專利名稱：：抗微生物構(gòu)建體的制作方法抗微生物構(gòu)建體對相關(guān)申請的交叉參考本申請要求于2007年7月16日提交的美國臨時專利申請?zhí)?0/950，080的益處。關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明本發(fā)明是由全國衛(wèi)生研究所在基金號為1R43DK072560-01的美國政府支持下進行的。政府在本發(fā)明中具有特定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
：1.本領(lǐng)域中已知的問題生物材料工程的進展已經(jīng)在心血管醫(yī)藥和手術(shù)、整形外科、眼科和牙科中產(chǎn)生許多高度顯著和成功的技術(shù)。盡管生物材料的應(yīng)用已經(jīng)改善了數(shù)百萬人的生活質(zhì)量，但是仍存在與當(dāng)前可用的材料相關(guān)的血液凝聚、纖維化、感染、炎癥反應(yīng)、降解和排斥的問題。其中，控制與材料的生物學(xué)相互作用對于設(shè)計永久以及再吸收的植入物、細胞和組織構(gòu)架、和診斷探針是非常重要的。控制材料和細菌之間的相互作用的能力尤其重要。醫(yī)學(xué)裝置中所用的大部分材料易受細菌黏附的影響。一旦細菌黏附到固體表面上，它們產(chǎn)生且變得包埋在多糖基質(zhì)內(nèi)以形成生物膜(biofilm)，在其中它們非常難以消滅。由于穿過生物膜基質(zhì)和/或滅活的困難性，宿主免疫系統(tǒng)和抗微生物劑均對細菌較不有效。另外，生物膜中的細菌具有更大的發(fā)展針對抗微生物劑的抗性的能力。為了減少由于裝置相關(guān)的感染引起的發(fā)病率和死亡率，防止生物膜形成是關(guān)鍵的。導(dǎo)管通常植入在血流、尿道、胸、頸、腹部、腿和脊髓中，且它們特別容易受可能在植入的數(shù)小時內(nèi)開始的微生物感染、血液凝結(jié)、和閉塞的影響。估計1/3的導(dǎo)管由于感染而失效，且約1/3由于閉塞導(dǎo)管的血纖蛋白形成而失效。在每種情形中，目前最有效的治療是用相似的裝置替換。植入物相關(guān)的感染可以導(dǎo)致全身感染，其在最壞的病例情形中，可能導(dǎo)致多器官衰竭和死亡，盡管成功解決了最初的醫(yī)學(xué)病癥。這樣的感染的成本是巨大的。例如，已經(jīng)預(yù)計中心靜脈導(dǎo)管相關(guān)的菌血癥的單次事件花費為$3，700-S50,000,由此引起的死亡率為4-35%。在美國每年使用約三百萬中心靜脈導(dǎo)管，并且在多于200，000名患者中發(fā)生導(dǎo)管相關(guān)的血流感染(CR-BSI)，多于80，000例是發(fā)生在加護病房(ICU)中。僅ICU感染成本就為兩億九百六十萬美元至二十三億美元，每年2，400-20，000例死亡。感染也是透析患者的主要問題。僅在美國，多于450，000人患有晚期腎衰竭，并且需要長期的血液透析。對于這些患者，血管進入過程是發(fā)病率和死亡率的主要原因。AV植入物在約42%的患者中使用，感染率為11-20%。由于這些植入物感染引起的死亡率為12-22%。已經(jīng)評價了一些導(dǎo)管改進方法，評價它們減少導(dǎo)管相關(guān)的血流感染(CR-BSI)發(fā)生的能力。所述方法可以分成兩類。在一類中，改良表面以防止細菌黏附。這些方法中的許多包括通過空間排斥最小化吸附和黏附和/或最小化界面能。在導(dǎo)管的情形中，蛋白吸附，特別是凝血因子I吸附，通常引起血栓形成或發(fā)展血纖蛋白鞘和最終的閉塞。血栓的一些蛋白成分增加細菌對導(dǎo)管的黏附，且與血栓形成和CR-BSI存在相關(guān)性。在疏水材料的表面，熵驅(qū)動的、疏水性相互作用主導(dǎo)蛋白吸附，且多個研究小組已經(jīng)表明用PEO植入的表面顯著較不傾向于吸附和黏附。盡管親水性涂層已經(jīng)表現(xiàn)出減少細菌黏附，但是感染問題仍然發(fā)生。在第二類中，改良表面或裝置材料浸透活性主動或防止細菌生長的試劑。已經(jīng)表明適合該類的兩種商購短期導(dǎo)管減少感染率，一種是氯己定-銀磺胺嘧啶-浸透的(CSI)，另一種是米諾環(huán)素-利福平浸透的(MRI)。然而，這些產(chǎn)品引起發(fā)展耐藥性細菌的顯著風(fēng)險。該風(fēng)險對于殺菌的CSI導(dǎo)管較低，但是在體外研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)暴露于氯己定可能導(dǎo)致細菌對其和其它治療抗微生物劑的增加的耐受性。此外，如果需要在原位長于三周，CSI就無效了，其比MRI較不有效，并且在日本已經(jīng)報道過與這些導(dǎo)管的使用相關(guān)的嚴(yán)重過敏反應(yīng)。盡管抗微生物導(dǎo)管比標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)管成本更高，但是研究已經(jīng)表明，由于治療CR-BSI的高成本，在高?；颊咧惺褂盟鼈兙哂姓w的成本益處?？刮⑸飳?dǎo)管的附加成本為每個導(dǎo)管$25-$34，但是對于CSI，每個導(dǎo)管的整體成本益處為約$200?；诔杀疽嫣幒透倪M的患者護理，對于使用抗微生物導(dǎo)管存在強烈的動力。然而，這些產(chǎn)生加重發(fā)展抗性細菌的非常嚴(yán)重的風(fēng)險，且目前僅推薦在高?；颊咧惺褂?在I⑶中，在完全父母營養(yǎng)，或免疫抑制的)。不幸的是，這些目前已知的技術(shù)尚未解決本領(lǐng)域的需要。相反，所需要的是這樣的材料改良(1)其在與裝置接觸時殺死細菌，以致抗菌劑不必釋放到血流或周圍組織中，(2)其是生物相容的，且在直接與患者連接時，將不會不利地影響患者，(3)其可以易于涂抹到各種材料和不規(guī)則形狀的物體上，⑷其防止血栓形成和閉塞，且(5)其不刺激在細菌中引起抗性的變化，并且因此可以在不影響臨床抗生素的效用的條件下廣泛使用。2.目前已知的嵌段共聚物已經(jīng)開發(fā)了不同類型的使用PLURONIC的表面活性劑的技術(shù)。PLURONIC的表面活性劑通常為水溶性高分子量聚氧化烯醚化合物。這些嵌段共聚物化合物已經(jīng)用來在界面上固定生物活性實體，取得了良好的成功。這些方法利用三嵌段共聚物(聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷)，其已在聚環(huán)氧乙烷鏈的末端進行修飾，以允許偶聯(lián)到生物分子上。這些修飾的共聚物通常稱為末端基團活化的聚合物或“EGAP”。關(guān)于這些類型的產(chǎn)品已經(jīng)提交了許多專利和專利申請，包括美國專利號6，087，452，美國專利號6，284，503，美國專利號6，670，199，美國專利申請公布號2004/0219541，美國專利申請公布號2004/0142011，美國專利申請公布號2005/0244456和美國專利申請公布號2005/0106208(所述專利/申請通過引用清楚地結(jié)合于本文中)。因此，對于關(guān)于這些產(chǎn)品的其它信息，讀者應(yīng)該參考這些專利。EGAP分子在來自水性溶液的疏水材料上自我裝配。這些疏水性聚環(huán)氧丙烷(“ΡΡ0”)中心嵌段與所述材料形成強疏水鍵，而聚環(huán)氧乙烷(“ΡΕ0”)末端嵌段保持在流體相中自由移動。使用該方法，在材料表面形成厚的PEO刷樣層，其作用為兩個重要的目的。第一，所述PEO層作用為肽和基底之間的襯墊，防止可能另外由于表面相互作用導(dǎo)致的任何對肽的變性，且保持肽的移動性。第二，所述PEO層防止對所述表面在隨后的應(yīng)用中可能暴露于其的蛋白或細胞的非特異性吸附。先前的研究已經(jīng)表明，EGAP技術(shù)比其它基于PEO的索鏈技術(shù)具有優(yōu)點其通過浸涂技術(shù)非常簡單地涂覆到材料上，其可以涂覆到各種不同類型的材料和不規(guī)則形狀的物體上，并且其提供系統(tǒng)性改變蛋白表面濃度的機制。由于不同的應(yīng)用所需要的不同機械性、電、和光學(xué)特性，醫(yī)學(xué)裝置、植入物、和組織工程支架由多種不同的材料類型制備。對于給定的應(yīng)用表現(xiàn)出最佳堆積(bulk)性能的大部分材料不具有足夠的生物相容性。對材料進行提高生物相容性的直接的化學(xué)修飾是復(fù)雜的，且可能改變材料特性。在一些情形中，基于材料類型或不規(guī)則的物體形狀，直接的化學(xué)修飾是不可行的。直接將生物分子吸附在所述表面上通常導(dǎo)致該生物分子的變性。EGAP技術(shù)為這些挑戰(zhàn)提供簡單而通用的解決方案，因為它可以通過簡單的浸涂方法應(yīng)用到多種不同的材料上，并且可以用來固定蛋白和肽并保留活性。3.抗微牛物肽關(guān)于殺死或減緩微生物如細菌、真菌、病毒、或寄生蟲的生長的抗微生物肽，已經(jīng)進行了其它的研究。已經(jīng)研究的抗微生物肽包括防衛(wèi)素、殺菌肽、細菌素、和其它天然或合成的陽離子肽。羊毛硫抗生素是一類細菌素。它們包括抗微生物肽乳鏈菌肽，并且是包括一個或多個羊毛硫氨酸環(huán)的抗生素化合物。目前已知四十多種羊毛硫抗生素，并且每年發(fā)現(xiàn)更多種。還正在開發(fā)具有提高的活性或穩(wěn)定性的抗微生物肽類似物[1]。羊毛硫抗生素的獨特的物理結(jié)構(gòu)，(例如，雙鍵，硫醚環(huán)，和不常見的氨基酸殘基)，使得這些抗微生物肽是高度反應(yīng)性的，并且與傳統(tǒng)抗生素的作用模式不同。這表明它們可以保持有效，而不管抗性細菌菌株的世界性增加。羊毛硫抗生素還在它們的抑制譜中表現(xiàn)出廣泛的可變性。一些羊毛硫抗生素，(例如，乳鏈菌肽和枯草菌素)針對革蘭氏-陽性細菌有活性，而另一些羊毛硫抗生素(例如，肉桂霉素)僅針對革蘭氏-陰性桿菌有活性。另外，一些羊毛硫抗生素具有抗病毒活性，(例如，羊毛硫肽)，一些作用為免疫抑制劑，(例如，mersacidin)，并且一些(例如，耐久霉素和血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制肽)可以抑制生物醫(yī)學(xué)重要的酶。乳鏈菌肽的結(jié)構(gòu)示意性地顯示在圖1中，乳鏈菌肽是目前為止關(guān)于生物材料應(yīng)用最廣泛研究的羊毛硫抗生素。具體地，圖1顯示N端結(jié)構(gòu)域(殘基1-19)包括標(biāo)記為A、B和C的三個羊毛硫氨酸環(huán)。圖1還顯示，C端結(jié)構(gòu)域(殘基23-34)包括兩個羊毛硫氨酸環(huán)，表示為D和E。另外，圖1顯示柔軟的鉸鏈區(qū)(殘基20-22)連接這兩個結(jié)構(gòu)域。(在圖1中，Abu是指2-氨基丁酸；Dha是指脫氫丙氨酸；Dhb是指脫氫丁酸甘油酯；Ala-S-Ala是指羊毛硫氨酸；且Abu-S-Ala是指β-甲基羊毛硫氨酸)。乳鏈菌肽作為有效和安全的食品防腐劑已經(jīng)具有長久的歷史。已經(jīng)表明，乳鏈菌肽可以吸附到合成的表面上，保持活性，并且殺死已在體外附著的細胞。盡管乳鏈菌肽已經(jīng)表現(xiàn)出僅針對革蘭氏-陽性細菌的活性，但是，當(dāng)與其它化合物如螯合劑組合使用時，它可以是某些革蘭氏-陰性細菌的有效抑制劑。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)是最常遇到的生物材料相關(guān)的病原體，并且二者均為革蘭氏-陽性細菌。乳鏈菌肽已經(jīng)表現(xiàn)出在體外防止微生物黏附在氣管內(nèi)吸引導(dǎo)管上(使用金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，和屎腸球菌(Enterococcusfaecalis)(屎鏈球菌(Streptococcusfaecalis))作為指示生物)，這促進在體內(nèi)評估綿羊中的乳鏈菌肽-處理的靜脈內(nèi)(IV)導(dǎo)管和小馬中的氣管切開管的進一步研究。用乳鏈菌肽預(yù)處理的用于長期(7天)放置的導(dǎo)管不保留抗微生物活性，而短期(3-5小時)IV導(dǎo)管保留。在IV導(dǎo)管上乳鏈菌肽活性的準(zhǔn)確持續(xù)時間尚是未知的。在實驗期間，對綿羊的臨床檢查沒有異常，并且在每組中沒有動物發(fā)展導(dǎo)管-相關(guān)的感染或靜脈血栓。與對照相比，使用短期導(dǎo)管的靜脈還表現(xiàn)出較少且較不嚴(yán)重的組織學(xué)異常，這表明對血管內(nèi)皮的可能的保護作用。作為乳鏈菌肽_處理的植入材料的最初的臨床前試驗，該研究代表開發(fā)用于植入醫(yī)學(xué)裝置的蛋白抗微生物膜的重要一步。羊毛硫抗生素具有許多使得它們有效用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的特點。與典型的肽不同，羊毛硫抗生素包含具有親電子中心的脫水氨基酸殘基，其容易與親核基團如細菌DNA和酶起反應(yīng)。與二硫鍵相比，在所有羊毛硫抗生素中存在的硫醚環(huán)使得該分子更加熱穩(wěn)定，更加不受還原劑的影響，且更不與自由基反應(yīng)。羊毛硫抗生素可以提供防止產(chǎn)生抗性微生物的手段，且由于它們的作用機制與傳統(tǒng)臨床抗生素的作用機制如此不相似，以致交叉抗性是高度不可能的。存在這樣一些報道，重復(fù)暴露于乳鏈菌肽可能在細菌中導(dǎo)致可能賦予其一些弱抗性的變化。然而，與它們的非抗性對應(yīng)物相比較，發(fā)生的變化似乎還使得細菌較弱，并且對抗生素或免疫反應(yīng)更敏感。多年來，乳鏈菌肽已被廣泛大量地用在食品產(chǎn)品中，沒有由于抗性的發(fā)展而產(chǎn)生的問題。存在一些不同的機制，通過這些機制羊毛硫抗生素發(fā)揮實施它們的抗微生物作用。A型羊毛硫抗生素(如乳鏈菌肽)是強陽離子線性分子。它們是高度表面活性的，且通過使得細胞的磷脂雙層不穩(wěn)定且產(chǎn)生瞬時的孔的多步步驟殺死敏感細菌。通過離子和細胞質(zhì)溶質(zhì)如氨基酸和核苷酸的流出、和隨后膜電勢的耗散而快速殺死靶向的細菌。細胞質(zhì)膜的去極化導(dǎo)致所有生物合成過程的立即終止。結(jié)構(gòu)分析已經(jīng)表明，乳鏈菌肽的親水基團與磷脂頭基團相互作用，且疏水側(cè)鏈包埋在膜的疏水核中?！靶ㄐ巍笨仔纬赡Ｐ涂紤]這些數(shù)據(jù)，但是提議肽插入到膜中，而不失去與膜表面的相互作用，這導(dǎo)致形成短期限(即，持續(xù)數(shù)毫秒至數(shù)秒)的孔。在該楔形模型中，提議孔形成由脂雙層的局部擾動引起，由此肽的疏水殘基淺淺插入到脂雙層的外部小葉中。另一方面，“桶-板”模型提議乳鏈菌肽作為單體結(jié)合且插入到脂雙層中。然后，所插入的單體橫向聚集形成孔。在存在許多關(guān)于細胞表面因子的參與、孔的壽命、和孔形成需要的分子數(shù)目的問題的時候，提議這些模型的任一種。這些尚未完全得到解答，但是最近的研究已經(jīng)揭示細胞壁前體“脂質(zhì)II”在孔形成中的重要性，和乳鏈菌肽分子的特定片段在孔形成中的功能重要性。發(fā)明簡述本發(fā)明產(chǎn)生結(jié)合蛋白抗性成分和活性抗微生物劑成分的表面、凝膠、泡沫、溶液和其它產(chǎn)品。還包括生產(chǎn)表面活性、抗菌的化合物。所述蛋白抗性成分是包含一個或多個親水結(jié)構(gòu)域和至少一個疏水結(jié)構(gòu)域的共聚物，如PLURONIC表面活性劑。所述蛋白抗性成分可以包括末端基團活化的聚合物(EGAP)，其中在所述聚合物上的末端基團活化位點提供必要的連接，以偶聯(lián)抗微生物成分，如羊毛硫抗生素。然后，抗微生物劑成分，如乳鏈菌肽或另一種羊毛硫抗生素，鏈接到EGAP中，并且加入到產(chǎn)品中，以產(chǎn)生抗菌表面。該方法還可以用來將具有有限特性的來自相對較小的實體的抗微生物化合物轉(zhuǎn)化成具有可能增強吸附、清除和可溶性的潛力的兩親性、表面活性特性的抗微生物化合物。這一新方法解決了現(xiàn)有方法的問題，且提供下述重要的優(yōu)點(1)它結(jié)合天然抗菌成分，以殺死細菌或其它微生物，其中所述成分不可能刺激細菌抗性，(2)它組合將幫助防止血纖蛋白形成和閉塞的表面特性，(3)它是生物相容性的，且可以與組織直接接界，(4)它可以容易地應(yīng)用于各種材料和不規(guī)則形狀的物體，(5)基于在實例中提供的出乎意料的結(jié)果，PEO鏈，在抑制自發(fā)洗脫以及包埋的肽與血液蛋白的交換的同時，還賦予針對構(gòu)象重排的某種程度的穩(wěn)定性，認為其轉(zhuǎn)化成提高的活性保持性，和(5)通過利用天然的、備選的抗生素，它不產(chǎn)生降低有限形式的臨床抗生素的功效的危險。這些優(yōu)點將允許更廣泛的應(yīng)用、增加的安全性、和降低的醫(yī)藥成本。本發(fā)明是基于這樣的認識，即，通過以形成柔性的索鏈(tether)和/或包埋肽的方式，連接肽與嵌段共聚物，如PLURONICF108或EGAP，可以使已知的具有抗微生物活性的肽如乳鏈菌肽形成持續(xù)長久的抗微生物表面涂層、添加劑、凝膠或泡沫劑。所包埋的肽通過從包埋物早期釋放而提供抗微生物作用，而索鏈化的肽提供持續(xù)更長久的抗微生物保護作用。一個實施方案是一類具有下式的化合物<image>imageseeoriginaldocumentpage8</image>其中所述共聚物包括一個或多個親水結(jié)構(gòu)域和至少一個疏水結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明所形成的新型的抗微生物產(chǎn)品將具有多種不同的應(yīng)用和用途。具體地，所述抗微生物產(chǎn)品可以被涂覆/吸附到基底上，以致所述嵌段共聚物將附著到所述基底上。(在本領(lǐng)域中，這些嵌段共聚物粘附到所述基底的表面的方式是已知的)。因此，一旦被涂覆，所述基底將在其表面上具有抗微生物涂層。在一些實施方案中，這種基底將是可以插入到患者中的醫(yī)學(xué)裝置。醫(yī)學(xué)裝置是任何類型的醫(yī)學(xué)裝置，包括導(dǎo)管等，其可以插入到患者中，或其可以用于身體外治療。在另一些實施方案中，所述基底可以是將由患者攝取的食品包裝材料或食品產(chǎn)品。由于聯(lián)邦藥物管理局(FDA)已經(jīng)核準(zhǔn)乳鏈菌肽和其它羊毛硫抗生素在食品工業(yè)中的應(yīng)用，該食品產(chǎn)品對于消費是安全的，但是將保留其抗菌特性。在其它實施方案中，按照本發(fā)明形成的抗微生物產(chǎn)品將放置在乳膏劑、泡沫、粉末、或凝膠中，由此產(chǎn)生可以應(yīng)用到皮膚、傷口、手術(shù)部位或應(yīng)用到基底/產(chǎn)品表面等的局部抗微生物產(chǎn)品。在一些實施方案中，具有抗微生物涂層的基底將以兩步方法形成。在第一步中，基底將暴露(例如，浸漬)在包含嵌段共聚物、末端基團活化的嵌段共聚物、或兩種的混合物的溶液中，持續(xù)足以使得所述嵌段共聚物或末端基團活化的嵌段共聚物吸附/結(jié)合到基底表面的時間。第二步將包括將嵌段共聚物包被的基底暴露(例如，浸漬)在包含抗微生物肽或該肽的官能化形式的溶液中，持續(xù)足以使該肽與所述嵌段共聚物結(jié)合的時間。附圖簡述下述描述可以依據(jù)幾幅附圖進行更好地理解，其中圖1示意性舉例說明乳鏈菌肽結(jié)構(gòu)的代表性實施方案；圖2包含描述在未用PLURONICF108,EGAP-NTA,乳鏈菌肽，F(xiàn)108+乳鏈菌肽，或乳鏈菌肽+NTA涂覆或用其涂覆的IV導(dǎo)管上細菌生長和附著的實驗結(jié)果的圖；圖3包含描述在用乳鏈菌肽，F(xiàn)108-乳鏈菌肽，或EGAP+乳鏈菌肽涂覆且還暴露于標(biāo)準(zhǔn)的細菌溶液中1天然后再用新鮮細菌刺激3或7天的基底上細菌生長和附著的實驗結(jié)果的圖；圖4包含描述在僅用乳鏈菌肽，F(xiàn)108+乳鏈菌肽，或EGAP+乳鏈菌肽涂覆的基底上細菌附著和生長的實驗結(jié)果的圖；對照包括未涂覆的聚苯乙烯和僅用MRS肉湯處理的未涂覆的聚苯乙烯；所述基底還暴露于標(biāo)準(zhǔn)細菌溶液1天，然后是MRS肉湯3或7天；圖5包含描述與乳鏈菌肽接觸且在馬血清中溫育7天的微球體的抗微生物活性的實驗結(jié)果；圖6包含描述在裸露的疏水和F108-涂覆的表面上乳鏈菌肽吸附和洗脫動力學(xué)的比較的實驗結(jié)果；圖7包含描述在已通過疏水締合、和通過共價附著用F108涂覆的疏水表面上記錄的乳鏈菌肽吸附和洗脫動力學(xué)的實驗結(jié)果；圖8包含在SATA交聯(lián)的各個階段乳鏈菌肽的抗菌活性的實驗結(jié)果；圖9舉例說明連接乳鏈菌肽與嵌段共聚物的代表性方式；圖10包含所提議的通過索鏈化乳鏈菌肽形成脂質(zhì)II-介導(dǎo)的孔的模型的示例；圖11包含顯示EGAP-乳鏈菌肽共聚物和對照的抗細菌活性的實驗結(jié)果；圖12包含顯示包含乳鏈菌肽的嵌段聚合物和對照在DTT處理之后的抗菌活性的實驗結(jié)果；圖13A包含顯示在存在MRS肉湯的條件下24小時，在涂覆和未涂覆的PU管上細菌黏附的實驗結(jié)果；圖13B包含顯示在聚氨基甲酸酯表面上對乳鏈菌肽涂覆和乳鏈菌肽結(jié)合共聚物的細菌黏附之間的比較的實驗結(jié)果；圖14包含顯示在存在MRS肉湯的條件下3天，在聚氨基甲酸酯管上的細菌黏附的實驗結(jié)果；圖15包含顯示在與乳鏈菌肽接觸且在25%馬血清中溫育后導(dǎo)管片段保持的抗微生物活性的實驗結(jié)果；圖16包含顯示關(guān)于PLURONICF108涂層的穩(wěn)定性的輻射作用的實驗結(jié)果；圖17包含顯示在裸露的疏水和PLURONICF108-涂覆的表面上由乳鏈菌肽展現(xiàn)的連續(xù)吸附和洗脫動力學(xué)的實驗結(jié)果。在第一個吸附周期過程中記錄的數(shù)據(jù)覆蓋在第二個吸附周期上，以比較以相同初始質(zhì)量密度但是在不同的形成歷史后記錄的吸附速率；圖18顯示在不含納米顆粒的溶液中溫育2小時和1周的乳鏈菌肽的CD光譜。乳鏈菌肽濃度是0.5mg/mL?！發(fā)x”是指0.85mg/mL的PEG濃度或2.08mg/mL的F108濃度；“5x，，是指4.25mg/mL的PEG濃度或10.4mg/mL的F108濃度；圖19A和19B顯示與F108-涂覆和未涂覆的疏水硅石納米顆粒接觸且在25°C在IOmM磷酸鈉緩沖液(pH7)中溫育(a)4小時(圖19A)、和(b)1周(圖19B)的乳鏈菌肽的⑶光譜。乳鏈菌肽濃度為0.5mg/mL；和圖20A和20B顯示與(a)未涂覆的疏水硅石納米顆粒(圖20A)；和(b)F108_涂覆的硅石納米顆粒(圖20B)接觸的乳鏈菌肽的CD光譜。每種情形下溫育時間為4小時。乳鏈菌肽濃度為0.5mg/mL。“l(fā)x”是指2.19mg/mL的納米顆粒濃度和1.35mg/mL的F108濃度(圖20B)；“5x”是指11.Omg/mL的納米顆粒濃度和6.75mg/mL的F108濃度(圖20B)；綜合下述描述，附圖可以輔助表明和解釋所述方法和組合物的原理。發(fā)明詳述將通過本文的描述更好地理解本發(fā)明目前優(yōu)選的實施方案。應(yīng)該易于理解，本發(fā)明的成分、特征和結(jié)構(gòu)，如概述那樣，可以以寬范的不同的構(gòu)型進行排列和設(shè)計。因此，下述本發(fā)明實施方案的更詳細描述不易于限制所要求的本發(fā)明的范圍，但是僅代表本發(fā)明目前優(yōu)選的實施方案。本發(fā)明涉及以形成柔性的索鏈和/或包埋肽的方式組合抗微生物肽與嵌段共聚物和/或末端基團活化的嵌段共聚物。所述肽通過從包埋物早釋放而提供抗微生物作用，且通過索鏈化的肽獲得持續(xù)長久的活性。一個實施方案包括與抗微生物肽連接的共聚物的構(gòu)建體，其具有下式抗微生物肽-共聚物另一個實施方案組合抗微生物肽與未修飾的共聚物，其中所述肽由所述共聚物的聚合物鏈物理包埋。另一個實施方案組合抗微生物-共聚物構(gòu)建體與未修飾的共聚物和/或抗微生物肽，其中所述肽由所述聚合物的聚合物鏈物理包埋。另一個實施方案組合抗微生物_共聚物構(gòu)建體與末端基團活化的共聚物，其中所述末端基團活化位點是金屬螯合基團，諸如氨三乙酸基團。在該實施方案中，可以添加另外的抗微生物肽，其中所述肽由所述共聚物的聚合物鏈通過物理包埋暫時保留。在優(yōu)選實施方案中所用的共聚物包含一個或多個親水嵌段和至少一個疏水嵌段。用于形成優(yōu)選實施方案的共聚物涂層的優(yōu)選的共聚物單元包括，但不限于，聚環(huán)氧乙烷(PEO)和聚環(huán)氧丙烷(PPO)，PEO和聚環(huán)氧丁烷，PEO和聚丁二烯，PEO和聚(N-乙酰乙烯亞胺)，PEO和苯基硼酸，PEO和聚氨基甲酸酯，PEO和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，PEO和聚(ε-己內(nèi)酯)，PEO和聚丙交酯酸，PEO和聚(丙交酯-共_乙交酯)，PEO和聚二甲亞砜，聚磷酸酯(PPE)和聚環(huán)氧丙烷(PPO)，PPE和聚環(huán)氧丁烷，PPE和聚丁二烯，PPE和聚(N-乙酰乙烯亞胺)，ΡΡΕ和苯基硼酸，PPE和聚氨基甲酸酯，PPE和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，PPE和聚(ε-己內(nèi)酯)，PPE和聚丙交酯酸，PPE和聚(丙交酯-共_乙交酯)與PPE和聚二甲亞砜。在前述共聚物單元對中，優(yōu)選地，親水結(jié)構(gòu)域包括ΡΕ0。先前已經(jīng)描述了使用這種類型的共聚物單元的共聚物以及它們涂敷材料以防止蛋白吸附的應(yīng)用[2；3；4；5；6；7；8；9；10]。在特定實施方案中，所述共聚物包括懸垂或搖擺親水結(jié)構(gòu)域，如聚(環(huán)氧乙烷)(PEO)鏈。所述共聚物的其它結(jié)構(gòu)域(s)包括疏水結(jié)構(gòu)域，如聚(環(huán)氧丙烷)(PPO)鏈。另夕卜，在某些實施方案中，連接基團(R)附著在共聚物鄰近親水結(jié)構(gòu)域的一個末端，以形成末端基團活化的聚合物。例如，所述末端基團活化的聚合物可以采用PEO和PPO嵌段的任何排列，其具有通式(R-PEO)a(PPO)b(1)其中a和b是整數(shù)，是相同的或不同的，且至少為1，優(yōu)選地a為1_6，且b為1-3，更優(yōu)選地a是1-2，且b是1。所述聚合的嵌段共聚物具有IOwt%-SOwt%，優(yōu)選50wt%-80wt%，更優(yōu)選70wt%PEO(-C2H4-O-)含量。所述PEO鏈或嵌段為下述通式-(-C2H4-O-)u(2)其中對于該分子中的不同PEO嵌段，u是相同的或不同的。典型地，u大于50，優(yōu)選為50-150，更優(yōu)選為80-130。PPO嵌段為下述通式-(-C3H6-O-)v(3)其中對于該分子中的不同PPO嵌段，ν可以是相同的或不同的。典型地，ν大于25，優(yōu)選為25-75，更優(yōu)選為30-60。所述共聚物可以是支鏈結(jié)構(gòu)，且包括其它結(jié)構(gòu)(例如，橋接結(jié)構(gòu)，或分支結(jié)構(gòu))和取代基，其不實質(zhì)性影響所述共聚物吸附在其上和覆蓋疏水表面的能力。實例包括在下述段落中所述的下述共聚物。在另一個實施方案中，優(yōu)選實施方案的末端基團活化的聚合物是具有懸垂R基團的聚合的三-嵌段共聚物的衍生物，如在下述式(4)中。例如，這些三-嵌段共聚物具有聚環(huán)氧丙烷的疏水中心嵌段和具有末端R基團的聚環(huán)氧乙烷的親水末端嵌段，并且可以由下式表不<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>其中y為25-75，優(yōu)選為30-60，且χ和ζ優(yōu)選是相同的，但是可以是不同的，且為50-150，優(yōu)選為80-130。某些類型的聚合物表面活性劑在商業(yè)上稱為"PLURONIC"或〃P0L0XAMERS"，且是可獲得的，例如，從BASF獲得。另一類合適的聚合的嵌段共聚物是二_嵌段共聚物，其中a=1和b=1，且可以由下式表示R-PEO-PPO-H(5)其中PEO和PPO為上文所定義。另一類合適的聚合的嵌段共聚物由商購的TETR0NIC表面活性劑(購自BSAF)所代表，其由下式表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>當(dāng)用于本文時，術(shù)語EGAP或EGAPs是指化學(xué)方程式(1)中定義的嵌段共聚物，其包括如定義的末端基團活化形式的PLURONICS三_嵌段共聚物表面活性劑、二_嵌段表面活性劑、TETRONIC表面活性劑、以及其它嵌段共聚物表面活性劑。如先前所公開的，特定官能團附著到親水結(jié)構(gòu)域的游離末端，以形成末端基團活化的聚合物。所述特定官能團(R)可以包含反應(yīng)基成員，如對-硝基苯酚基團，N-羥基琥珀酰亞胺基團，胼基團，馬來酰亞胺基團，硫代吡啶基，酪氨酰殘基，乙烯砜基團，碘乙酰亞胺基團，二硫化物基團或任何其它適于與抗微生物肽或衍生的抗微生物肽反應(yīng)的反應(yīng)基。在某些實施方案中，所述反應(yīng)基還選自已知在水性環(huán)境中穩(wěn)定的官能團，如胼基團，馬來酰亞胺基團，硫代吡啶基團，酪氨酰殘基，乙烯砜基團，碘乙酰亞胺基團，二硫化物基團。R還可以包括能夠與蛋白形成離子相互作用的官能團，例如氨三乙酸(NTA)基團，其在與金屬離子結(jié)合時，與組氨酸標(biāo)記的肽形成強鍵合，或者在不存在金屬離子的條件下，可以結(jié)合帶正電荷的肽。NTA修飾的PLUR0NICS記述在Steward等的美國專利號6，987，452中，其通過引用結(jié)合于此。R還可以包括可以結(jié)合寡核苷酸標(biāo)記的蛋白的寡核苷酸。寡核苷酸修飾的PLUR0NICS記述在Neff等的國際公開號W002/077159中，其通過引用結(jié)合于此。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述R基團包括R’-S-S基團，其中R’被取代以用于固定抗微生物肽。在一個實施方案中，取代基R’可以選自由下列各項組成的組(1)2-苯并噻唑基，(2)5-硝基-2-吡啶基，(3)2-吡啶基，(4)4-吡啶基，(5)5-羧基-2-吡啶基，和(6)(2)至(5)任一項的N-氧化物。優(yōu)選的末端基團包括2-吡啶基二硫化物(PDS)。這些基團與蛋白和多肽的反應(yīng)性在Carlsson等的美國專利號4，149，003和Axen等的美國專利號4，711，951中討論，所有這些通過引用結(jié)合于此。如上文提及，末端基團活化的聚合物(EGAP)s通常是一類包括嵌段共聚物骨架和活性或反應(yīng)性基團的合成物。優(yōu)選實施方案包括使用共聚物_抗微生物構(gòu)建體和/或共聚物與抗微生物肽的組合來抑制細菌和/或其它微生物劑如病毒和真菌的生長或存活力。在優(yōu)選實施方案中，用來形成所述共聚物-抗微生物構(gòu)建體或與共聚物組合的所述抗微生物劑可以選自下組殺死或減緩微生物如細菌、真菌、病毒、或寄生蟲的生長的肽，其包括防御素，殺菌肽，細菌素，以及其它天然的或合成的陽離子肽。優(yōu)選的肽組是羊毛硫抗生素，其是一類細菌素，且包括乳鏈菌肽，枯草菌素，肉桂霉素，羊毛硫肽，mersacidin，耐久霉素和血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制肽。本申請集中在抗微生物肽如乳鏈菌肽(和衍生物)與嵌段共聚物組合用于產(chǎn)生抗微生物材料的應(yīng)用。所述材料可以應(yīng)用到疏水表面上，以產(chǎn)生抗微生物表面。所述產(chǎn)品還可以用來形成凝膠、泡沫、乳劑等，或添加到凝膠、泡沫、乳劑等中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該認識到其它類型的抗微生物肽也可以用來與乳鏈菌肽組合和/或取代乳鏈菌肽。在特定實施方案中，使用EGAP材料，可以將多于一種抗微生物肽固定在一個表面上。Caldwell和他人先前已經(jīng)描述了EGAP用于蛋白固定的應(yīng)用。然而，Caldwell和他人使用EGAP制備這樣的表面，目的是評估或促進特定蛋白_蛋白相互作用和細胞對表面的黏附[11；12；13；14；15]。羊毛硫抗生素可從多種不同來源獲得。例如，生產(chǎn)乳鏈菌肽的乳酸乳球菌菌株(Lactococcuslactis)可從Jos印hMcGuire博士在美國俄勒岡州Corvallis的俄勒岡州州立大學(xué)管理的實驗室獲得。用于這種產(chǎn)物的有效的純化方法包括通過疏水相互作用層析處理不含細胞的上清，然后使用水性乙腈和0.三氟乙酸作為洗脫劑進行反相HPLCjB別處所述。通過離心、PH調(diào)節(jié)和膜過濾，獲得用于該目的的培養(yǎng)物上清(在30°C在MRS肉湯中生長24小時后)。通常，羊毛硫抗生素的生產(chǎn)和純化充分記錄在文獻中，包括發(fā)酵培養(yǎng)基的增強(例如，補充磷酸、絲氨酸、和蘇氨酸，偶聯(lián)廣譜蛋白酶抑制劑)以提高產(chǎn)量。乳鏈菌肽也是商業(yè)可獲得的。例如，NISAPLIN(其由美國密蘇里州圣路易斯的SIGMA-ALDRICH公司(西格瑪-奧德里奇公司)銷售)可作為食品級的防腐劑獲得，具有下述組成乳鏈菌肽(2.5%)；NaCl(77.5%)；蛋白(主要是變性的乳蛋白，12%)；碳水化合物(6%)；水(2%)?？刮⑸镫呐c嵌段共聚物的偶聯(lián)可以使用多種方法實現(xiàn)。如本文所解釋的，羊毛硫抗生素可以通過二硫鍵連接附著在末端基團活化的嵌段共聚物上。因此，可以修飾羊毛硫抗生素以包括巰基，以致可以進行這種二硫鍵連接。關(guān)于乳鏈菌肽，這種修飾可以通過向乳鏈菌肽肽的N-端異亮氨酸化學(xué)引入巰基而發(fā)生。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該認識到，在其它抗微生物肽中，可以對肽的N-端胺或其它胺進行類似的修飾，例如，在賴氨酸殘基上。所述嵌段共聚物還包含活化的末端基團，其中PEO基團的一個或多個羥基末端基團已用吡啶基二硫化物結(jié)構(gòu)部分取代。因此，然后，通過使乳鏈菌肽的巰基鍵合(通過二硫鍵連接)到嵌段共聚物的吡啶二硫化物結(jié)構(gòu)部分，可以將硫醇化的乳鏈菌肽與嵌段共聚物連接。另一種方法包括使用重組蛋白工程技術(shù)，來引入可以用來鍵合抗微生物肽與EGAP的結(jié)構(gòu)部分。例如，可以產(chǎn)生重組形式的乳鏈菌肽，其包含C-端或η-端半胱氨酸殘基。在一些情形中，半胱氨酸殘基可以通過甘氨酸間隔體與肽的天然序列分開。因此，然后，可以將以半胱氨酸為末端的肽通過二硫化物交換而連接到吡啶基二硫化物活化的嵌段共聚物中。另一種方法包括選擇能夠直接與天然形式的乳鏈菌肽反應(yīng)的末端基團活化的共聚物形式。該方法可以通過使對硝基苯酚活化的共聚物或N-羥基琥珀酰亞胺活化的共聚物與乳鏈菌肽的N-端胺反應(yīng)而實現(xiàn)。另一種方法包括重組加工產(chǎn)生具有末端組氨酸標(biāo)記的肽形式的乳鏈菌肽的生產(chǎn)。然后，在存在二價金屬離子的條件下，可以通過非常強的離子相互作用將組氨酸標(biāo)記的抗微生物肽連接到具有活化的末端基團的嵌段共聚物上，其中PEO基團的一個或多個羥基末端基團已用氨三乙酸基團取代。然后，可以通過層析或透析從任何未反應(yīng)的乳鏈菌肽分離這些抗微生物構(gòu)建體，并且可以用作針對細菌或其它微生物的抗微生物劑。可以使用用于引入巰基基團或其它反應(yīng)基的其它方式和/或方法，且(部分)取決于所用的具體的羊毛硫抗生素。此外，關(guān)于可以引入到嵌段共聚物中的其它類型的活化的末端基團，可以向羊毛硫抗生素中添加其它修飾/化學(xué)基團，以確保這兩種分子之間的偶聯(lián)，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的。本文將提供關(guān)于鍵合和/或結(jié)合嵌段共聚物和羊毛硫抗生素的反應(yīng)條件(例如，在所述嵌段共聚物和包含巰基的羊毛硫抗生素之間產(chǎn)生二硫鍵連接所需要的反應(yīng)條件)的具體實例。然而，一旦已經(jīng)形成該連接，將形成具有各種不同應(yīng)用和用途的抗微生物產(chǎn)品。這些涂層還有效防止表面上的血栓形成。對于血管裝置，血栓形成和抗細菌活性是存在的兩種最重要的問題，并且這些問題通常聯(lián)合出現(xiàn)。因此，下文給出本實施方案的涂層的一些可能的應(yīng)用。例如，醫(yī)學(xué)裝置可以用這種抗細菌涂層涂覆，其包括藥物遞送泵，藥物貯藏庫，包封裝置(用于細胞、藥物、或生物制劑)，血管進入裝置，經(jīng)皮裝置，神經(jīng)刺激裝置，神經(jīng)干預(yù)裝置，插管，縫合線和其它傷口閉合裝置，分流的通管(shunt)，引流管，飼管，整形外科裝置，牙科裝置，體外循環(huán)裝置和過濾裝置，管道，裝配(fittings)，Iuer鎖緊套口，光學(xué)裝置，和/或插入到患者體內(nèi)或與身體或體液接觸的其它醫(yī)學(xué)裝置。已經(jīng)表明PLUR0NICS可以涂覆到某些細胞或組織上，例如，PLUR0NICS已經(jīng)涂覆到紅細胞上，以制備通用的血液捐贈供應(yīng)。在組織產(chǎn)品上的這些EGAP-乳鏈菌肽或F108-乳鏈菌肽抗細菌涂層可以提供益處。一個實例是涂覆的心臟瓣膜?，F(xiàn)在，細菌感染是與心臟瓣膜置換術(shù)相關(guān)的主要問題。因為此，在植入瓣膜之前，許多外科醫(yī)生在手術(shù)室(“OR”)中將組織心臟瓣膜浸沒在萬古霉素溶液中。這是有問題的，因為(1)不存在一致性，(2)在手術(shù)室中它添加了步驟，(3)它產(chǎn)生發(fā)展針對萬古霉素的細菌抗性的潛力，萬古霉素是世界上最重要的臨床抗生素中的一種，和(4)它不能使得在患者的結(jié)果方面，患者能夠追蹤確定將所述抗細菌劑應(yīng)用到瓣膜上的實際益處。用EGAP-乳鏈菌肽預(yù)先涂覆的瓣膜是克服這些問題的優(yōu)越產(chǎn)品。此外，所述涂層的PEO成分還可以提供關(guān)于減少瓣膜鈣化的益處。這些益處還可以潛在地應(yīng)用到多種其它類型的組織產(chǎn)品上。在另一些情形中，構(gòu)建具有EGAP-乳鏈菌肽的涂層貯藏容器以⑴在不向產(chǎn)品添加抗生素的條件下，減少細菌感染的機會，(2)減少血液中或生物制劑中蛋白變性的程度(用于研究或藥物應(yīng)用)，和(3)減少由于由細菌釋放的蛋白酶發(fā)生的蛋白降解。所述貯藏容器可以用于食品包裝、血液袋、蛋白或藥物。用于清潔醫(yī)學(xué)裝置的溶液，殺菌或消毒環(huán)境中的產(chǎn)品(items)，或食品制備裝置/環(huán)境(清潔和短期保護)，也是所述抗細菌涂層的可能的應(yīng)用。用于涂覆個人產(chǎn)品或工業(yè)產(chǎn)品的溶液是另一種類型潛在的應(yīng)用。例如，用于體育運動的護口器、正牙裝置(固定器(retainer)、牙墊(dentalmouthpieces)(護口器以防止牙齒咬緊))面罩或呼吸面具、橡皮奶頭、隱形眼鏡、成人用品、食品制備物表面、食品、食品包裝、再使用水容器(如用于露營、運動水系統(tǒng)、水瓶等)、計算機鍵盤、電話、出租汽車方向盤(steeringwheel)、保健俱樂部裝備、渦流溫泉區(qū)(whirlpoolspas)、加濕器、裝飾的噴泉、和熱水箱均可以用本實施方案的產(chǎn)品涂覆，以提供抗微生物特性。旅館、健身房或溫泉中心的冷卻塔、渦流溫泉區(qū)或蒸汽浴、以及過濾裝置和水線(特別是用于牙科門診、透析中心、醫(yī)院、和無菌或消毒制造業(yè)或包裝區(qū)(例如，重組蛋白制備、生物制藥制備或藥物包裝)的那些)。此外，由于PLURONICF108和乳鏈菌肽核準(zhǔn)為食品添加劑，本實施方案可以用于食品工業(yè)，與其它方法相比較，如用醇洗滌，用漂白水漂洗或用肥皂洗滌，包含乳鏈菌肽的嵌段共聚物將提供持久的抗微生物活性。對于護牙合器(nightguards)和固定器，因為人們通常整夜佩戴這些產(chǎn)品，抗細菌涂層甚至可以幫助防止牙齒腐蝕。使用本發(fā)明的一種方法包括獲得包括嵌段共聚物和乳鏈菌肽或EGAP-乳鏈菌肽構(gòu)建體的干粉。使用者將所述干粉添加到水中，然后將需要的產(chǎn)品或表面溫育在所述溶液中給定的時間階段(所述時間階段可能是30秒-30分鐘)，并且然后用水漂洗。本實施方案還包括制備包含嵌段共聚物_乳鏈菌肽構(gòu)建體或嵌段共聚物和乳鏈菌肽的混合物的溶液，使用者將產(chǎn)品浸沒在其中某一時間段(例如，30秒-30分鐘)，然后用水漂洗。傷口愈合凝膠是所述嵌段共聚物-乳鏈菌肽產(chǎn)品的另一種應(yīng)用。例如，PLUR0NICS關(guān)于溶膠凝膠轉(zhuǎn)換具有非常有用的特性。在特定濃度，特定的PLUR0NICS或PLUR0NICS混合物將形成膠態(tài)溶液或凝膠。疏水實體如乳鏈菌肽通常將截留在所述凝膠的所述膠態(tài)或聚合物結(jié)構(gòu)的疏水核心內(nèi)。所述凝膠是生物相容性的，且具有高水含量，因此它們將非常適合用于保護傷口。這些凝膠可以與生長因子組合，以促進愈合，同時提供對傷口的保護。這些凝膠可以與消炎劑組合，以防止瘢痕形成，同時提供對傷口的保護。所述凝膠將特別有用于糖尿病性潰瘍和燒傷。泡沫清潔溶液也可以受益于包含所述抗微生物化合物。具體地，如果如本文教導(dǎo)那樣修飾PLUR0NICS，這些化合物可以添加到清潔溶液中，以為所述產(chǎn)品提供抗微生物特性。此外，PLURONICS早先已經(jīng)用來防止手術(shù)粘連。此外，如果這些PLUR0NICS如本文教導(dǎo)那樣進行修飾，將獲得抗菌特性。向牙膏或漱口劑中添加嵌段共聚物-乳鏈菌肽構(gòu)建體可以提供持久的防牙齒腐蝕保護(取決于人們何時刷牙或使用漱口劑和吃飯，可能為1-10小時)。還應(yīng)該注意，所述嵌段共聚物-抗微生物化合物還可以與金屬螯合劑聯(lián)合使用。具體地，一種或多種嵌段共聚物，而不包含抗微生物劑，可以另外在其末端包含金屬螯合齊U。在美國專利號6，087，452(其已經(jīng)通過引用結(jié)合于此)中教導(dǎo)了這些類型的金屬螯合嵌段共聚物。當(dāng)羊毛硫抗生素(乳鏈菌肽)與其它化合物如螯合劑組合使用時，對乳鏈菌肽和其它羊毛硫抗生素敏感的生物體(細菌)的譜可以拓寬至其它物種。一些螯合劑可以使細菌對羊毛硫抗生素和/或其它抗生素更敏感?？咕抖喂簿畚锖万蟿┑倪@種組合可以通過用EGAP-乳鏈菌肽和EGAP-NTA組合涂覆表面獲得，其中NTA是強金屬螯合劑，氨三乙酸。該方法的優(yōu)點在于，所述金屬螯合劑鏈接到基底上，因此不釋放到周圍環(huán)境中，其可能是血液或組織。在許多情形中，抗血栓形成和抗增殖功能，以及抗感染功能，是生物材料的理想特征。因此，在一些實施方案中，與金屬螯合劑的組合可能是理想的。對于需要更長期的穩(wěn)定性的某些應(yīng)用，可能需要在涂覆過程中結(jié)合另外實用的步驟，以產(chǎn)生更長期穩(wěn)定的層，如下文所述，所述層物理包埋或共價結(jié)合在表面上。先前已經(jīng)描述的一種方法包括用硅烷預(yù)處理和隨后的輻射以使EGAP共價結(jié)合到金屬或玻璃基底上的應(yīng)用。使用用十二烷基硫酸鈉(SDS)嚴(yán)格洗滌的研究表明，該方法增加表面上的EGAP和PIAJRONIC涂層的穩(wěn)定性，同時保留所述涂層的PEO成分的蛋白排斥益處。這種植入技術(shù)還易用于寬泛種類的生物材料，有機的和無機的。另一種方法包括使用共吸附的熱或UV活化交聯(lián)劑，如過氧化二枯基(DCP)，以通過交聯(lián)所述共聚物和其下面的基底而產(chǎn)生更持久的涂層。他人已對DCP進行了研究，用于將PLUR0NICS結(jié)合在用于血袋材料的本體聚合物中，取得了良好的成功。另一種方法將包括在擠壓或成型之前將所述EGAP-抗微生物構(gòu)建體和制備裝置的本體聚合物基質(zhì)化(matrixing)。抗微生物嵌段共聚物可以依據(jù)多種不同的方法制備。例如，可以構(gòu)建一些實施方案，其中基底表面首先用末端基團活化的嵌段共聚物涂覆。這可以通過將所述基底暴露(如通過浸漬)在所述末端基團活化的嵌段共聚物的溶液中進行。然后，在第二步，將所述基底表面暴露于(即，噴霧或浸漬)在抗微生物肽或衍生的抗微生物肽溶液中，持續(xù)足以使得所述肽與所述末端基團活化的共聚物共價鍵合的時間。在另一些實施方案中，所述抗微生物涂層可以首先通過將所述末端基團活化的嵌段共聚物與所述抗微生物肽或衍生的抗微生物肽反應(yīng)而產(chǎn)生。取決于反應(yīng)條件，后續(xù)處理步驟，和最終產(chǎn)品應(yīng)用，純化包含羊毛硫抗生素的嵌段共聚物的步驟可以或可以不是必需的。在已經(jīng)形成包含羊毛硫抗生素的嵌段共聚物后，然后，將該產(chǎn)品的溶液應(yīng)用到基底的表面上(通過將所述底物浸漬在溶液中，將包含羊毛硫抗生素的嵌段共聚物的溶液噴霧到表面的頂部，等等)。盡管本發(fā)明的許多討論集中在共價連接羊毛硫抗生素和嵌段共聚物，其它研究已經(jīng)表明，所述共價連接不是嚴(yán)格必需的。研究已經(jīng)表明，當(dāng)表面用PLURONICF108涂覆且用乳鏈菌肽溫育時，PLURONIC:F108將所述乳鏈菌肽保留在表面上，并且隨著洗滌緩慢將其釋放。盡管不受該理論的限制，據(jù)信一些乳鏈菌肽臨時包埋在該聚合物的PEO鏈中，且在乳鏈菌肽和PEO鏈之間可能存在促進包埋的特異性物理相互作用。此外，這樣的層可以“防止”乳鏈菌肽與血液蛋白的可能的表面交換，且還可以幫助防止由于變性引起的活性損失。事實上，圓二色譜數(shù)據(jù)表明，與直接吸附的乳鏈菌肽相比較，PEO包埋的乳鏈菌肽保留更大的活性。所包埋的乳鏈菌肽隨著時間(和通過洗滌)從所述嵌段共聚物緩慢釋放。所包埋的乳鏈菌肽的這種緩慢釋放為該表面提供抗菌特性，一旦所有的乳鏈菌肽都從所述表面釋放且不再存在于裝置的附近，將失去所述抗菌特性。因此，使用這一知識，對于某些應(yīng)用，與僅用PLURONICF108(或其它嵌段共聚物)和乳鏈菌肽共價結(jié)合的乳鏈菌肽相比較，可以制備在相對短時間階段具有抗菌活性的表面。這一方法還將需要更少的步驟和更少的試劑來將涂層應(yīng)用到表面上，并且因此還將提供關(guān)于制備成本、時間和設(shè)備需求的優(yōu)點。應(yīng)該注意，PLURONIC包埋乳鏈菌肽的能力是高度出乎意料的，且與本領(lǐng)域中的常識相反。公知的是PEO抵抗蛋白相互作用，且已經(jīng)表明PEO和PLURONICF108涂覆的表面防止蛋白吸附。因此，在申請人的研究之前，據(jù)信，除了在末端基團活化的PLURONICS上的反應(yīng)位點之外，乳鏈菌肽不與PLURONIC相互作用。因此，乳鏈菌肽以除反應(yīng)末端位點之外的位置包埋在PLURONIC:表面涂層中的發(fā)現(xiàn)是出乎意料的。其他研究已經(jīng)表明，當(dāng)使用UV或e-束輻射來將三嵌段共聚物“永久性”結(jié)合到表面上時，EGAP涂覆的基底可以具有比PLURONICF108涂覆的基底更好的蛋白排斥特性。盡管不受這一理論限制，可能的是，在聚合物本身或聚合物和表面之間的某種程度的交聯(lián)(通過末端基團活性位點)導(dǎo)致更有效的蛋白排斥層。如果在表面上存在交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)，可能的是，與單獨的F108相比較，該層可以作用為抗微生物劑更好的包埋層，并且將提高所述表面包埋抗微生物劑的能力。嵌段共聚物包埋乳鏈菌肽和其它羊毛硫抗生素的能力意指可以構(gòu)建這樣的實施方案，其具有大量包埋的羊毛硫抗生素和另外共價附著到嵌段共聚物上的一些羊毛硫抗生素。這些表面由所包埋的乳鏈菌肽(或其它抗微生物劑)提供早期釋放和抗生素保護作用，以及由表面附著的乳鏈菌肽提供長久作用的保護作用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該認識到，除了乳鏈菌肽之外，其它分子，包括肽、藥物、治療齊U、或其它生物化合物可以包埋在嵌段共聚物內(nèi)。例如，可以進行這樣的實施方案，其中肽、藥物、DNA序列、SiRNA等可以包埋在嵌段共聚物中，并且然后緩慢釋放。如果基底的表面是插入到人患者中的醫(yī)學(xué)裝置，可以理想地使這些化合物將所述化合物緩慢地釋放到患者體內(nèi)，因為它提供一種新的改進的方式將藥物、治療劑等引入到患者內(nèi)。現(xiàn)在將提供關(guān)于已經(jīng)使用乳鏈菌肽和/或一種或多種嵌段共聚物進行的制備和研究的非限制性實施例。如上文所述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該認識到，除乳鏈菌肽之外，其它類型的羊毛硫抗生素可以以相同的方式反應(yīng)。實施例1涂覆的IV導(dǎo)管的制備和分析基底涂層將IV導(dǎo)管(24GX3/4”，Terumo)在底部切割，然后在兩端使用本生燈(Bunsenburner)熱封?？捎糜谘芯康拈L度是1.9cm。如所示制備樣品，η=4。對照(1.)沒有細菌的樣品，(2.)未涂覆的樣品，(3.)消毒的磷酸緩沖液，IOmM,pH6.O(PB)處理的樣品，(4.)F108(l%w/v)涂覆的，(5.)EGAP-NTA(l%w/v)涂覆的樣品。(除1外，所有其它的均有細菌培養(yǎng)物)。研究中的樣品乳鏈菌肽涂覆的，F(xiàn)108和乳鏈菌肽涂覆的與EGAP-NTA和乳鏈菌肽涂覆的。乳鏈菌肽濃度為0.5mg/ml。所有樣品均用IXH2O漂洗，且將適當(dāng)?shù)臉悠吩跓o菌水中w/v的溶液中用各自的聚合物涂覆過夜。然后，將用乳鏈菌肽進一步處理的樣品和對照用PB漂洗3次。乳鏈菌肽制備將乳鏈菌肽溶解在磷酸二氫鉀中。然后，加入磷酸氫二鉀，以獲得6.0的終pH和10mg/ml的濃度。然后，用0.2μm、低蛋白結(jié)合濾器過濾乳鏈菌肽儲液，并且用PB稀釋至需要的濃度。將乳鏈菌肽溶液加入到適當(dāng)?shù)臉悠分?，并且涂覆過夜。然后，不管涂覆/處理形式，用PBS(20mMPB,150mMNaCl)將所有樣品漂洗3次。細菌培養(yǎng)物和與樣品的溫育戊糖片球菌(PediococcusPentosaceus)FBB61-2，其為一種革蘭氏陽性細菌，用作敏感指示菌株。將戊糖片球菌的甘油儲液劃線在瓊脂平板上，并且在37°C培養(yǎng)箱中生長24小時。挑取單個細菌菌落，且接種在2個分開的在50ml聚苯乙烯管中的IOmlMRS(deMan,Rogosa和Sharpe)肉湯溶液的等分試樣中。還僅用在表面上劃線的環(huán)線制備對照平板，其已經(jīng)進行了同細菌所需要的相同的滅菌步驟。對照也接種在IOmlMRS肉湯中。將對照和兩份樣品在搖動平板上以250rpm生長過夜。進行樣品和對照的分光光度計分析，并且使用MRS肉湯稀釋各份樣品，以獲得在600nm處0.1的吸光度。將來自兩份稀釋的細菌培養(yǎng)物樣品和對照的Iml等分試樣加入到在1.5ml聚苯乙烯管中的涂覆的樣品中。生物膜分析在37°C在靜態(tài)條件下，將細菌培養(yǎng)物與樣品和對照溫育24小時。取出培養(yǎng)物溶液，并且將所有樣品用PBS漂洗3次，并置于新的、無菌的1.5ml聚苯乙烯管中。將ImlMRS肉湯加入到所有包含樣品的管中，然后將所述樣品超聲處理25分鐘。超聲處理后，將樣品置于37°C培養(yǎng)箱中。溫育4小時后取出樣品，并且置于4°C冰箱中，以延遲細菌生長。然而，在該時間點，發(fā)現(xiàn)在用和不用細菌處理的未涂覆的對照之間不存在測量上的差異。因此，將所有樣品放回到37°C培養(yǎng)箱中，以在更長的時間階段后進行研究。第二次溫育的時間階段持續(xù)14小時，之后，將樣品置于4°C冰箱中，以延遲細菌生長。用空白溶液進行分光光度計分析，所述空白溶液是4°C的MRS肉湯。結(jié)果實施例1中的實驗結(jié)果顯示在圖2中，并且表明較少的細菌附著和生長在用乳鏈菌肽、F108和乳鏈菌肽、或EGAP+NTA和乳鏈菌肽涂覆的基底上。具體地，圖2舉例說明戊糖片球菌在未涂覆的(PB處理的)，F(xiàn)108(F108涂覆的)、EGAP-NTA、乳鏈菌肽、F108+乳鏈菌肽、和EGAP-NTA加乳鏈菌肽(乳鏈菌肽+NTA)涂覆的聚氨基甲酸酯IV導(dǎo)管上的附著和生長。實施例2涂覆的基底的活性持續(xù)時間基底涂層在該實驗中評估3個變量1.組合聚合物涂層和乳鏈菌肽的作用2.隨時間用新鮮細菌培養(yǎng)物重復(fù)刺激表面相對于僅用細菌培育然后在MRS中培育的作用3.培育時間(3或7天)聚合物涂層將聚苯乙烯24孔板(無菌的、無組織培養(yǎng)物)(Falcon，BectonDickenson)用無菌diH20漂洗，并且在適當(dāng)?shù)目字屑尤?%w/v無菌過濾的F108或EGAP-NTA溶液。將板放置在250rpm搖動器部件上過夜。乳鏈菌肽溶液制備將在0.1%三氟乙酸(TFA)中濃度為10mg/ml的乳鏈菌肽儲液溶解在0.IM磷酸二氫鉀、0.IM磷酸氫二鉀、IOmMEDTA和diH20的溶液中，以獲得pH6.8U00yg/ml的終濃度。乳鏈菌肽涂層將用乳鏈菌肽涂覆的孔用diH20漂洗3次，且向指定的孔中加入350μ1乳鏈菌肽溶液。將板置于250rpm的板搖動器上在黑暗條件下環(huán)境溫度下過夜。細菌培養(yǎng)物制備將戊糖片球菌的甘油儲液劃線到兩個瓊脂平板上，并且在37°C培養(yǎng)箱中生長24小時。從兩個瓊脂平板的每一個上挑取單個菌落，并且接種到兩份獨立的在50ml聚苯乙烯管中的15mlMRS肉湯溶液等分試樣中。還僅用劃線在表面上的環(huán)線制備對照板，其已經(jīng)進行了同細菌所需要的相同的滅菌步驟。對照也接種在15mlMRS肉湯中。將對照和兩份樣品在搖動板上以250rpm生長過夜。使用分光光度計測量戊糖片球菌培養(yǎng)物和對照的吸光度。用MRS肉湯稀釋培養(yǎng)物，以獲得在600nm處0.1的吸光度。以這種方式制備和稀釋的細菌樣品稱為標(biāo)準(zhǔn)細菌溶液。在本實驗中，在多個時間點，用新鮮的細菌處理一組樣品。對于每個時間點，如上述制備新鮮的標(biāo)準(zhǔn)細菌溶液。樣品處理用細菌進行的初始處理去除涂覆溶液，且向孔中加入350μ1標(biāo)準(zhǔn)細菌溶液的等分試樣。對于特定的對照樣品，加入MRS，而不是標(biāo)準(zhǔn)細菌溶液。次級處理-細菌在初始細菌處理后，去除先前的培養(yǎng)物，并且不漂洗，向樣品孔中加入新鮮的標(biāo)準(zhǔn)細菌溶液。在指定的時間點，將細菌培養(yǎng)物從孔中去除，并且用Iml無菌diH20漂洗3次。然后，向孔中加入新鮮的MRS(350μ1)，并且溫育24小時。從樣品中去除肉湯，并且用新鮮的MRS肉湯稀釋至1/10，1/20和1/40，并且在600nm處測量每份稀釋液的吸光度。次級處理-MRS:在初始細菌處理后，去除細菌培養(yǎng)物，并且用無菌diH20(lml)漂洗3次。向這些孔中加入新鮮的MRS肉湯(350μ1)。在指定的時間點，將MRS肉湯從孔中去除，并且樣品用diH20洗滌3次。然后，加入新鮮的MRS肉湯(350μ1)，并且與所述樣品一起溫育24小時。從樣品中去除MRS肉湯，并且用新鮮的MRS肉湯稀釋至1/10，1/20和1/40，并且在600nm處測量每份稀釋液的吸光度。結(jié)果圖3顯示關(guān)于用細菌進行次級處理的樣品的結(jié)果。特別地，如上述討論那樣，圖3顯示在暴露于標(biāo)準(zhǔn)細菌溶液1天然后用新鮮細菌再刺激3或7天的基底上戊糖片球菌的附著和生長。在圖3中，僅用乳鏈菌肽涂覆的PS稱為(乳鏈菌肽)，用F108和乳鏈菌肽涂覆的PS稱為(F108+乳鏈菌肽)，和用EGAP-NTA和乳鏈菌肽涂覆的PS稱為(EGAP+乳鏈菌肽)。圖4顯示關(guān)于用MRS進行次級處理的樣品的結(jié)果。如所述，圖4顯示在暴露于標(biāo)準(zhǔn)細菌溶液1天然后是MRS肉湯3或7天的基底上戊糖片球菌的附著和生長。在圖4中，僅用乳鏈菌肽涂覆的PS稱為(乳鏈菌肽)，用F108和乳鏈菌肽涂覆的PS稱為(F108+乳鏈菌肽)，和用EGAP-NTA和乳鏈菌肽涂覆的PS稱為(EGAP+乳鏈菌肽)。未涂覆的聚苯乙烯(未處理的)和僅用MRS肉湯處理的未涂覆的聚苯乙烯(處理的無細菌)用作對照。對于對照樣品，僅顯示關(guān)于第3天時間點的數(shù)據(jù)。實施例3在存在血清的K牛下，乳鏈Ifjfe^^妊求體上射舌個牛在用馬血清溫育7天后，比較乳鏈菌肽涂覆的微球體的抗微生物活性與用PLURONICFlOS和乳鏈菌肽的組合涂覆的微球體的抗微生物活性。制備F108-涂覆的表面將聚苯乙烯微球體(1.247μm直徑，PartNo.81002497100290,Seradyn)與F108(5mg/mL)混合，并且在磷酸緩沖液中在旋轉(zhuǎn)器上溫育過夜。F108分子的疏水PPO嵌段吸附在聚苯乙烯表面上，以致親水PEO鏈延伸至溶液相中。通過在磷酸緩沖液中重復(fù)洗滌，包括渦旋和超聲處理，離心和重懸，將未結(jié)合的F108從涂覆的微球體上去除。乳鏈菌肽負載和溫育將F108-涂覆的和裸露的微球體樣品分別與8X10_3mg/ml乳鏈菌肽混合，并且在室溫下在管旋轉(zhuǎn)器上，在磷酸緩沖液中溫育1小時。然后，通過重復(fù)洗滌(超聲處理、離心和重懸在磷酸緩沖液中)去除未結(jié)合的乳鏈菌肽。通過在接種戊糖片球菌的平板上使用瓊脂平板擴散測定法[3，4]驗證在上清中不存在未結(jié)合的乳鏈菌肽。瓊脂擴散測定法是最常見的乳鏈菌肽活性測定類型。簡言之，在接種了戊糖片球菌的營養(yǎng)瓊脂平板上無菌打孔，并且將上清樣品放置在孔中。溫育后，記錄在每個孔附近的抑制圈。僅在最后一次洗滌步驟后在上清中沒有檢測到乳鏈菌肽活性(即，在孔周圍沒有可見的抑制圈)后，使用微球體混懸液。還在不含微球體的磷酸緩沖液(IOmM)和F108(5mg/mL)溶液中溫育乳鏈菌肽(8X10_3mg/mL)，以用于對照比較。然后，將負載乳鏈菌肽的微球體和對照樣品在磷酸緩沖液中或在需要稀釋度的馬血清(10，50和100%血清)中在37°C溫育需要的時間階段(0，1，4，和7天)。戊糖片球菌的培育和抗菌活件測量使用MRS肉湯來培育乳鏈菌肽-敏感的戊糖片球菌菌株FBB61_2。將MRS(52.2g，目錄號1.10661，EMD化學(xué)公司(EMDChemicals，Inc.))溶解在IL的DI水中，并且在121°C高壓滅菌30分鐘。將戊糖片球菌在37°C溫育過夜(20小時)，并且置于220rpm的定軌振蕩器上。測量過夜培養(yǎng)物、和過夜培養(yǎng)物的100-倍稀釋液的光學(xué)密度(0D_)，以確保細胞密度一致。在將樣品在緩沖液或馬血清中溫育后，將微球體洗滌兩次，然后用過夜戊糖片球菌培養(yǎng)物的100-倍稀釋液在37°C混合4小時。這些是取樣的，且稀釋了100倍。然后，用基于MRS的熔融瓊脂(44°C)將培養(yǎng)物樣品(0.5mL)平均分布到培養(yǎng)皿上。將該培養(yǎng)皿在37°C溫育48小時，直到細菌菌落變得明顯可見。在48小時后記錄的菌落數(shù)目視為在用戊糖片球菌懸浮期間乳鏈菌肽涂層功效的指示。圖5顯示在與乳鏈菌肽接觸且在37°C用馬血清溫育7天后在未涂覆的和F108-涂覆的微球體之間抗微生物活性的比較結(jié)果。盡管在每種情形中，血清蛋白濃度的增加降低了在微球體上保留的乳鏈菌肽的活性，但是當(dāng)由血液蛋白刺激時，F(xiàn)108-涂覆的微球體明顯比裸露的微球體保留了更多的乳鏈菌肽活性。如上述，這些結(jié)果表明F108涂層抑制血清蛋白對乳鏈菌肽的交換。實施例4在棵露的或PLURPNICF108涂覆的硅烷化玻璃上的乳鏈菌肽吸附和洗脫利用橢圓對稱法來測量來自裸露的疏水或PLURONICF108涂覆的硅烷化的、硅石表面的乳鏈菌肽的吸附和洗脫的相對速率。橢圓對稱法按下述進行將硅石樣品(用F108涂覆或未涂覆的)置于熔融石英、梯形小杯(HellmaCells,德國)中，其被緊固在自動原位橢圓計(L-104SA型，Gaertner科學(xué)公司(GaertnerScientificCorp.))的樣品臺上，所述自動原位橢圓計被改進允許攪拌和流動。在將4.5mLIOmM磷酸緩沖液(pH7.0)注射到小杯中后，調(diào)整橢圓計臺以獲得反射光強度的最大值和穩(wěn)定的光學(xué)特性。在將0.5mL蛋白或F108溶液注射到所述小杯中以產(chǎn)生0.50mg/mL的終蛋白濃度或0.5%(w/v)的終F108濃度之前，每15秒記錄表面光學(xué)特性，記錄30分鐘。允許吸附發(fā)生需要的時間階段，之后用IOmM磷酸鈉緩沖液以31.6mL/分鐘的流速原位漂洗該表面5分鐘。然后，監(jiān)測膜特性需要的“溫育”時間階段。在給定實驗中進行的任何額外的蛋白吸附和漂洗_溫育步驟均以上述相同的方式進行。使用單膜型橢圓對稱法程序(one-film-modelellipsometryprogram)[19]來由按照Cuypers等[20]橢圓對稱法確定的膜厚度和折光指數(shù)值(這些光學(xué)特性在每次測量中同時確定)確定蛋白的吸附質(zhì)量。使用3.837mL/g的微分比容和0.729g/mL的分子量與摩爾折射率的比率。每個實驗在每種類型的表面上進行至少兩次，對平均值的平均偏差約為0.005μg/cm2。圖6所示的結(jié)果提供在裸露的疏水和F108-涂覆的表面上乳鏈菌肽吸附和洗脫動力學(xué)的代表性比較。在每種情形中，乳鏈菌肽吸附?jīng)]有達到穩(wěn)定值，并且基于乳鏈菌肽在溶液中的尺寸(如果建模為圓柱體，約2X5nm)，“側(cè)面”(S卩，在等于2X5=IOnm2的面積上)和“底面”(即，在等于2X2=4nm2的面積上)吸附的分子單層將分別導(dǎo)致0.058和0.145μg/cm2的吸附質(zhì)量。因此，圖6所示的模式與每種情形中的多層吸附一致。乳鏈菌肽對F108-涂覆的表面的吸附通常比對裸露的疏水表面的吸附更緩慢，這可能是由于懸垂的PEO鏈的空間抑制作用。開始時，在每種表面上，乳鏈菌肽在不含蛋白的緩沖液中的洗脫是相似的，但是僅在裸露的疏水表面上觀察到洗脫的繼續(xù)。這大概是由于對在吸附至未涂覆的表面的情形中松散地保留在外層中的乳鏈菌肽更大的溶劑可及性，而整合至PEO“刷”中的乳鏈菌肽將表現(xiàn)出更大的洗脫抗性。實施例5乳鏈菌肽關(guān)于涂覆在硅烷化玻璃表面上的PLURONICF108(共價的或非共價附著)的吸附和洗脫PLURONICF108三嵌段作為與硅石表面的疏水締合而涂覆，并且在不同組的硅石表面上，通過經(jīng)由PPO鏈的共價附著而涂覆F108三嵌段。出于這一目的，將硅石樣品用十八烷基三甲氧基硅烷進行硅烷化，表面-聚合物共價附著由UV輻射誘導(dǎo)。橢圓對稱法如實施例4所述那樣進行，以獲得乳鏈菌肽在通過疏水締合和通過共價附著用F108涂覆的疏水表面上的吸附和洗脫動力學(xué)。如圖7所示，在每種表面上，乳鏈菌肽吸附和洗脫動力學(xué)非常相似，這表明通過PPO嵌段和硅烷化表面之間的疏水締合制備的F108層以基本上與通過PPO嵌段和硅烷化表面之間的共價附著制備的F108層相似的方式起作用。實施例6使用SATA制備硫醇化的乳鏈菌肽和活性測量使用SATA制備硫醇化的乳鏈菌肽N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)(皮爾斯生物技術(shù)(PierceBiotechnology)，羅克福德，伊利諾斯州)用來在乳鏈菌肽的η-端結(jié)合保護的巰基。按下述進行典型的硫醇化。制備在三氟乙酸(TFA)中含有l(wèi)Omg/mL的乳鏈菌肽溶液。通過加入含有乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀緩沖液升高乳鏈菌肽溶液的pH，以獲得在PH7.0，IOmMEDTA的20mM磷酸鉀緩沖液中0.5mg/mL乳鏈菌肽的最終組合物。在反應(yīng)前立即將SATA以需要的濃度如20mM溶解在二甲亞砜(DMSO)中。將SATA溶液的等分試樣與乳鏈菌肽溶液混合，以獲得所需要的SATA對于乳鏈菌肽的摩爾過量。在該實施例中，SATA對于乳鏈菌肽的摩爾過量在2.51-51之間變化。將反應(yīng)混合物包裝在鋁箔中，以避光，并且允許反應(yīng)在室溫下進行30分鐘。之后，通過透析或通過將反應(yīng)混合物通過脫鹽或凝膠過濾柱而去除過量的SATA。通常，填充SEPHADEXG-IO(MWC0800Da)的柱使用20mM磷酸鉀緩沖液的洗脫劑。收集和合并包含乳鏈菌肽的級分。然后，通過加入羥胺-HCl(0.5M羥胺-HCL(皮爾斯生物技術(shù)(PierceBiotechnology)),25mMEDTA，在磷酸緩沖液中，PH7.8)溶液而將修飾的乳鏈菌肽脫乙?；?。允許脫乙酰反應(yīng)在室溫下進行2小時。然后，通過將反應(yīng)混合物通過填充了SEPHADEXG-10的柱并用20mM磷酸鉀緩沖液洗脫硫醇化的乳鏈菌肽，而回收硫醇化的乳鏈菌肽。使用Ellman's測定法[16]確定使用SATA的乳鏈菌肽衍生程度。使用SATA、或其它包含N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯的交聯(lián)劑的硫醇化反應(yīng)將用蛋白上任何充分可用的伯胺進行。在乳鏈菌肽的情形中(參見上述圖1中的結(jié)構(gòu))，反應(yīng)可能在N端胺、Lys12,Lys22、和C端殘基Lys34發(fā)生。據(jù)信通過殘基12或22的硫醇化和最后與PEO的連接將形成無活性形式的乳鏈菌肽。結(jié)構(gòu)分析顯示，Lys34(以及Ile1)比殘基12和22更加溶劑可及和移動。在這一點上，如果允許賴氨酸進行硫醇化，我們將預(yù)計末端殘基比內(nèi)部殘基優(yōu)先硫醇化。如果通過Lys34索鏈化(tethered)，參考孔形成的桶-板模型，人們將預(yù)測無活性的形式，因為C端結(jié)構(gòu)域透入和通過脂雙層將受到損害。參考楔形模型，人們可以預(yù)測一些活性，因為親水PEO鏈將不必被“牽引”通過雙層的疏水核。在任何事件中，N端殘基的優(yōu)先硫醇化通過利用N端胺和賴氨酸上的胺的pKa的不同而實現(xiàn)。N端胺典型地具有6.8-8的pKa，而賴氨酸上的氨基基團的pKa約為11.1。在中性pH下，大部分賴氨酸將處于它們的電離形式，且因此不是反應(yīng)性的。當(dāng)PH增加時，賴氨酸將變得具有增加的反應(yīng)性，并且SATA試劑的水解將更快地發(fā)生。在這一點上，選擇較低的反應(yīng)pH、時間、和/或濃度將確保大部分反應(yīng)發(fā)生在N端結(jié)構(gòu)域。檢測所述硫醇化的乳鏈菌肽以及數(shù)種對照樣品的活性。對照包括在每個處理步驟結(jié)束時取出的乳鏈菌肽樣品[即，(i)在加入SATA/DMS0后溫育30分鐘；(ii)凝膠過濾；(iii)加入羥胺-HCl/pH7.8，然后溫育2小時和(iv)凝膠過濾)和用pH7.0的磷酸緩沖液稀釋至在最終凝膠過濾柱流出物中所預(yù)測的肽濃度]，和暴露于上述反應(yīng)條件但是不存在SATA的乳鏈菌肽樣品。硫醇化的乳鏈菌肽的活性測量使用革蘭氏陽性細菌戊糖片球菌FBB61-2(ATCC，Manassas，VA)作為指示菌株，通過瓊脂孔擴散測定，確定修飾的乳鏈菌肽的抗菌活性。按照供應(yīng)商的使用說明，通過高壓滅菌，滅菌IOml52.2g/l的deMan-Rogosa-Sharpe肉湯，MRS(EMD化學(xué)(EMDChemicals)，德國)溶液。解凍戊糖片球菌培養(yǎng)物儲液，且用無菌接種環(huán)將10μ1添加到高壓滅菌的MRS肉湯中。然后，將接種的肉湯在37°C溫育過夜，以形成約107CFU/ml的細胞計數(shù)。將粉末狀的瓊脂(Becton-Dickinson，Sparks，MD，美國)分散在52.2g/lMRS肉湯中，并且通過高壓滅菌液化。將其冷卻至40°C，并且用上述制備的片球菌過夜培養(yǎng)物接種，且倒在幾個培養(yǎng)皿(IOOmm直徑X15mm深度)上達到約5mm的深度，且允許固態(tài)化。使用木塞穿孔器在每個瓊脂平板上無菌鉆3個洞，且向每個孔中加入10μ1硫醇化的乳鏈菌肽溶液或?qū)φ杖芤?。在所有情形中，用磷酸緩沖液稀釋所述溶液，以在檢測的每份溶液中提供近似相等的乳鏈菌肽濃度。蓋上平板，且在37°C溫育24小時，并且測量在每個孔周圍的抑制圈的直徑。結(jié)果顯示在圖8中。具體地，圖8舉例說明與僅加入DMSO的“對照乳鏈菌肽”相比，SATA交聯(lián)對乳鏈菌肽抗菌活性的影響。在圖8中，⑴是指乳鏈菌肽+DMSO中的SATA(30分鐘反應(yīng))；(II)是指乳鏈菌肽+DMSO(30分鐘對照)；(III)是指乳鏈菌肽+SATA，通過SEPHADEX柱以去除SATA；(IV)是指乳鏈菌肽+DMS0，通過SEPHADEX柱；(V)是指乳鏈菌肽-SATA+羥胺-HCl(2小時反應(yīng))；(VI)是指乳鏈菌肽+緩沖液(2小時反應(yīng)，對照)；(VII)是指乳鏈菌肽-SH，通過SEPHADEX柱，以去除羥胺-HCl；和(VIII)是指乳鏈菌肽+DMSO，通過SEPHADEX柱。從圖8可以看出在用SATA處理后保留一些乳鏈菌肽活性是可能的。在脫乙酰步驟后觀察到最大的活性損失，然而，發(fā)現(xiàn)這在去除羥胺-HCl時是部分可逆的。實施例7#用SAT(PEO1)制各硫醇化的鏈菌flt和活件測丨量使用N-琥珀酰亞胺基S-乙?；?硫代四甘醇)酯(SAT(PEO4))(皮爾斯生物技術(shù)(PierceBiotechnology)，Rockford，Illinois)來在乳鏈菌肽的η端結(jié)合保護的硫醇。制備在三氟乙酸(TFA)中包含lOmg/mL的乳鏈菌肽溶液。通過加入含有乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀緩沖液升高乳鏈菌肽溶液的PH，以獲得在pH7.OUmMEDTA的20mM磷酸鉀緩沖液中2.0mg/mL乳鏈菌肽的最終組合物。在反應(yīng)前立即將SAT-PEO溶解在二甲亞砜(DMSO)中，以獲得250Mm的儲液。將SAT-PEO溶液的等分試樣與乳鏈菌肽溶液混合，以獲得所需要的SAT-PEO對于乳鏈菌肽的摩爾過量。在該實施例中，SAT-PEO對于乳鏈菌肽的摩爾過量在1.085-4.34之間變化。將反應(yīng)混合物包裝在鋁箔中，以避光，并且允許反應(yīng)在室溫下在旋轉(zhuǎn)搖動器上進行30分鐘。在反應(yīng)結(jié)束后，通過將反應(yīng)混合物通過填裝了SEPHADEXG-10(MWC0800Da)的凝膠過濾柱并用20mM磷酸鉀緩沖液洗脫而去除過量的SAT-PE0。收集并合并包含乳鏈菌肽的級分。然后，通過加入羥胺-HCl(0.5M羥胺-HCL(皮爾斯生物技術(shù)(PierceBiotechnology)),25mMEDTA，在磷酸緩沖液中，pH7.8)溶液而將修飾的乳鏈菌肽脫乙?；?。允許脫乙酰反應(yīng)在室溫下進行2小時。然后，通過將反應(yīng)混合物通過填充了SEPHADEXG-10的柱并用20mM磷酸鉀緩沖液洗脫硫醇化的乳鏈菌肽，而回收硫醇化的乳鏈菌肽。使用Ellman’s測定法[16]確定使用SAT-PEO的乳鏈菌肽衍生程度。測量硫醇化乳鏈菌肽的活性使用按上述實施例7中所述的瓊脂孔擴散測定法，測量用SAT-PEO硫醇化的乳鏈菌肽活性。在下述表1中顯示用1.085倍摩爾過量的SAT-PEO制備的乳鏈菌肽嵌段共聚物的三次試驗結(jié)果的總結(jié)，并且舉例說明可以衍生肽以結(jié)合巰基基團，同時保持合理的抗菌活性水平。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實施例8m車菌flt與末端某閉活化的ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0三嵌段物(共勿)的偶聯(lián)和活t牛測丨量m車菌flt與末端某閉活化的ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0三嵌段物(共勿)的偶聯(lián)按照Li等[15]的方法，衍生PLURONICF108(BASF)以結(jié)合末端吡啶基二硫化物基團。通常產(chǎn)生每F108分子具有1-1.2吡啶基二硫化物(“PDS”)基團的取代程度的末端基團活化的共聚物(EGAP-PDS)。F108是合適的起始材料，因為其(完全延伸的)ΡΕ0鏈約為60nm長。為了與膜相互作用，乳鏈菌肽必須通過敏感革蘭氏陽性細菌的細胞壁。細胞壁厚度隨細菌物種不同，但是平均來說，敏感葡萄球菌細胞壁為20-30nm厚。將300μL硫醇化的乳鏈菌肽溶液添加到包含100μ1溶解在ρΗ7.0的磷酸鉀緩沖液中的EGAP-PDS或F108的微量離心管中。在每種情形中的終濃度在三嵌段共聚物比所修飾的肽0.2倍至5倍摩爾過量的范圍內(nèi)。將該管用鋁箔包裝，并且在室溫下連續(xù)混合溫育過夜。通過按照供應(yīng)商的使用說明，使用具有10，000道爾頓的MWCO的Slide-A-Lyzer盒(皮爾斯生物技術(shù)(PierceBiotechnology))針對ρΗ7的磷酸緩沖液透析而去除未反應(yīng)的乳鏈菌肽。通過測量在反應(yīng)過程中釋放的PDS基團的濃度，而確定乳鏈菌肽和EGAP-PDS之間的偶聯(lián)程度。這通過在時間0(、)和在透析前反應(yīng)結(jié)束時(tf)，測量反應(yīng)混合物在343nm處的吸光度而實現(xiàn)。然后，利用在、和tf時的吸光度之間的差別來用8060M—1的消光系數(shù)計算PDS基團的濃度。針對上述這些的其余的對照，包括100μ1每種類型的三嵌段物(末端活化的和其它)溶液，其中加入300μ1磷酸緩沖液替代硫醇化的乳鏈菌肽溶液。制備這些來觀察三嵌段物自身對細菌生長的影響。圖9顯示乳鏈菌肽與嵌段共聚物的連接，如本文所教導(dǎo)那樣。測量共聚物_乳鏈菌肽構(gòu)津體的活件在細菌中鑒定脂質(zhì)II為乳鏈菌肽的特異性靶標(biāo)，如上文所解釋，已經(jīng)能夠呈現(xiàn)出乳鏈菌肽中結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的更清楚的描繪。已經(jīng)表明乳鏈菌肽通過三種不同的機制殺死細菌。在功效次序上，它們是(i)結(jié)合脂質(zhì)II，并且隨后形成孔；(ii)在不存在孔形成的條件下，結(jié)合脂質(zhì)II，和(iii)在不存在脂質(zhì)II的條件下，不依賴于靶標(biāo)的孔形成。對于每種機制，已經(jīng)鑒定了肽的特異性結(jié)構(gòu)和功能特征。一種分子中的殺死機制(i)和(ii)的組合強化了抗微生物活性，并且導(dǎo)致納摩爾范圍內(nèi)的最小抑制濃度。盡管不受該理論的限制，據(jù)信所述化合物和方法包括通過與N端異亮氨酸的伯胺的連接，確保乳鏈菌肽以“端點”方向固定至柔軟的PEO鏈。(關(guān)于乳鏈菌肽的結(jié)構(gòu)參見圖1)以這種方式，N端結(jié)構(gòu)域與脂質(zhì)II的結(jié)合應(yīng)該不受影響，鉸鏈區(qū)的柔性也應(yīng)該不受影響。圖10提議以這種方式索鏈化的乳鏈菌肽形成的脂質(zhì)II-介導(dǎo)的孔的示意圖。具體地，在圖10中，對于脂質(zhì)II結(jié)合(左)和孔形成(右)，乳鏈菌肽相對于膜和相對于脂質(zhì)II的取向，如Wiedemann等[17]^PvanHeusdan[18]所述。在圖10中，乳鏈菌肽首先通過其N端結(jié)構(gòu)域結(jié)合脂質(zhì)II的碳水化合物結(jié)構(gòu)部分。然后，假定乳鏈菌肽的C端部分在某種程度上穿過膜易位。對于這一步驟，環(huán)簇之間的柔性的鉸鏈區(qū)是重要的。在圖10中，N-乙?；奶荊IcNAc和MurNAc分別顯示為六元環(huán)標(biāo)記的G和M。附著到MurNAc上的五肽的氨基酸顯示為5個圓圈。圓圈標(biāo)記的Pi表示為脂質(zhì)II中連接糖-肽基團和疏水尾部的磷酸結(jié)構(gòu)部分。在圖10中，乳鏈菌肽由其官能重要結(jié)構(gòu)域表示大橢圓表示N端結(jié)構(gòu)域和小橢圓表示C端結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域通過短的鉸鏈區(qū)連接。在圖10中還顯示在環(huán)A之前(N端，標(biāo)記為N)和在環(huán)E之后(C端，標(biāo)記為C)的短線性肽序列。假定裝配一些乳鏈菌肽_脂質(zhì)II復(fù)合物用于功能性的孔，由此解釋羧基熒光素、氨基酸、ATP尺寸的分子從脂質(zhì)體和活細胞的快速流出，但是準(zhǔn)確的數(shù)目目前是未知的。在任何事件中，在界面環(huán)境中索鏈化的乳鏈菌肽的濃度是高的。因此，據(jù)信膜將表現(xiàn)出高水平的活性，并且同時克服與通過直接吸附進行的膜形成/負載相關(guān)的局限性。使用細菌培養(yǎng)物懸浮測定法，而不是瓊脂孔擴散測定法，檢測共聚物_乳鏈菌肽構(gòu)建體的活性，因為相對于乳鏈菌肽，所述構(gòu)建體的尺寸和結(jié)構(gòu)將妨礙它們在固體瓊脂培養(yǎng)基中的擴散率。預(yù)計二硫化物交換反應(yīng)隨著時間在體內(nèi)緩慢發(fā)生。這可能導(dǎo)致一些延長的乳鏈菌肽從EGAP的釋放。考慮到這種潛在的釋放機制，在通過DTT還原后，還檢測共聚物乳鏈菌肽構(gòu)建體的活性。按實施例6所述制備片球菌的過夜培養(yǎng)物，并且在無菌MRS肉湯中稀釋100-倍，以提供約9X105CFU/ml的細胞計數(shù)。將900μL這種稀釋的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到15ml聚丙烯管中。然后，向該管中加入IOOyL共聚物(末端活化的或其它)溶液，其已經(jīng)與硫醇化的乳鏈菌肽反應(yīng)或與磷酸緩沖液組合，并且將所有這些管在恒定的攪動下在37°C溫育4小時。還以這種方式檢測硫醇化的乳鏈菌肽溶液，和不含共聚物、不含乳鏈菌肽的磷酸緩沖液。在溫育時間結(jié)束時，在600nm處確定每份培養(yǎng)物的細胞密度。在圖11中顯示關(guān)于用SAT(PEO4)硫醇化的乳鏈菌肽制備的EGAP-乳鏈菌肽構(gòu)建體的結(jié)果。具體地，圖11顯示EGAP-乳鏈菌肽共聚物和對照的抗菌活性的結(jié)果。特別地，圖12顯示在DTT處理后包含嵌段共聚物的乳鏈菌肽和對照的抗菌活性結(jié)果。對于圖11和12，將1.085摩爾過量的SAT(PEO4)用于乳鏈菌肽硫醇化反應(yīng)，且將對于乳鏈菌肽-SH5摩爾過量的EGAP用于制備所述構(gòu)建體。備選的連接策略，可能包括蛋白工程技術(shù)，可以用來制備索鏈化的羊毛硫抗生素。例如，在分子中徹底結(jié)合半胱氨酸殘基將排除在使用本文所述的EGAP-PDS連接PEO之前對化學(xué)修飾的需要。這可能是有問題的，因為羊毛硫抗生素前體肽中的半胱氨酸殘基提供在翻譯后修飾過程中參與形成硫醚連接的巰基基團，但是這僅是蛋白工程引起的許多解決方案中的一種。使用羊毛硫抗生素的蛋白工程比用于酶和結(jié)構(gòu)蛋白的蛋白工程仍然復(fù)雜一些，因為表達系統(tǒng)必須不僅包括結(jié)構(gòu)基因，還包括編碼生物合成酶、免疫性蛋白和調(diào)控蛋白的基因[80]。另外，在多種情形中，對于生產(chǎn)和分泌有任何活性的羊毛硫抗生素需要特定殘基的正確的翻譯后修飾。然而，已經(jīng)制備了相對于野生型具有相似的、減少的和甚至增加活性的多種定向位點乳鏈菌肽突變體，并且這樣的方法可能最終歸因于最佳適于在界面應(yīng)用的羊毛硫抗生素的合理設(shè)計。本發(fā)明可以以其它具體形式實施，而不背離其結(jié)構(gòu)、方法、或在本文廣泛所述和下文要求的其它基本特征。所述的實施方案僅被視為是示例性的，并不是限制性的。因此，本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求而不是前述描述指明。在它們的范圍內(nèi)包括在權(quán)利要求的含義和等價范圍之內(nèi)的所有改變。實施例9祥酉旨卜.白句·車麵禾口城劇_&_丨纖_應(yīng)牛測量將醫(yī)學(xué)裝置級PU管，80ShoreΑ,(科學(xué)日用品公司(ScientificCommoditiesInc.)，LakeHavasuCity,AZ)切割成Icm長，用99%異丙醇洗滌30分鐘，然后用無菌DI水漂洗一次5分鐘。樣品用已經(jīng)進行無菌過濾的水、1%F108或1%EGAP-NTA溫育過夜。然后，將進一步要用乳鏈菌肽處理的樣品用PH6.O的磷酸緩沖液漂洗3次。其余樣品用PBS(20mMPB,150mMNaCl，pH7.4)漂洗3次。將乳鏈菌肽溶液(在0.OlMPB，pH6.O中0.5mg/mL)添加到適當(dāng)?shù)臉悠分校⑶覝赜^夜。然后，將這些樣品用PBS漂洗3次。制備如實施例1所示的標(biāo)準(zhǔn)細菌溶液，并且加入到在1.5mL聚苯乙烯管中的樣品。將細菌培養(yǎng)物與樣品在37°C溫育24小時。樣品用PBS洗滌三次，然后置于新的無菌1.5mL聚苯乙烯管中。加入MRS肉湯，并且將樣品超聲處理5分鐘。超聲處理后，將110和1100稀釋的每份樣品的100μ1等分試樣劃線到各自的瓊脂平板上。48小時的生長期間后，計數(shù)在每個瓊脂平板上形成的菌落數(shù)目。結(jié)果圖13Α顯示在所有涂覆了乳鏈菌肽的表面上對細菌的明顯抑制，和在乳鏈菌肽用F108且進一步用EGAP-NTA涂覆時增加效力的傾向，如圖13Β所示。具體地，圖13a舉例說明在存在MRS肉湯的條件下24小時，在涂覆和未涂覆的PU管上細菌黏附的結(jié)果。圖13B舉例說明在涂覆了乳鏈菌肽和乳鏈菌肽與共聚物組合的聚氨基甲酸酯表面上的細菌黏附之間的比較。在存在MRS肉湯的條件下3天后，使用PU管獲得關(guān)于細菌黏附的類似的鼓舞性結(jié)果(圖14)。實施例10在存在血液g白的K牛下，在聚氨,基甲！!酉旨導(dǎo)If表gilg丨肩車Iffl太的穩(wěn)定j牛禾卯舌個牛通過在一次性測試管中，用在IOmM磷酸緩沖液中的F108(5mg/mL)溫育24小時，涂覆聚氨基甲酸酯導(dǎo)管片段(22GA，1.0在I.V.導(dǎo)管中，REF381423，BectonDickinson)。然后，將它們用多個測試管體積的磷酸緩沖液漂洗，以去除未結(jié)合的F108。將F108-涂覆的和裸露的片段在室溫下在0.5mg/mL乳鏈菌肽中溫育1小時。1小時后，用多個測試管體積的過濾的IOmM磷酸鈉緩沖液漂洗導(dǎo)管片段，以去除未結(jié)合的乳鏈菌肽。然后，將乳鏈菌肽處理的導(dǎo)管片段在25%馬血清或IOmM磷酸緩沖液中溫育需要的時間階段。然后，用大量磷酸緩沖液漂洗乳鏈菌肽-處理的片段，在每種情形中通過注射器施用至內(nèi)腔。乳鏈菌肽敏感的戊糖片球菌(如實施例3所述培育)用來接種MRS瓊脂培養(yǎng)皿。將漂洗的導(dǎo)管片段插入到接種戊糖片球菌的平板上，用于抗菌活性的瓊脂擴散測定。將平板在37°C溫育48小時，并且測量殺傷區(qū)的面積，以提供乳鏈菌肽活性的指示。結(jié)果顯示在圖15中。當(dāng)用血液蛋白(25%馬血清)刺激導(dǎo)管片段時，在F108-涂覆的和裸露的表面組之間，尤其是隨著溫育時間的增加，觀察到更大的差異。這些結(jié)果支持這樣的觀點，即，F(xiàn)108涂層的懸垂PEO鏈抑制血液蛋白對乳鏈菌肽的交換。實施例11利用輻射穩(wěn)定聚氨某甲酸酯表面h^PLURONICElM評估了兩種類型的輻射，e-束和UV。通過用SDS溶液徹底洗滌然后進行蛋白吸附測定而評估持久性，其中共聚物的保留由減少的蛋白吸附證實。圖16包含顯示輻射對PLURONICF108涂層穩(wěn)定性的影響的結(jié)果。圖16所示的結(jié)果表明，在某些條件下，通過應(yīng)用輻射在PU上穩(wěn)定未修飾的共聚物或EGAP是可行的。實施例12PEO鏈在乳鏈菌肽的吸附和洗脫中的作用可以通過參考“歷史依賴性”吸附機制[21，22]分析乳鏈菌肽吸附-洗脫數(shù)據(jù)而進一步揭示PEO鏈在吸附和洗脫中的作用。由于在界面上不平衡結(jié)構(gòu)的緩慢松弛，許多大分子部分，包括蛋白，表現(xiàn)出歷史依賴性吸附行為。即，對于在給定表面負載的給定的蛋白，吸附速率依賴于吸附層的形成歷史。當(dāng)?shù)鞍?蛋白相互作用可能影響適于吸附的表面積的可用性時，在單層表面覆層附近，這是特別相關(guān)的。Tie等[22]使用光波導(dǎo)發(fā)光模式光譜法以多步驟模式研究了纖連蛋白、細胞色素c和溶菌酶的吸附，其中吸附表面?zhèn)溥x地暴露于蛋白溶液和不含蛋白的溶液。通常，他們觀察到，在第二步中的初始吸附速率超過在第一步驟在相同表面覆層觀察到的初始吸附速率。他們假定，對于界面上給定的質(zhì)量密度，如果蛋白以“簇”或聚集體排列，相對于隨機分布的蛋白，更“清空的(cleared)”表面積將可用于進一步的吸附。在另一方面，如果吸附的蛋白膜處于平衡，由于蛋白將具有相同的結(jié)構(gòu)特征，我們將在每個周期中預(yù)測到相同的吸附速率。因此，吸附速率數(shù)據(jù)可以提供與吸附層結(jié)構(gòu)相關(guān)的重要信息[21，22]，并且出于該目的，我們利用圖17所示的順序吸附動力學(xué)數(shù)據(jù)種類。圖17顯示在裸露的疏水表面和F108-涂覆的表面順序進行的兩個乳鏈菌肽吸附-洗脫步驟的結(jié)果。對于每種表面，將第二吸附步驟的初始斜率與具有相同初始質(zhì)量密度的第一吸附周期這一點的斜率進行比較。在涂覆和未涂覆的表面，在第二步中的初始吸附速率超過在第一步中在相同表面覆層觀察到的初始吸附速率。但是，當(dāng)與F108-涂覆的硅石比較時，在未涂覆的硅石的情形中，斜率的增加是明顯的。即，對于F108-涂覆的表面，第一和第二步吸附速率沒有不同，這表明在該情形中發(fā)生較少的乳鏈菌肽吸附后重排(或較少的“簇集”)。我們認為PEO鏈抑制了形成簇和未占據(jù)的表面積的產(chǎn)生所需要的橫向移動性。在未涂覆的和F108-涂覆的表面的乳鏈菌肽吸附和洗脫動力學(xué)的比較(圖6，7，和17)表明，乳鏈菌肽吸附和洗脫速率，以及其在界面的橫向移動性，通常在未涂覆的表面上更大。這將與PEO刷層內(nèi)的乳鏈菌肽吸附或“包埋”一致，與以非穿透模式與PEO鏈吸附相反。實施例13PEO鏈對乳鏈菌肽結(jié)構(gòu)特征的影響將通過用六甲基二硅氮烷硅(產(chǎn)品R816，190m7g，10-12nm直徑)烷化而變得疏水的硅石納米顆粒通過懸浮在旋轉(zhuǎn)器上的磷酸緩沖液中過夜而涂覆F108?；诠烙嫗?.3mg/m2的特定F108涂層密度[5]，選擇用于該目的的F108的量(1.35mg/mL)，以足以覆蓋所述納米顆粒在混懸液中展現(xiàn)的表面積。然后，將F108-涂覆的和裸露的疏水硅石納米顆粒用乳鏈菌肽(0.5mg/mL)在室溫下溫育需要的時間階段(4小時-1周)。選擇用于與乳鏈菌肽(2.19mg/mL納米顆粒)組合的納米顆粒的量比支持0.15μg/cm2的乳鏈菌肽涂層所需要的大1.25倍的表面積。允許乳鏈菌肽吸附發(fā)生2小時。0.15μg/cm2的乳鏈菌肽負載與單層吸附一致(基于乳鏈菌肽在溶液中的尺寸，在端點吸附的單層分子將導(dǎo)致約0.145μg/cm2的吸附質(zhì)量)，并且利用原位橢圓對稱法進行的早期工作表明，2小時將為該水平的吸附提供充足的時間。在JascoJ-720分光偏振計上，在25°C用0.2mm徑長和圓柱體小杯，在300_180nm之間記錄乳鏈菌肽_納米顆粒混懸液和對照樣品的CD光譜。在每種情形中，記錄六次掃描，并且平均，以增加信號-比-噪聲的比率。在每種情形中，與參照樣品一起記錄乳鏈菌肽_負載的納米顆?；鞈乙汉蛯φ盏腃D光譜(納米顆粒+緩沖液，納米顆粒+F108+緩沖液，F(xiàn)108+緩沖液，和僅有緩沖液)，以減去背景信號，并且確保僅測量乳鏈菌肽的結(jié)構(gòu)特征。圖18顯示在包含選定濃度的F108或聚乙二醇(PEG)的(不含納米顆粒)的溶液中溫育2小時和1周的乳鏈菌肽⑶光譜。選擇PEG(MW6000)的分子量，來近似F108三嵌段物中的單個PEO鏈的分子量(MW約5700)。如圖6中所示，在所有組中乳鏈菌肽的光譜非常相似，這暗示F108和PEG都對乳鏈菌肽構(gòu)象沒有任何影響。另外，這些光譜沒有提供關(guān)于乳鏈菌肽在溶液中溫育2小時或1周的結(jié)構(gòu)變化的證據(jù)。圖19顯示與疏水硅石顆粒懸浮在磷酸鈉緩沖液(pH7)中的乳鏈菌肽在25°C溫育4小時(圖19a)和1周(圖19b)后的⑶光譜。在4小時后與納米顆粒接觸時，在190-215nm之間橢圓率的上移是明顯的。然而，與未涂覆的顆粒樣品相比較，在具有F108-涂覆的納米顆粒的混懸液中記錄的乳鏈菌肽光譜保持與在不存在顆粒的條件下關(guān)于乳鏈菌肽記錄的光譜更相似。在與納米顆粒接觸1周后，在190-215nm之間的橢圓率的更多的上移是明顯的。然而，此外，在具有F108-涂覆的納米顆粒的混懸液中記錄的乳鏈菌肽光譜比在具有未涂覆的納米顆粒的混懸液中關(guān)于乳鏈菌肽記錄的那些改變得少得多。圖19b還顯示在220nm以外，對于F108-涂覆的納米顆?；鞈乙汉筒缓w粒的溶液，乳鏈菌肽光譜保持充分地相似，而對于未涂覆的納米顆粒記錄的光光譜與該區(qū)域中的另外兩種樣品不同。這些結(jié)果表明，與在具有F108-涂覆的表面的混懸液中相比，在具有未涂覆的、疏水硅石的混懸液中，乳鏈菌肽經(jīng)歷更多的結(jié)構(gòu)改變。圖20顯示增加的表面積對與未涂敷的(圖20a)和F108-涂敷的硅石納米顆粒(圖20b)懸浮的乳鏈菌肽在溫育4小時后的CD光譜的影響。顆粒表面積的增加將為乳鏈菌肽結(jié)構(gòu)改變提供更多的機會，如果在上述使用的顆粒濃度下，一些乳鏈菌肽保持未結(jié)合或另外沒有緊密與界面締合(例如，停留在彌散的外層)。圖20顯示在每種情形中，當(dāng)與5_倍增加的顆粒表面積接觸時，在190-215nm之間橢圓率的上移是明顯的。圖20還顯示，當(dāng)未涂覆的顆粒表面積5-倍增加時，215nm之外的乳鏈菌肽光譜繼續(xù)偏離在較小的表面積記錄的乳鏈菌肽光譜，而具有大量和少量F108-涂覆的顆粒的乳鏈菌肽混懸液在215nm之外表現(xiàn)出充分相似的光譜。與圖19所示的溫育時間影響相似，這些結(jié)果表明，相對于在(不含顆粒的)溶液中記錄的乳鏈菌肽光譜，在具有F108-涂覆的納米顆粒的混懸液中記錄的乳鏈菌肽光譜比在具有未涂覆的納米顆粒的混懸液中關(guān)于乳鏈菌肽記錄的那些保持少得多的改變。這些結(jié)果表明，與吸附至先前涂覆了F108的相同顆粒時相比，當(dāng)吸附至裸露的疏水顆粒時，乳鏈菌肽經(jīng)歷更多的結(jié)構(gòu)改變。參考文獻[1]J.N.Hansen,Nisinasamodelfoodpreservative(乳鏈菌肽作為食品防腐模型).CritRevFoodSciNutr(食品科學(xué)和營養(yǎng)學(xué)的評論)34(1994)69-93.[2]J.Andersson,R.Larsson,R.Richter,K.N.Ekdahl,禾口B.Nilsson,Bindingofamodelregulatorofcomplementactivation(RCA)toabiomaterialsurfacesurface-boundfactorHinhibitscomplementactivation(補體活化的模式調(diào)控齊[J(RCA)與生物材料表面的結(jié)合表面結(jié)合的因子H抑制補體活化).Biomaterials(生物材料)22(2001)2435-43.[3]J.H.Lee,J.Kopecek,禾口J.D.Andrade,Protein-resistantsurfacespreparedbyPEO-containingblockcopolymersurfactants(由含有PEO的嵌段共聚物表面活性齊[J制備蛋白抗性表面).JBiomedMaterRes(生物醫(yī)學(xué)材料研究雜志)23(1989)351-68.[4]J.T.Li,J.Carlsson,S.-C.Huang,禾口K.D.Caldwel1，Adsorptionofpoly(ethyleneoxide)-containingblockcopolymersaroutetoproteinresistencd包含聚(環(huán)氧乙烷)的嵌段共聚物的吸附一種蛋白抗性途^:J.Ε.Glass,(IS)jHydrophillicPolymers()Φ.Performancewithenvironmentalacceptability(環(huán)境可接受性的成績)，AmericanChemicalSociety(美國化學(xué)學(xué)會)，Washington,D.C.，1996，第61-78頁.[5]J.T.Li,禾口K.D.Caldwell,PlasmaproteininteractionswithPLURONIC-treatedcolloids(血漿蛋白與PLURONIC-處理的膠體的相互作用).ColloidsandSurfacesB:Biointerfaces(膠體和表面B生物界面)7(1996)9-22.[6]T.McPherson,K.Park,禾口S.Jo，Graftingofbiocompatiblehydrophilicpolymersontoin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成抗微生物涂層的方法，所述方法包括下列步驟形成包括嵌段聚合物顆粒的涂層，所述嵌段共聚物包括抗微生物成分；和將所述基底暴露于所涂覆的嵌段聚合物的氛圍中一段時間，以在所述基底上形成涂層。13.用權(quán)利要求7的組合物涂覆的食品產(chǎn)品。14.用權(quán)利要求7的組合物涂覆的醫(yī)學(xué)裝置。15.在基底上形成抗微生物涂層的方法，所述方法包括下列步驟將所述基底暴露于包括嵌段聚合物的溶液一段時間，所述時間足以用所述共聚物涂覆所述基底；和將所涂覆的基底暴露于包含抗微生物肽的溶液，以致一些抗微生物成分共價附著到所述共聚物上，并且一些包埋在所述共聚物中。16.權(quán)利要求12的方法，其中將所述基底暴露于嵌段共聚物的容器中通過將所述基底浸漬在包含所述嵌段共聚物的溶液中而發(fā)生。17.權(quán)利要求12的方法，其中將所涂覆的基底暴露于抗微生物肽的容器中通過將所涂覆的基底浸漬在包含所述抗微生物肽的溶液中而發(fā)生。全文摘要本發(fā)明是基于這樣的認識，即，通過以形成柔性的索鏈(tether)和/或包埋肽的方式，連接肽與嵌段聚合物，如PLURONICF108或末端基團活化的聚合物(EGAP)，可以使已知的抗微生物化合物如乳鏈菌肽或其它羊毛硫抗生素形成持續(xù)長久的抗微生物表面涂層。所包埋的肽通過從包埋物早期釋放而提供抗微生物作用，而索鏈化的肽提供持續(xù)更長久的抗微生物保護作用。使用包含嵌段共聚物的所述抗微生物肽可以制備抗微生物凝膠和泡沫劑。文檔編號A61L2/16GK101801180SQ200880107262公開日2010年8月11日申請日期2008年7月11日優(yōu)先權(quán)日2007年7月16日發(fā)明者普拉納夫·R·喬希,珍妮弗·A·內(nèi)夫,約瑟夫·麥奎爾申請人:艾爾維奧血管公司;由高校董事會代表俄勒岡州立大學(xué),通過俄勒岡州立大學(xué)代表的俄勒岡州政府