沒有裝置的亞慢 性毒性。還沒有文獻(xiàn)報(bào)道，用于清潔豬腸道膠原的化學(xué)藥品將會(huì)影響引起遺傳毒性的可 能性，或者將改變膠原而引發(fā)這種反應(yīng)。對含有豬腸道膠原的本發(fā)明的假體進(jìn)行遺傳毒 性測試，證實(shí)沒有裝置的遺傳毒性。對用于制備本發(fā)明的假體的豬腸道膠原進(jìn)行化學(xué)清潔處理的目的在于通過除去 細(xì)胞、細(xì)胞殘留物以及非膠原的和非彈性的蛋白基質(zhì)成分，使抗原性最小化。通過采用 化學(xué)清潔的豬腸道膠原進(jìn)行植入試驗(yàn)證實(shí)，含有豬腸道膠原的本發(fā)明的假體沒有裝置的 抗原性。
本發(fā)明的ICL構(gòu)建體優(yōu)選是無病毒活性的。在加工過程中，對兩個(gè)化學(xué)清潔程 序NaOH/EDTA堿性螯合溶液(pH 11-12)和HCL/NaCl酸性鹽溶液(pH 0_1)滅活四種 相關(guān)病毒和模型病毒的效率進(jìn)行了測試?；谠簇i材料選擇模型病毒，并且用來代表廣 泛的物理化學(xué)特性(DNA病毒、RNA病毒、包膜病毒和非包膜病毒)。病毒包括狂犬病 病毒、牛病毒性腹瀉病毒、呼吸道腸道病毒_3和豬細(xì)小病毒。根據(jù)FDA和ICH指導(dǎo)性 文件進(jìn)行試驗(yàn)，包括CBER/FDA "Points to Consider in theCharacterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals (1993) ” ； ICH "Note for Guidance on Quality of Biotechnological Products Viral SafetyEvaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Humanor Animal Origin” (CPMP/1CH/295/95)； 以及 CPMP BiotechnologyWorking Party “Note for Guidance on Virus Validation Studies TheDesign, Contribution and Interpretation of Studies Validating thelnactivation and Removal of Viruses” (CPMP/ BWP/268/95)。試驗(yàn)結(jié)果證明，對于所有四種標(biāo)準(zhǔn)病毒來說，這兩個(gè)化學(xué)清潔步驟的累 計(jì)滅活動(dòng)病毒超過106。該數(shù)據(jù)表明化學(xué)清潔操作是強(qiáng)大而有效的過程，其保持滅活多種 病毒性物質(zhì)的潛能。本發(fā)明的假體是可生物重塑的?？勺鳛闄C(jī)體部分的替代品或支持物，本發(fā)明的 假體還可以作為宿主細(xì)胞向內(nèi)生長的可生物重塑的基質(zhì)骨架?！吧镏厮堋庇糜诖耸侵?通過宿主細(xì)胞以約等于生物降解的速度向內(nèi)生長而生成內(nèi)源性結(jié)構(gòu)膠原、血管形成和細(xì) 胞種群恢復(fù)，通過宿主細(xì)胞和酶使植入假體的基質(zhì)成分進(jìn)行重整和替換。移植物假體被 植入到受試者的所有或者基本上所有的宿主組織中，移植物假體保持其結(jié)構(gòu)特征，但是 被它們所植入的受試者重塑，并作為所修復(fù)或替換的組織的類似物。除了這些可生物重 塑的品質(zhì)外，由雙層或多層經(jīng)加工的組織基質(zhì)制成的本發(fā)明的假體還被制備成包含期望 的生物力學(xué)特性。楊氏模量(MPa)被定義為壓力和張力之間的線性比例常數(shù)。極限抗張強(qiáng)度(N/ mm)是跨越假體的強(qiáng)度的測量值。這兩個(gè)特性是假體中的TCL的層數(shù)的函數(shù)。當(dāng)用作 載重或支持裝置時(shí)，應(yīng)當(dāng)能夠滿足起始康復(fù)階段和整個(gè)重塑過程中的物理活動(dòng)的嚴(yán)格要 求。通過切削測試，測定粘合區(qū)域的層壓強(qiáng)度。在外科手術(shù)植入后，重要的是在 物理壓力下不會(huì)立即分層。在動(dòng)物試驗(yàn)中，移植材料都沒有顯示任何的分層證據(jù)。對 于ImMEDC交聯(lián)的多層構(gòu)建體來說，在植入前，兩個(gè)相對的層之間的粘著強(qiáng)度約為 8.1 士 2.1N/mm。收縮溫度(°C)是基質(zhì)交聯(lián)程度的指示。收縮溫度越高，材料中的基質(zhì)交聯(lián)程度 越高。未交聯(lián)的、經(jīng)伽馬射線照射的ICL的收縮溫度約為60.5士 1.0°C。在優(yōu)選的實(shí)施 方案中，對于分別在溶于50%丙酮中的ImMEDC 約100mM EDC中交聯(lián)的裝置來說， EDC交聯(lián)的假體優(yōu)選具有的收縮溫度在約64.0士0.2°C到約72.5士 1.1°C之間。機(jī)械性能包括機(jī)械完整性，使得假體在生物重塑過程中防止蠕變，而且是易曲 折的和可縫合的。術(shù)語“易曲折的”是指好的操作特性，以在臨床中應(yīng)用。術(shù)語“可縫合的”是指該層的機(jī)械性能，包括縫合保持力，使得當(dāng)將假體縫合 到天然組織的部分上時(shí)，針和縫合材料能夠穿過假體材料。在縫合過程中，這種假體必 需不會(huì)由于因縫合而對它們施加的張力而被撕裂，在縫合線打結(jié)時(shí)它們也不會(huì)撕裂。假體的可縫合性，即假體在縫合時(shí)不會(huì)發(fā)生撕裂，它與假體材料的內(nèi)在機(jī)械強(qiáng)度、移植物 的厚度、施加在縫合線上的張力、以及打死結(jié)的比例相關(guān)。在lOOmMEDC和50%丙酮 中高度交聯(lián)的扁平的六層假體的縫合保持力為約6.7士 1.6N。在溶于水中的ImMEDC中 交聯(lián)的雙層假體的縫合保持力為約3.7N士0.5N。由于外科醫(yī)生的縫合力為約1.8N，交聯(lián) 的扁平的雙層假體的優(yōu)選較低的縫合保持力為約2N。術(shù)語“非蠕變的”用于此是指假體的生物力學(xué)特性賦予了耐久力，使得該假體 在植入后不發(fā)生超過正常限度的伸長、擴(kuò)張、或者膨脹。如下文所述，植入的本發(fā)明的 假體的總伸長在可接受的限制內(nèi)。宿主細(xì)胞以大于生物降解引起的植入材料降低其機(jī)械 強(qiáng)度的速度替換結(jié)構(gòu)性膠原并重塑，本發(fā)明的假體需要能夠抵抗由植入后細(xì)胞生物重塑 所引起的伸長。盡管本發(fā)明的經(jīng)加工的組織材料被疊加并粘合，但是它們是“半透性的”。半 透性使得宿主細(xì)胞向內(nèi)生長，用于重塑或者沉積影響生物重塑性、細(xì)胞向內(nèi)生長、防止 或促進(jìn)附著或者血流的試劑和成分。假體的“無孔的”性質(zhì)通過植入假體，防止將要 保留的液體流過。相反，假體應(yīng)用時(shí)要求具有多孔或打孔性質(zhì)，則在假體中形成孔、穿 孔、打孔、裂縫或者網(wǎng)孔。本發(fā)明的假體的機(jī)械完整性使得其能夠被覆蓋或折疊，以及能夠被切割或修整 來獲得干凈的邊緣，而無需將構(gòu)建體的邊緣分層或破壞。源于小腸的被膜粘膜下層的經(jīng)加工的腸道膠原薄片通常具有從約0.05mm到約 0.07_的厚度。如果所純化的組織基質(zhì)具有片狀幾何結(jié)構(gòu)，則將其疊加后化學(xué)粘合在一 起，提供厚度較大的多層構(gòu)建體。本發(fā)明的多層粘合假體裝置的經(jīng)加工的組織基質(zhì)片層 源于相同的膠原材料，例如雙層或多層ICL，或者源于不同的膠原材料，例如單層或多層 ICL以及單層或多層闊筋膜。具有抗微生物性能的構(gòu)建體被用于處理傷口，包括部分和完全厚度傷口、壓 迫性潰瘍、靜脈潰瘍、糖尿病潰瘍、慢性血管潰瘍、隧道傷口 /地雷傷口、外科手術(shù)傷 口(例如自體移植造成的供體部位傷口、Moh氏手術(shù)后傷口、激光手術(shù)后傷口、傷口開 裂)、外傷傷口(例如擦傷、破口、二度燒傷、以及皮膚撕裂)以及流液型傷口。創(chuàng)傷敷 料是經(jīng)機(jī)械和化學(xué)清潔的豬腸道膠原的單層薄片或多層構(gòu)建體，包括至少一種抗微生物 劑，各個(gè)經(jīng)加工的組織基質(zhì)薄片的厚度為約0.05mm到約0.07mm，含有連通薄片兩側(cè)的 窗孔。該產(chǎn)品主要包含天然形式的I型豬膠原(約>95%)，少于約0.7%的脂質(zhì)，而且 檢測不到粘多糖(約<0.6%)和DNA(約<0.1ng/iU)。豬腸道膠原基本上不含有細(xì)胞 和細(xì)胞殘留物。本發(fā)明的創(chuàng)傷敷料可以是交聯(lián)的或者未交聯(lián)的，如果是交聯(lián)的，則交聯(lián) 達(dá)到調(diào)控和控制生物降解、生物重塑或者宿主細(xì)胞替換敷料的程度。對創(chuàng)傷敷料進(jìn)行物 理改變，使得液體能夠流過。創(chuàng)傷敷料提供濕潤的愈合環(huán)境，作為控制細(xì)菌污染并使之 最小化的屏障，并通過覆蓋感覺神經(jīng)末端來減輕患者的疼痛?？刮⑸飫┙o傷口部位及 其周邊提供抵抗微生物污染的有效保護(hù)。將創(chuàng)傷敷料應(yīng)用到具有需要處理的傷口的患者。在應(yīng)用前，采用標(biāo)準(zhǔn)的創(chuàng)傷敷 料技術(shù)對創(chuàng)面床進(jìn)行清潔并除去疤痕組織。優(yōu)選地，對傷口進(jìn)行清潔，使得傷口邊緣含 有活組織。在應(yīng)用本發(fā)明的敷料時(shí)，將其切割成創(chuàng)面床的外輪廓。如果傷口比單塊敷料 大，則使用多塊敷料，交迭地覆蓋住整個(gè)傷口。如果敷料處于干燥狀態(tài)，則使用無菌生
18理鹽水或者其他等滲溶液使其發(fā)生再水合。敷料邊緣與完整組織接觸，然后捋平以確保 敷料與下方的創(chuàng)面床接觸。如果薄片下方集聚了過量的滲出物，則在薄片上剪切出小的 開口，讓滲出物排出。本發(fā)明的抗微生物的創(chuàng)傷敷料用作傷口與傳統(tǒng)的創(chuàng)傷敷料之間的界面，或者作 為第二種創(chuàng)傷敷料?？商娲?，本發(fā)明的抗微生物的創(chuàng)傷敷料用作皮膚替代品，例如 自體移植物、同種異體移植物或經(jīng)培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的覆蓋物。當(dāng)用作覆蓋物時(shí)，創(chuàng)傷 敷料提供濕潤的傷口環(huán)境，使得源于皮膚替代品的細(xì)胞將在創(chuàng)面床增殖以更快地閉合傷在應(yīng)用后，優(yōu)選應(yīng)用適當(dāng)?shù)姆歉街牡诙罅?，以維持濕潤的傷口環(huán)境。根據(jù) 傷口位置、大小、深度和使用者的偏愛來確定最適宜的第二敷料。根據(jù)維持濕潤、清潔 的創(chuàng)面床的需要來更換第二敷料。敷料的更換頻率將根據(jù)所處理的傷口的類型、大小和 深度、產(chǎn)生的滲出物的體積以及所用敷料的類型而改變。在愈合發(fā)生時(shí)，在使用其他創(chuàng) 傷敷料的情形下，需要替換創(chuàng)傷敷料，直到實(shí)現(xiàn)完全愈合。本發(fā)明的其他實(shí)施方案涉及具有抗微生物性能的多層構(gòu)建體。本發(fā)明的假體裝 置具有雙層或多層粘合在一起的膠原層。“粘合膠原層”用于此是指由雙層或多層相同 或不同膠原材料組成，這些片層經(jīng)過一定方式處理，使得片層相互疊加在一起并且通過 自層壓和化學(xué)交聯(lián)充分地結(jié)合在一起。更特別地，假體裝置是外科手術(shù)網(wǎng)膜或者移植物，其被植入來加固軟組織，包 括但是不限于腹壁和胸壁缺陷、肌肉翻轉(zhuǎn)加固、直腸和陰道下垂、骨盆底重構(gòu)、疝 氣、橋連筋膜缺損中的裂口、縫合線加固和重構(gòu)操作。本發(fā)明的網(wǎng)膜或移植物包括五層 豬ICL薄片以及抗微生物劑，厚度為約0.20mm到約0.25mm。該產(chǎn)品主要由天然形式的 I型豬膠原(約> 95% )組成，脂質(zhì)少于約0.7%，而且檢測不到粘多糖(約< 0.6% )和 DNA(約<0.1ng/iU)。豬腸道膠原基本上不含有細(xì)胞和細(xì)胞殘留物。該假體以無菌的 片狀形式被提供，大小在5X5cm到12X36cm的范圍內(nèi)，以雙層的可剝離的形式包裝。 假體的變性溫度為約58士5°C;抗張強(qiáng)度超過15N;使用2-0編絲縫線時(shí)的縫合保持強(qiáng)度 超過2N;而最終的內(nèi)毒素含量<0.06EU/ml(每cm2的產(chǎn)品)。特別地，扁平的薄片構(gòu)建 體假體由五層ICL以及抗微生物劑組成，用ImM 1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳化二 亞胺鹽酸鹽(EDC)粘合和交聯(lián)。為了制備該構(gòu)建體，將第一個(gè)ICL薄片的粘膜面朝下， 鋪展在光滑的聚碳酸酯薄片上；確保去除皺褶、氣泡和可見的淋巴附屬物。鋪展ICL使 得尺寸最優(yōu)化。將三片ICL (粘膜面朝下)層疊到第一個(gè)ICL薄片上，當(dāng)層疊每個(gè)層時(shí)， 確保除去皺褶、氣泡和可見的淋巴附屬物。第五個(gè)薄片應(yīng)當(dāng)粘膜面朝上，確保除去皺褶 和氣泡。在層疊第五個(gè)薄片之前除去可見的淋巴附屬物。將層一起干燥24士8小時(shí)。將 層一起干燥，然后在水中的ImM EDC中，在每個(gè)30cm的五層薄片500mL交聯(lián)溶液中交 聯(lián)18士2小時(shí)。將各個(gè)產(chǎn)品用無菌水沖洗，然后在還處于水合狀態(tài)時(shí)切割成最終的尺寸 規(guī)格。在可替代的實(shí)施方案中，假體裝置是外科手術(shù)吊索，含有至少一種抗微生物 劑，用于植入以加固和支持存在缺陷的軟組織，包括但是不限于如下操作微創(chuàng)型尿道 懸吊系統(tǒng)、下垂修復(fù)(尿道、陰道、直腸和結(jié)腸)、骨盆底重構(gòu)、膀胱支持、骶骨陰道懸 吊、重構(gòu)操作和組織修復(fù)。在另一個(gè)最優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，假體裝置是外科手術(shù)吊索，由3 5層粘合、交聯(lián)在一起的使用至少一種抗微生物劑處理的ICL組成。為了制 作五層裝置，將ICL的粘膜面朝下鋪展到光滑的聚碳酸酯薄片上；確保除去皺褶、氣泡 和可見的淋巴附屬物。鋪展ICL，使得尺寸最優(yōu)化。將第二、第三和第四層ICL(粘膜面 朝下)疊加到第一層上，當(dāng)疊加每個(gè)片層時(shí)確保除去皺褶、氣泡和可見的淋巴附屬物。 將第五層薄片的粘膜面朝上，確保除去皺褶和氣泡。在疊加該第五層薄片時(shí)應(yīng)當(dāng)除去可 見的淋巴附屬物(將第一個(gè)ICL薄片粘膜面朝下鋪展到光滑的聚碳酸酯薄片上；確保除 去皺褶、氣泡和可見的淋巴附屬物；將第二個(gè)ICL薄片(粘膜面朝下)層疊到第一個(gè)薄 片上，并將第三個(gè)薄片的粘膜面朝上層疊到第二個(gè)薄片上，來制備三層的構(gòu)建體)。將 片層干燥24士8小時(shí)，一旦干燥，在溶于水中的ImMEDC中，在每個(gè)30cm的五層薄片 500mL的交聯(lián)溶液中交聯(lián)18士2小時(shí)。將每個(gè)粘合的交聯(lián)的構(gòu)建體用無菌水沖洗，然后 在還處于水合狀態(tài)時(shí)切割成最終的尺寸規(guī)格。為了給微創(chuàng)型尿道提供支持，用吊索處理 由于尿道超級易動(dòng)或內(nèi)在的括約肌缺陷導(dǎo)致的小便失禁。外科手術(shù)吊索由五層層壓的豬 腸道膠原薄片和一種抗微生物劑組成，厚度為約0.20mm到約0.25mm。將該裝置用1_乙 基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)交聯(lián)。該裝置主要由天然形式的 I型豬膠原(約> 95% )組成，脂質(zhì)少于約0.7%，而且檢測不到粘多糖(約< 0.6% )和 DNA(約<0.1ng/iU)。豬腸道膠原基本上不含有細(xì)胞和細(xì)胞殘留物。假體的變性溫 度(DSC)超過約63°C ；抗張強(qiáng)度超過約15N ；使用2-0編絲縫線時(shí)的縫合保留強(qiáng)度超 過2N;而最終的內(nèi)毒素含量<0.06EU/ml(每cm2的產(chǎn)品)。吊索的生物重塑方面可以 被改變和調(diào)整，本發(fā)明的吊索假體不是機(jī)體部分的替代品，而是被植入作為輔助結(jié)構(gòu)的 器官支持裝置。優(yōu)選地，吊索的ICL片層具有更高的交聯(lián)程度，以降低吊索的可生物重 塑性。吊索假體是一種高度生物相容的、彈性的膠原結(jié)構(gòu)，當(dāng)作為器官支持裝置被植入 時(shí)，能夠維持所需的結(jié)構(gòu)性支持。 在還有另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，假體裝置是硬腦膜修復(fù)補(bǔ)片，被植入來修復(fù) 硬腦膜，硬腦膜是保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的韌性部分。本發(fā)明的硬腦膜修復(fù)裝置由四層片層 粘合并交聯(lián)在一起的TCL以及一種抗微生物劑構(gòu)成。為了制作該四層的裝置，將TCL的 粘膜面朝下鋪展到光滑的聚碳酸酯薄片上；確保除去皺褶、氣泡和可見的淋巴附屬物。 鋪展ICL，使得尺寸最優(yōu)化。將第二個(gè)和第三個(gè)ICL薄片(粘膜面朝下)層疊到第一層 的上面，當(dāng)層疊每個(gè)層時(shí)，確保除去皺褶、氣泡和可見的淋巴附屬物。將第四個(gè)薄片的 粘膜面朝上鋪展，確保除去皺褶和氣泡。在疊加第四個(gè)薄片之前，應(yīng)當(dāng)除去可見的淋巴 附屬物。將片層干燥24士8小時(shí)，一旦干燥，在溶于2-[N嗎啉代]乙磺酸(MES)緩沖 液中的約O.lmM 約ImM EDC中，在每個(gè)30cm的四層薄片500mL的交聯(lián)溶液中交聯(lián) 18士2小時(shí)。將各個(gè)粘合和交聯(lián)的構(gòu)建體用無菌水沖洗，然后當(dāng)還處于水合狀態(tài)時(shí)切割成 最終的尺寸規(guī)格。硬腦膜修復(fù)裝置由四層層壓的豬腸道膠原薄片組成，厚度為約0.14mm 到約0.21mm。將該裝置用1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)交 聯(lián)。該裝置主要由天然形式的I型豬膠原(約>95%)組成，脂質(zhì)少于約0.7%，而且檢 測不到粘多糖(約< 0.6% )和DNA(約< O.lng/ u 1)。豬腸道膠原基本上不含有細(xì)胞和 細(xì)胞殘留物。假體的變性溫度(DSC)超過約63°C ；抗張強(qiáng)度超過約15N ；使用2-0編 絲縫線時(shí)的縫合保持強(qiáng)度超過2N ；而最終的內(nèi)毒素含量< 0.06EU/ml (每cm2的產(chǎn)品)。 硬腦膜修復(fù)裝置是生物相容的和可生物重塑的，當(dāng)植入到需要進(jìn)行硬腦膜修復(fù)的患者中時(shí)，作為硬腦膜的替代品，隨著時(shí)間推移，它將被宿主細(xì)胞生物重塑，宿主細(xì)胞降解并 替代該裝置，使得新的宿主組織替代該裝置。例如，使用多層的ICL構(gòu)建體來修復(fù)體壁結(jié)構(gòu)。例如，該構(gòu)建體可以被用作為 心包補(bǔ)片、膀胱壁補(bǔ)片、疝氣修復(fù)裝置(作為釋放壓力的補(bǔ)片或塞子)，或者用作吊索來 支持超級易動(dòng)的或下垂的器官(脫肛，拱頂下垂、膀胱突出癥)。多層構(gòu)建體可用于處 理結(jié)締組織，例如軸轉(zhuǎn)肌(rotator cuff)或被膜修復(fù)中使用。多層構(gòu)建體可用于硬腦膜修 復(fù)，修復(fù)顱骨切開術(shù)后的頭蓋缺陷或者用于修復(fù)沿著脊髓的神經(jīng)管。當(dāng)纖維環(huán)板層結(jié)構(gòu) 破裂(即，椎間盤突出)時(shí)，該材料可用于修復(fù)纖維環(huán)板層，或者作為堵塞由椎間盤突出 造成的孔洞的塞子或者作為該孔洞的蓋子，或者同時(shí)作為塞子和蓋子。材料可用于整形 手術(shù)，例如乳房固定術(shù)，腹腔手術(shù)，以及面部整形手術(shù)(增高額頭和臉頰)。單層和多 層ICL材料可用作傷口覆蓋物或者敷料，輔助傷口修復(fù)。此外，該材料以扁平、卷曲或 者折疊的方式被植入，用于組織填充和互補(bǔ)。在構(gòu)建體中包括大量ICL片層，用于填充 或者強(qiáng)度指示。在植入前，進(jìn)一步對片層進(jìn)行處理，或者包裹上膠原或其他細(xì)胞外基質(zhì) 成分、透明質(zhì)酸、肝素、生長因子、肽或經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞。提供如下實(shí)施例來更好地闡述本發(fā)明的實(shí)施，無論如何不應(yīng)將它們解釋為用來 限制本發(fā)明的保護(hù)范圍?？梢灶A(yù)期，在組成、形狀和厚度方面對裝置進(jìn)行的設(shè)計(jì)可以根 據(jù)構(gòu)建體的最終指標(biāo)來選擇。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，在不背離本發(fā)明的精神和保護(hù) 范圍的情形下，可以對在此描述的方法進(jìn)行各種改進(jìn)。實(shí)施例實(shí)施例1 對機(jī)械清潔的豬小腸講行化學(xué)清潔收集豬小腸，并使用Bitteriing刮腸器(Nottingham，UK)進(jìn)行機(jī)械剝離，該設(shè)備
通過將機(jī)械作用與用水洗滌組合，從粘膜下層上強(qiáng)力除去脂肪、肌肉和粘膜片層。機(jī)械 作用被描述為當(dāng)完整的腸子通過一系列的輥?zhàn)訒r(shí)，該輥?zhàn)訑D壓并從粘膜下層上剝下相繼 的層。小腸的粘膜下層比周圍組織硬，輥?zhàn)訉⑤^軟的成分從粘膜下層上擠壓掉。機(jī)械清 潔的結(jié)果使得僅保留腸子的粘膜下層。在無菌的室溫條件下實(shí)施剩下的操作，按照Abraham等人的PCT申請?zhí)朩O 98/49969中描述的化學(xué)清潔，該文獻(xiàn)的公開內(nèi)容在此被引入作為參考。所有化學(xué)溶液都 在室溫下使用。沿著腸道內(nèi)腔的縱向方向切開腸子，然后切成15cm切片。對材料進(jìn)行 稱重，并以溶液與腸道材料約100 lv/v的比例將其放置到容器中。往各個(gè)含有腸子的容器中加入約1L用0.22 y m(微米)濾器滅菌的100mM乙二 胺四乙酸鈉(EDTA)/10mM氫氧化鈉(NaOH)溶液。然后，將容器放在搖臺上，在約 200rpm下放置約18小時(shí)。搖晃后，從各容器中除去EDTA/NaOH溶液。然后，往各個(gè)容器中加入約1L用0.22iim(微米)濾器滅菌的1M鹽酸(HC1)/1M 氯化鈉(NaCl)溶液。然后，將容器放在搖臺上，在約200rpm下放置約6 8小時(shí)。搖 晃后，從各容器中除去HCl/NaCl溶液。然后，往各個(gè)容器中加入約1L用0.22iim濾器滅菌的1M氯化鈉(NaCl)/10mM 磷酸緩沖生理鹽水(PBS)。然后，將容器放在搖臺上，在約200rpm下放置約18小時(shí)。 搖晃后，從各容器中除去NaCl/PBS溶液。然后，往各個(gè)容器中加入約1L用0.22iim濾器滅菌的lOmMPBS。然后，將容器放在搖臺上，在約200rpm下放置約2小時(shí)。搖晃后，從各容器中除去磷酸緩沖的生理 鹽水。最后，往各個(gè)容器中加入約1L用0.22 ym濾器滅菌的水。然后，將容器放在搖 臺上，在約200rpm下放置約1小時(shí)。搖晃后，從各容器中除去水。將經(jīng)加工的ICL樣本切割和固定，用于組織學(xué)分析。對對照和經(jīng)處理的組織的 橫截面和縱切面樣本進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(H&E)以及Masson三色染色。經(jīng)加工的ICL 組織樣本顯示不含有細(xì)胞和細(xì)胞碎片，而未經(jīng)加工的對照樣本正常地并且如期望地存在 很多細(xì)胞。單層ICL材料可作為單層使用或者用于制備粘合的多層構(gòu)建體、管狀的構(gòu)建體 或者具有管狀的和扁平的幾何學(xué)特征的復(fù)雜構(gòu)建體。實(shí)施例2 制作多層ICL構(gòu)津體的方法將按照實(shí)施例1的方法處理的ICL用于制備具有雙層ICL的多層構(gòu)建體。將 無菌的多孔聚碳酸酯薄片(孔徑大小，生產(chǎn)商)放置在層流室的無菌場中。用無菌 TEXWIPES (LYM-TECH Scientific，Chicopee，MA)擦拭 ICL，從該材料上吸掉多余
水分。從ICL材料的內(nèi)腔反面除去淋巴附屬物，然后剪切成長約6英寸的切片(約 15.2cm)。將第一個(gè)經(jīng)修理的ICL薄片放置在聚碳酸酯薄片上，粘膜面朝下，手工除去任 何氣泡、折疊和皺褶。將第二個(gè)經(jīng)修理的ICL薄片放置在上面，朝向第一個(gè)薄片的內(nèi)腔 反面，使第二個(gè)薄片的內(nèi)腔反面接觸第一個(gè)薄片的內(nèi)腔反面，再手工除去氣泡、折疊和 皺褶。將具有ICL片層的聚碳酸酯薄片以一定角度豎起，使得ICL層面對從層流室吹來 的氣流。在約20°C的室溫下，將層在腔室中干燥約18士2小時(shí)。將干燥的ICL層一同 從聚碳酸酯薄片上剝離下來，而不使它們分開或分層，轉(zhuǎn)移到在室溫下的水浴中，使層 水合約15分鐘。由于EDC隨著時(shí)間推移會(huì)失去活性，在交聯(lián)之前立即制備100mMEDC/50%丙 酮的化學(xué)交聯(lián)溶液。將經(jīng)水合的層轉(zhuǎn)移到淺盤中，輕輕地將交聯(lián)劑倒入盤中，確保層被 覆蓋并且不漂浮，使得在構(gòu)建體下方或中間沒有氣泡。將盤子蓋上，并在通風(fēng)櫥中放置 約18士2小時(shí)。倒出交聯(lián)溶液并棄去。在盤中用無菌水沖洗構(gòu)建體三次，每次沖洗約5 分鐘。用解剖刀和尺子，將構(gòu)建體修理成期望的尺寸。按照US5,460,962，將構(gòu)建體用經(jīng)氫氧化鈉ION NaOH中和的無菌0.1 %過乙酸 (PA)處理而凈化，該文獻(xiàn)的公開內(nèi)容在此被引入。將構(gòu)建體放置在lLNalge容器中，在 搖臺上凈化約18士2小時(shí)。將構(gòu)建體用三倍體積的無菌水洗滌10分鐘，用Minncare條 帶試驗(yàn)監(jiān)控PA活性，確保從構(gòu)建體中除去它。然后，用真空封口機(jī)將構(gòu)建體包裝在塑料袋中，接著放在密封袋中，進(jìn)行 25.0 35.0kGy伽馬射線照射。實(shí)施例3:抑菌試驗(yàn)本實(shí)施例的目的在于闡述如何檢測加入到單層構(gòu)建體中的抗微生物物質(zhì)的有效 量，該有效量提供微生物屏障以及微生物殺滅劑。單層構(gòu)建體是從由按照實(shí)施例1中公 開的方法制備的源于豬腸道粘膜下層(ICL)的經(jīng)加工的組織材料制備得到的。數(shù)種抗微 生物物質(zhì)被應(yīng)用于ICL，將它們?nèi)芙饣驊腋≡谌缦氯芤褐?.0.5%硝酸銀溶液
2.1%硝酸銀溶液3.溶于異丙醇(IPA)中的1-2%納米晶體銀溶液4.溶于1XPBS中的1-2%納米晶體銀溶液5.溶于磷酸緩沖生理鹽水溶液中的1-2%聚六亞甲基雙胍(PHMB)6.溶于純凈水中的1-2%聚六亞甲基雙胍(PHMB)將化學(xué)清潔的ICL切割成4cmX 6cm的切片，將水合的或脫水的各個(gè)切片放置到 約100mL的各種溶液中過夜。從各溶液中取出經(jīng)加工的ICL并干燥。將未經(jīng)加工的ICL 樣本用作對照。從各個(gè)樣本切片中剪切出圓形切片。用細(xì)菌在瓊脂平板上劃線。將樣 本放置在平板上，并培育24小時(shí)來觀察。在IPA中制備的納米晶體銀(N.S.)溶液完全分散并停留在溶液中，但是在 1XPBS中的N.S.不停留在溶液中并且在將該溶液添加到ICL之前需要搖晃。將TPA蒸 發(fā)過夜，并且TPA十分均勻地分布在水合和脫水的ICL薄片上，脫水的薄片保持較為固 定的形狀，并且更容易處置。兩種薄片都變?yōu)樘己谏CL朝向盤子的側(cè)面似乎不影 響ICL的包被，或者也不影響該材料產(chǎn)生大抑菌圈(ZOI)的效率。N.S.產(chǎn)品產(chǎn)生最佳的 ZOI，并在4天后也產(chǎn)生不允許細(xì)菌生長到24小時(shí)ZOI中的ZOI，如同一些其他樣本那 樣。盡管硝酸銀樣本的ZOI比N.S.小，但是比其他的大，已經(jīng)報(bào)道的硝酸銀的毒性并不 必然地使得其是ICL的理想添加劑。硝酸銀的已知抗微生物性能使得可以將N.S.與硝酸 銀相比，N.S.的效率超過硝酸銀。兩種PHMB溶液似乎是相當(dāng)?shù)?，但是在浸泡后ICL并不相同。PBS溶液在ICL上 留下不均勻的鹽殘留，而WFI溶液沒有使ICL具有明顯改變。兩者都產(chǎn)生類似的ZOL。 它們都較小，并且并不以與N.S.ZOI相同的方式產(chǎn)生ZOI。納米晶體銀和PHMB被發(fā)現(xiàn)是有效的抗微生物劑，可應(yīng)用于ICL構(gòu)建體，它們 在該試驗(yàn)中的殺菌作用證明了這一點(diǎn)。實(shí)施例4 =對含有抗微生物的納米晶體銀或PHMB的膠原構(gòu)建體進(jìn)行的處理制備疊加的雙層ICL構(gòu)建體(疊加并交聯(lián))，然后用一種抗微生物劑處理，來生 產(chǎn)具有抗微生物性能的雙層構(gòu)建體。按照實(shí)施例2制備12種雙層的ICL構(gòu)建體，每種大小為約9cmX9cm。在制 備中，將這些ICL構(gòu)建體用10mMEDC/0.1MMES[2-(N-嗎啉代)乙磺酸](Pierce， Rockford, IL)緩沖液交聯(lián)16 20小時(shí)，然后在無菌過濾水中沖洗3次，每次30分鐘。 然后，用一種抗微生物劑處理所制備的構(gòu)建體。將抗微生物劑制備成溶液或分散體。將10g、l.Og、O.lg、O.Olg。O.OOlg納米 晶體銀(納米技術(shù)(Ag-20)或等價(jià)物，Austin，TX)與1L懸浮劑異丙醇(無菌過濾水 也是可接受的懸浮劑)混合，制備五種納米晶體銀分散體。將Cosmocil CQ (20% PHMB 溶液，ArchChemicals，Inc., Norwalk, CT)與 RODI/WFI 混合，來制備 0.2%、0.1%、 0.02%, 0.002% PHMB 溶液。為了用抗微生物劑包被層壓和交聯(lián)的構(gòu)建體，將經(jīng)水合處理的構(gòu)建體放置在 9.5cmX9.5cm盤子中。將50mL各種試劑輕輕倒入盤中，將盤子放置在搖臺上。包被時(shí) 間為10秒、1小時(shí)、3小時(shí)和過夜(約18小時(shí))。在設(shè)定的時(shí)間結(jié)束時(shí)，允許樣本在聚 碳酸酯薄片上，在生物安全層流室的無菌氣流中干燥，干燥達(dá)到10 20%相對濕度。
生成的構(gòu)建體是層壓的、交聯(lián)的雙層TCL構(gòu)建體，并用一種抗微生物劑處理 過，使該構(gòu)建體具有抗微生物的性質(zhì)。棚列5:龍腿制本慰，ffl〒吿丨丨 作雙層的抗微牛物構(gòu)津體制備單層的ICL構(gòu)建體，交聯(lián)，并用一種抗微生物劑處理，然后層壓形成雙層 構(gòu)建體，來制備具有抗微生物性質(zhì)的雙層加工的組織基質(zhì)構(gòu)建體。在用抗微生物劑處理 之后，將構(gòu)建體層壓，從而將抗微生物劑摻入到經(jīng)加工的組織基質(zhì)的片層之間。按照實(shí)施例1制備ICL，將其鋪展在聚碳酸酯薄片上，并除去淋巴附屬物。將 薄片剪切成大小為約10cmX9cm。將各個(gè)ICL切片放在10mM EDC/0.1M MES[2_ (N-嗎 啉代)乙磺酸](Pierce，Rockford, IL)緩沖液中交聯(lián)，每26個(gè)薄片使用2升溶液，并在 設(shè)定值為4的搖臺上攪拌16-20小時(shí)，然后在至少2L無菌過濾水中洗滌三次，每次30分 鐘。將抗微生物劑配制成溶液或分散體。通過將l.Og、O.lg、O.Olg納米晶體銀 (Nanotechnologies(Ag-20)或等價(jià)物，Austin，TX)混合在1L分散劑，例如異丙醇(無菌 過濾水也是可接受的分散劑)中而制備了三種納米晶體銀分散體。將COSmOcilCQ(20% PHMB 溶液，ArchChemicals，Inc.Norwalk, CT)與 RODI/WFI 混合，制備了 0.2%、 0.1%, 0.02% PHMB 溶液。用抗微生物劑包被ICL，將薄片放置在125ml無菌的方形容器中(Nalgene)，每 個(gè)容器含有四個(gè)薄片。往各個(gè)容器中倒入lOOmL含有抗微生物劑的溶液或分散體，浸沒 該構(gòu)建體。在旋轉(zhuǎn)式搖動(dòng)器平臺上攪拌容器，使ICL保持浸沒3-6小時(shí)。將經(jīng)抗微生物處理的ICL疊加來制備構(gòu)建體。將經(jīng)加工的ICL薄片平鋪到聚碳 酸酯薄片上，然后將第二個(gè)經(jīng)加工的ICL薄片直接放置在上方，覆蓋在第一層上，在層 之間沒有氣泡。然后將包括構(gòu)建體的聚碳酸酯薄片放在生物安全層流室的無菌氣流中， 至少干燥12小時(shí)，達(dá)到10-20%的相對濕度。制備得到的構(gòu)建體是雙層的ICL構(gòu)建體，該構(gòu)建體已經(jīng)被交聯(lián)，并且被一種抗 微生物劑處理以具備抗微生物性能，經(jīng)過層壓使得不僅在構(gòu)建體的表面而且在構(gòu)建體的 片層之間都摻有抗微生物劑。實(shí)施例6 對含有抗微生物的納米晶體銀的雙層膠原構(gòu)建體進(jìn)行處理制備(層壓并且交聯(lián)的)層壓的雙層ICL構(gòu)建體，然后用一種抗微生物劑處理， 以生產(chǎn)具有抗微生物性能的雙層構(gòu)建體。按照實(shí)施例2，制備12種雙層ICL構(gòu)建體，每種大小為約35-40cmX9cm。在 制備過程中，將ICL構(gòu)建體用10mM EDC/0.1M MES[2_(N_嗎啉代)乙磺酸](Pierce, Rockford, IL)緩沖液交聯(lián)16-20小時(shí)，然后在無菌過濾水中沖洗30分鐘。然后，將所 制備的構(gòu)建體用一種抗微生物劑處理。將抗微生物劑制備成分散體。將10.0g、5.0g、l.Og納米晶體銀 (Nanotechnologies(Ag-20)或等價(jià)物，Austin，TX)與1L異丙醇混合來制備三種納米晶
體銀分散體，異丙醇作為納米晶體銀的分散劑(無菌過濾水也是可接受的分散劑)。為了用一種抗微生物劑包被構(gòu)建體，將薄片放置在1L無菌的方形容器 (Nalgene)中，每個(gè)容器含有四個(gè)薄片。往各個(gè)容器中倒入200mL含有抗微生物劑的溶液或分散體，浸沒該構(gòu)建體。將容器在旋轉(zhuǎn)式搖動(dòng)器平臺上攪拌，使ICL保持浸沒3-6小 時(shí)。將已經(jīng)與納米晶體銀分散體接觸的構(gòu)建體在1L無菌過濾水中洗滌一次。將經(jīng)抗微 生物處理的構(gòu)建體平鋪在聚碳酸酯薄片上，在生物安全層流室的無菌氣流中至少干燥12 小時(shí)，達(dá)到10-20%的相對濕度。制備得到的構(gòu)建體是雙層的ICL構(gòu)建體，該構(gòu)建體已經(jīng)被層壓和交聯(lián)，并用一 種抗微生物劑處理過而賦予其抗微生物性能。棚列7: X寸■腿射勿傭狐■測 于制作雙層的抗微牛物構(gòu)津體制備交聯(lián)的單層ICL構(gòu)建體，交聯(lián)并用一種抗微生物劑處理，然后層壓而形成 一種雙層構(gòu)建體，來制備具有抗微生物性能的雙層構(gòu)建體。在用抗微生物劑處理后，對 構(gòu)建體進(jìn)行層壓處理，通過包被外表面，有可能將更多的抗微生物劑摻入到構(gòu)建體中， 并且抗微生物劑存在于構(gòu)建體的片層之間。按照實(shí)施例1制備ICL。然后將ICL覆蓋在聚碳酸酯薄片上，35_40cm長X9cm 寬，除去淋巴附屬物。將各個(gè)薄片用10mMEDC/0.1MMES[2-(N_嗎啉代)乙磺酸] (Pierce, Rockford, IL)緩沖液交聯(lián)，每30個(gè)薄片使用3升溶液，并在設(shè)定值為4的搖臺 上攪拌16-20小時(shí)，然后在3-5L無菌過濾水中沖洗三次，每次30分鐘。將抗微生物劑制備成分散體。將lO.Og、5.0g、l.Og納米晶體銀 (Nanotechnologies(Ag-20)或等價(jià)物，Austin，TX)與1L分散劑，如異丙醇混合，還將 5.0g納米晶體銀溶于1L RODI中，來制備四種納米晶體銀分散體。為了用一種抗微生物劑包被ICL，將ICL薄片放置在250mL無菌容器(Nalgene) 中，每個(gè)容器含有四個(gè)薄片。往各個(gè)容器中倒入200mL含有抗微生物劑的溶液或分散 體，浸沒該構(gòu)建體。將容器在旋轉(zhuǎn)式搖動(dòng)器平臺上攪拌，使ICL保持浸沒3-6小時(shí)。將 已經(jīng)與納米晶體銀分散體接觸的ICL在1L無菌過濾水中洗滌一次。將經(jīng)過抗微生物處理的ICL層疊來制備雙層構(gòu)建體。將經(jīng)加工的ICL薄片平鋪到 聚碳酸酯薄片上，然后將第二個(gè)經(jīng)加工的ICL薄片直接放置在上方，覆蓋在第一層上， 在片層之間沒有氣泡。然后將包括構(gòu)建體的聚碳酸酯薄片放在生物安全層流室的無菌氣 流中，至少干燥12小時(shí)，達(dá)到10-20%的相對濕度。所得到的構(gòu)建體是雙層的ICL構(gòu)建體，該構(gòu)建體已經(jīng)被交聯(lián)，并用一種抗微生 物劑處理以賦予其抗微生物性能，然后經(jīng)過層壓使得在構(gòu)建體的片層之間摻入更多抗微 生物劑。實(shí)施例8 交聯(lián)和預(yù)層壓后包被制備交聯(lián)的單層ICL構(gòu)建體，并且交聯(lián)，然后用一種抗微生物劑處理，然后層 壓而形成一種雙層構(gòu)建體，從而制備具有抗微生物性能的雙層構(gòu)建體。在用抗微生物劑 處理后，對構(gòu)建體進(jìn)行層壓處理，在ICL片層之間摻入了更多的抗微生物劑。將ICL薄片覆蓋在聚碳酸酯薄片上，除去淋巴附屬物，該薄片為約35-40cm 長X9cm寬。將各個(gè)薄片用10mM EDC/0.1M MES[2_(N_嗎啉代)乙磺酸](Pierce， Rockford, IL)緩沖液交聯(lián)，每30個(gè)薄片使用3升溶液，并在設(shè)定值為4的搖臺上攪拌 16-20小時(shí)，然后在3-5L無菌過濾水中沖洗三次，每次30分鐘。將抗微生物劑配制成溶液或分散體。將5.0克納米晶體銀
25(Nanotechnologies(Ag_20)或等價(jià)物，Austin，TX)混合在1L分散劑RODI中，來制備 納米晶體銀分散體。將5.0mL Cosmocil CQ (20% PHMB溶液)與1000mL RODI/WFI混 合，制備0.1% PHMB溶液。為了用PHMB試劑包被ICL，將28-30個(gè)ICL薄片放在潔凈的5LPyrex玻璃瓶
中。加入3000mL0.1%PHMB溶液。將容器在旋轉(zhuǎn)式搖動(dòng)器平臺上攪拌，使ICL保持 浸沒3-6小時(shí)。為了用納米晶體銀分散體包被ICL，將200mL分散體加入到250mL無菌容器 (Nalgene)中。將四個(gè)ICL薄片放入各個(gè)容器中并攪拌3-6小時(shí)。與納米晶體銀分散體 接觸的ICL在250mL RODI洗滌15分鐘一次，并在500mL RODI洗滌一次至少5分鐘， 直到進(jìn)行層壓處理。對與PHMB溶液接觸的ICL不進(jìn)行洗滌。將經(jīng)抗微生物處理的ICL疊加來制備雙層構(gòu)建體。將經(jīng)加工的ICL薄片平鋪到 聚碳酸酯薄片上，然后將第二個(gè)加工的ICL薄片直接放置在上方，覆蓋在第一層上，在 片層之間沒有氣泡。然后將包括構(gòu)建體的聚碳酸酯薄片放在生物安全層流室的無菌氣流 中，至少干燥12小時(shí)，達(dá)到10-20%的相對濕度。制備得到的構(gòu)建體是雙層的ICL構(gòu)建體，該構(gòu)建體已經(jīng)被交聯(lián)，并且被一種抗 微生物劑處理過以賦予其抗微生物性能，經(jīng)過層壓使得在構(gòu)建體的片層之間摻入了更多 抗微生物劑。棚列9 荊介二#腦物髓X押氧龍■髓■■細(xì)賄(MRSA) 在部分厚度傷口樽型中增殖的影響檢測三種抗微生物敷料對部分厚度傷口的抗菌活性，該傷口寄居有甲氧苯青霉 素抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)。由于豬皮膚與人皮膚在形態(tài)學(xué)上相似，因此使用豬作為試驗(yàn)動(dòng)物。豬重約 25-30kg，在開始試驗(yàn)之前將豬在圈中飼養(yǎng)兩周。給豬隨意飼喂基礎(chǔ)飼料，并在豬圈中單 獨(dú)飼養(yǎng)(遵照USDA的要求)，控制溫度(19-21°C )和光照(12h/12h光/暗)。肌肉注 射Telaz0l(5mg/kg)、甲苯噻嗪(2mg/kg)、阿托品(0.05mg/kg)并吸入異熒烷和氧氣的混 合氣來麻醉豬。用標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物剪毛機(jī)剪去豬背部的毛發(fā)。將豬背部兩側(cè)的皮膚用無抗菌 素的肥皂(Ncutrogcna )和無菌水洗滌。用無菌紗布將豬拭干。用專業(yè)電動(dòng)角質(zhì)切刀 在背部皮膚上造36個(gè)部分厚度傷口(10X7X0.3mm)。然后在傷口上接種甲氧苯青霉素 抗性金黃色葡萄球菌ATCC 33593。為了制備細(xì)菌接種物，可使用直接從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)， Rockville, Maryland獲得的病原性分離物的新鮮培養(yǎng)物。接種物是甲氧苯青霉素抗性金 黃色葡萄球菌ATCC 33593。通過ATCC標(biāo)準(zhǔn)回收操作，收集凍干細(xì)菌培養(yǎng)物。將培養(yǎng) 板上的過夜生長的培養(yǎng)物刮到5ml常規(guī)生理鹽水中，直到懸浮液的混濁度與MacFariand #8混濁度標(biāo)準(zhǔn)相同，來制備所有的接種物懸浮液。這將獲得約108的克隆形成單位/ ml(CFU/ml)的懸浮濃度。將108的懸浮液連續(xù)稀釋而制得濃度為約106CFU/ml的接種 物懸浮液。將少量接種物懸浮液覆蓋到培養(yǎng)液上，量化活生物體的精確濃度。用接種物 懸浮液直接接種各個(gè)傷口部位。將0.025ml (25 iU)懸浮液等分試樣添加到位于各個(gè)傷口 中央的無菌玻璃杯(直徑22mm)中。用無菌特氟倫刮刀將懸浮液在各個(gè)檢測部位上輕輕 涂抹10秒鐘，并干燥3分鐘。在接種后10分鐘內(nèi)，用聚亞胺酯膜敷料覆蓋所有接種傷
26口，24小時(shí)后開始處理，給予細(xì)菌以定居傷口的時(shí)間。再造三個(gè)傷口，進(jìn)行接種以在開始處理之前獲得基線CFU/ml:接種物L(fēng)og 4.24CFU/mL ；基線計(jì)數(shù)Log 5.38CFU/mL。按照如下試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對六個(gè)傷口進(jìn)行各種 處理。每日監(jiān)控動(dòng)物受試者是否存在任何可觀察到的疼痛或不適的跡象。為了有助于使 可能的不適最小化，在整個(gè)試驗(yàn)過程中使用一種止痛劑(duragesic-芬酞尼經(jīng)皮系統(tǒng)，其 以25i!g/hr洗提)1)敷料A是按照實(shí)施例8制備的經(jīng)PHMB處理的雙層構(gòu)建體2)敷料B是按照實(shí)施例8制備的經(jīng)雙層納米晶體銀處理的構(gòu)建體3)敷料C是按照實(shí)施例8制備的經(jīng)納米晶體銀處理的單層構(gòu)建體4)對照(石油紗布或聚亞胺酯膜)5)陽性對照(競爭性抗微生物的敷料或者抑菌油膏)6)未經(jīng)加工的、暴露于空氣的對照將除了未經(jīng)處理組外的其他所有處理組用聚亞胺酯膜覆蓋(與sponsor —致)。 將處理組隨機(jī)分為1、2、3、4、5或6區(qū)。每天總共對每個(gè)處理組的三個(gè)傷口進(jìn)行評價(jià)。在處理后的24小時(shí)和72小時(shí)，對各個(gè)處理組的三個(gè)傷口進(jìn)行培育。在各個(gè)取 樣時(shí)間點(diǎn)，對部位進(jìn)行定量地培育。每個(gè)部位僅培育一次。該區(qū)域被無菌玻璃杯(外 徑22mm)包圍，將玻璃杯用兩個(gè)手柄固定在適當(dāng)位置上。用移液槍將1ml涂抹液加到 玻璃杯中，用無菌特氟倫刮刀涂抹該部位30秒鐘。制備一系列稀釋液，用Spiral Plater System對涂抹液進(jìn)行量化，該系統(tǒng)將少量確定量的(40 iU)懸浮液滴加到旋轉(zhuǎn)瓊脂平板的 表面上。讓MRSA在選擇性培養(yǎng)液中生長，該培養(yǎng)液用Mueller Hinton瓊脂、4%NaCl和 eyg/ml苯唑西林配制。由于苯唑西林配制更為穩(wěn)定，用它替代甲氧苯青霉素。在培育 期(24小時(shí))后，對平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算每毫升的菌落形成單位(CFU/ml)。將該試驗(yàn)結(jié)果提供在表1中。結(jié)果表明雙層PHMB、雙層納米晶體銀，以及單
層納米晶體銀能夠有效地從傷口中根除細(xì)菌。
權(quán)利要求
1. 一種生物工程化的膠原構(gòu)建體，其包括一層源于小腸粘膜下層的純化的膠原組 織基質(zhì)，所述純化的膠原組織基質(zhì)已經(jīng)被一種抗微生物劑處理過，其中該構(gòu)建體是生物 相容的，并且當(dāng)被應(yīng)用于創(chuàng)面床時(shí)促進(jìn)組織生長。
2.權(quán)利要求1的生物工程化的膠原構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體是有網(wǎng)孔的、有窗的或 者被穿孔的。
3.權(quán)利要求2的生物工程化的膠原構(gòu)建體，其中網(wǎng)孔的網(wǎng)孔比例是1 1.5。
4.權(quán)利要求1的生物工程化的膠原構(gòu)建體，其中所述抗微生物劑選自納米晶體銀和 PHMB。
5.權(quán)利要求1的生物工程化的膠原構(gòu)建體，其中采用交聯(lián)劑1-乙基-3-(3-二甲基氨 基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽將所述構(gòu)建體化學(xué)粘合。
6.權(quán)利要求1的生物工程化的膠原構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體具有在約0.05mm到約 0.07mm之間的厚度。
7.權(quán)利要求1的生物工程化的膠原構(gòu)建體，其中構(gòu)建體是可生物重塑的。
8.生物工程化的膠原構(gòu)建體，包括雙層或多層經(jīng)化學(xué)粘合的用抗微生物劑處理的 加工的組織材料層，其中當(dāng)將構(gòu)建體植入哺乳動(dòng)物患者的創(chuàng)面床時(shí)，構(gòu)建體發(fā)生受控的 生物降解，伴隨發(fā)生足夠的活細(xì)胞替換，使得構(gòu)建體被患者的活細(xì)胞重塑。
9.權(quán)利要求8的生物工程化的膠原構(gòu)建體，其中構(gòu)建體有網(wǎng)孔的、有窗的或者被穿 孔的。
10.權(quán)利要求9的生物工程化的膠原構(gòu)建體，其中網(wǎng)孔的網(wǎng)孔比例是1 1.5。
11.權(quán)利要求8的生物工程化的膠原構(gòu)建體，其中抗微生物劑選自納米晶體銀和 PHMB。
12.權(quán)利要求8的生物工程化的膠原構(gòu)建體，其中采用交聯(lián)劑1-乙基-3-(3-二甲基 氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽將所述構(gòu)建體化學(xué)粘合。
13.權(quán)利要求8的生物工程化的膠原構(gòu)建體，其中構(gòu)建體是生物相容的。
14.權(quán)利要求8的生物工程化的膠原構(gòu)建體，其中加工的組織材料是小腸粘膜下層。
15.制備抗微生物的可生物重塑的假體的方法，該假體具有雙層或多層疊加的、粘合 的加工的組織基質(zhì)層，該方法包括步驟(a)層疊兩片或多片水合的加工的組織基質(zhì)層；(b)使所述的組織層脫水以將所述層粘連在一起；(C)用交聯(lián)劑交聯(lián)所述組織層以將所述層粘合在一起；(d)漂洗所述層以除去交聯(lián)劑；和(e)用一種抗微生物劑處理粘合的層；其中當(dāng)將假體植入到哺乳動(dòng)物患者中時(shí)，假體發(fā)生受控的生物降解，伴隨發(fā)生足夠 的活細(xì)胞替換，使得假體被患者的活細(xì)胞重塑。
16.制備抗微生物的可生物重塑的假體的方法，該假體具有雙層或多層疊加的、粘合 的源于小腸粘膜下層的加工的組織基質(zhì)層，該方法包括步驟(a)層疊兩片或多片水合的加工的組織基質(zhì)層；(b)使所述的組織層脫水以將所述層粘貼在一起；(c)用交聯(lián)劑交聯(lián)所述組織層以將所述層粘合在一起；(d)漂洗滌所述層以去除交聯(lián)劑；和(e)用一種抗微生物劑處理粘合的層；其中當(dāng)將假體植入到哺乳動(dòng)物患者中時(shí)，假體發(fā)生受控的生物降解，伴隨發(fā)生足夠 的活細(xì)胞替換，使得假體被患者的活細(xì)胞重塑。
17.制備抗微生物的創(chuàng)傷敷料的方法，該敷料具有單層源于小腸粘膜下層的加工的組 織基質(zhì)，該方法包括步驟(a)從所述粘膜下層中純化組織基質(zhì)；(b)用一種抗微生物劑處理所述組織基質(zhì)，其中當(dāng)創(chuàng)傷敷料被應(yīng)用于傷口時(shí)，它維持 濕潤的傷口環(huán)境以促進(jìn)傷口中的皮膚組織再生。
18.權(quán)利要求15、16或17的方法，其中創(chuàng)傷敷料是有網(wǎng)孔的、有窗的或者被穿孔的。
19.一種處理傷口的方法，包括步驟(a)清潔傷口和傷口周圍的區(qū)域；(b)應(yīng)用抗微生物的創(chuàng)傷敷料，該敷料包括用一種抗微生物劑處理的源于小腸粘膜下 層的純化的膠原組織基質(zhì)。
20.權(quán)利要求19的方法，其中抗微生物的創(chuàng)傷敷料是有網(wǎng)孔的、有窗的或者被穿孔的。
21.—種處理傷口的方法，包括步驟(a)清潔傷口和傷口周圍的區(qū)域；(b)將選自自體移植物、同種異體移植物或者培養(yǎng)的皮膚構(gòu)建體的皮膚替換物應(yīng)用到 皮膚；和(C)將包括用一種抗微生物劑處理的源于小腸粘膜下層的純化的膠原組織基質(zhì)的抗微 生物的創(chuàng)傷敷料應(yīng)用到所述的皮膚替換物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述的皮膚替換物是有網(wǎng)孔的、有窗的或者被穿孔的。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述的抗微生物的創(chuàng)傷敷料在應(yīng)用于傷口之前被網(wǎng)狀化。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述傷口選自由部分或完全厚度傷口、壓迫潰瘍、靜 脈潰瘍、糖尿病潰瘍、慢性血管潰瘍、隧道傷口、地雷傷口、外科手術(shù)傷口、用于自體 移植的供體部位傷口、Moh氏手術(shù)后傷口、激光手術(shù)后傷口、傷口開裂、外傷傷口、擦 傷、破口、二度燒傷、皮膚撕裂以及流液型傷口組成的組。
25.修復(fù)或替換受損組織的方法，包括下列步驟在患者中植入假體，所述方法包括 雙層或多層疊加的粘合的采用一種抗微生物劑處理的膠原材料層，其中當(dāng)將假體植入到 哺乳動(dòng)物患者中時(shí)，假體發(fā)生受控的生物降解，伴隨發(fā)生足夠的活細(xì)胞替換，使得被植 入的假體被患者的活細(xì)胞重塑。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述假體包括2 5個(gè)源于小腸粘膜下層的加工的腸道 膠原薄片，所述薄片被用濃度為0.1 IOOmM的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化 二亞胺鹽酸鹽粘合和交聯(lián)在一起。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述假體是疝氣修復(fù)補(bǔ)片、股疝修復(fù)塞子、心包補(bǔ)片、膀胱吊索、子宮吊索、心臟內(nèi)補(bǔ)片、心臟瓣膜替換物、血管補(bǔ)片、纖維環(huán)板層修復(fù) 塞子、修復(fù)纖維環(huán)板層補(bǔ)片、軸轉(zhuǎn)肌修復(fù)假體、硬腦膜修復(fù)補(bǔ)片、膀胱膨出修復(fù)裝置、 后腸腔修復(fù)裝置、陰道拱頂下垂修復(fù)吊索、整形手術(shù)植入物。
28.權(quán)利要求21的方法，其中需要修復(fù)的受損的或患病的軟組織用于處理腹壁和胸 壁的缺陷、肌肉翻轉(zhuǎn)加固、直腸和陰道下垂、骨盆底重構(gòu)、疝氣、縫合線加固和重構(gòu)操 作。
29.改性的腸道膠原層，其包括源于小腸粘膜下層的腸道膠原層，所述膠原層已經(jīng)被 一種抗微生物劑處理過。
30.權(quán)利要求29的改性的腸道膠原層，其中所述抗微生物劑是納米晶體銀。
31.權(quán)利要求30的改性的腸道膠原層，其中納米晶體銀沒有原子雜亂。
32.權(quán)利要求29的改進(jìn)的腸道膠原層，其中所述抗微生物劑是PHMB。
33.經(jīng)加工的組織基質(zhì)，其包括基本上不含有非膠原成分的哺乳動(dòng)物細(xì)胞組織，所述 經(jīng)加工的組織基質(zhì)已經(jīng)被一種抗微生物劑處理過。
34.權(quán)利要求33的經(jīng)加工的組織基質(zhì)，其中所述抗微生物劑是納米晶體銀。
35.權(quán)利要求34的經(jīng)加工的組織基質(zhì)，其中納米晶體銀沒有原子雜亂。
36.權(quán)利要求33的經(jīng)加工的組織基質(zhì)，其中所述抗微生物劑是PHMB。
全文摘要
本發(fā)明提供具有抗微生物性能的生物工程化的膠原構(gòu)建體。該生物工程化的膠原構(gòu)建體包含片狀的源于組織如小腸組織粘膜下層的純化的膠原組織基質(zhì)層或源于小腸組織粘膜下層的加工的腸道膠原層，它們被抗微生物劑處理過。該構(gòu)建體是生物相容的。本發(fā)明具有多種用途，包括創(chuàng)傷敷料和外科修復(fù)裝置。本發(fā)明還提供用于處理受損或患病的軟組織的方法。本發(fā)明還公開了對需要護(hù)理和治療的創(chuàng)傷進(jìn)行處理的方法。
文檔編號A61F2/00GK102014790SQ200680047281
公開日2011年4月13日 申請日期2006年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月18日
發(fā)明者A·J·尼克松, G·A·阿布拉漢 申請人:器官發(fā)生有限公司