專利名稱：包含變體微生物蛋白酶的組合物和方法
包含變體微生物蛋白酶的組合物和方法發(fā)明領域本發(fā)明提供了蛋白質工程化的方法和變體蛋白酶。特別地，本發(fā)明提供了利用位 點評估文庫的方法。本發(fā)明還提供了用于多種用途的枯草桿菌蛋白酶變體。
背景技術：
絲氨酸蛋白酶是糖基水解酶的亞類，包含具有寬范圍的特異性和生物學功能的不 同類別的酶。對枯草桿菌蛋白酶已經進行了大量研究，主要是出于其在清潔和飼料應用中 的用途。其他工作則著眼于在各種應用中可以負面影響這些酶的功能的不良環(huán)境條件(例 如，暴露于氧化劑、螯合劑、極端的溫度和/或PH)。盡管如此，本領域仍然需要這樣的酶系 統(tǒng)，所述酶系統(tǒng)能夠抵抗這些不良條件，并保留或具有提高的本領域目前已知的活性。多種蛋白質工程化方法是已知的。通常，修飾蛋白質以得到希望的蛋白質性質。 在多數方法中，將克隆的編碼蛋白質的基因的核苷酸序列突變并表達修飾基因以產生突變 體，對其篩選目的活性。通常，將突變體性質與野生型蛋白質的性質比較。歷史上，蛋白質設計方法接近等同于在所有蛋白質空間發(fā)現用于所希望的應用 一種最佳序列的問題。該問題是極端困難并且是“NP難度的”。在復雜性理論中，被定義 為P類的問題被認為是容易和有效的，對于它們的解決方法存在多項式-時間算法。NP 難度問題是這樣的問題，對于它們當前不知道有效的多項式時間算法，并且如果可以解 決任何NP難度問題，那么可以解決所有NP難度問題(見例如，Pierce and ffinfree, ProteinEngineer.，15 :779-782 [2002])。當前建立和篩選文庫的策略一般涉及在整個序列 隨機產生蛋白質序列多樣性或者在蛋白質內的確定位置以受控的隨機方式產生蛋白質序 列多樣性。這些文庫通常具有對于主要的目的性質為“消極”的許多成員，并且需要大量篩 選來發(fā)現相對少數的積極突變。通常，忽略消極突變，并僅僅得到積極成員的序列信息。飽和誘變(Estell et al.，in World Biotech Report 1984，vol. 2 :USA，Online Publications，London[1984]，181-187 頁；和 Wells et al.，Gene 34 :315-323[1985])是 可以用于搜索蛋白質空間以發(fā)現優(yōu)化蛋白質中一些性質的突變的一種技術。一些研究小組 已經開發(fā)了通過飽和誘變鑒定待改變位點的策略(Reetz et al.，Agnew. Chem. Int. Edn.， 44 :4192-4196 [2005] ；Kato et al.，J. Mol. Biol.，351 :683-692 [2005]；和 Sandberg et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. ,90 :8367-8371 [1993])，但是還沒有提出用于位點鑒定的一般 性系統(tǒng)。此外，因為多數蛋白質工程化方法產生了大量的氨基酸突變選擇，一般需要篩選 許多變體來產生希望的蛋白質性質。通常，不斷重復篩選來產生有益變體。從而，多數方法 是費事費時的。本領域不斷需要有效并且產生所希望的結果的蛋白質工程方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了蛋白質工程方法。特別地，本發(fā)明提供了利用位點評估文庫的方法。 具體地，本發(fā)明提供了利用對許多希望的性質所得的信息，以便理性并且有效設計將優(yōu)化 那些性質的文庫。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了設計對于至少兩種希望的性質改進的 文庫。
本發(fā)明提供了鑒定蛋白質氨基酸序列中在改進蛋白質的希望性質中相關的位置 的方法。在一些尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了確定哪些突變是所希望的以便產生 具有這些希望性質以及改進的性質的蛋白質的方法。在一些額外尤其優(yōu)選的實施方案中， 本發(fā)明提供了鑒定比野生型蛋白質具有特定百分數改善(例如，對于一種性質比野生型的 110%更好)的氨基酸位置和突變。在仍然進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了鑒定突 變的方法，所述突變提供了比野生型蛋白質至少一種改進許多的性質和至少一種額外的不 比野生型蛋白質顯著更差的性質(例如，一種性質比野生型的110%更好，然而另一種性質 不比野生型的90%更差)。在還進一步優(yōu)選的實施方案中，基于該信息構建了文庫。在一 些實施方案中，使用所有鑒定的突變構建文庫，而在一些其他實施方案中，使用所鑒定突變 的子集構建文庫。實際上，文庫不意在局限于任何具體的成員和/或突變類型。本發(fā)明提供了蛋白質工程化的方法，其包括步驟提供蛋白質變體文庫；在目的 測試中測試蛋白質變體文庫的至少一種目的性質；為所述至少一種目的性質鑒定值的范 圍；鑒定該值范圍內與目的測試中的有利結果相關的最小值；和提供具有高于所述至少一 種目的性質的范圍內最小值的至少一種突變的多種蛋白質變體，從而提供包含至少一個突 變的蛋白質變體文庫，并且其中該文庫富含在目的測試中具有有利結果的成員。在一些 實施方案中，有利的結果對應于大于在上面第一步中給出的測試中觀察到的最大值的約 50 %、約60 %、約70 %、約80 %、約90 %、或約95 %的值。在一些備選實施方案中，在本發(fā) 明的方法中使用一個以上的目的測試。在一些優(yōu)選實施方案中，蛋白質是酶。在一些尤其 優(yōu)選的實施方案中，所述酶選自蛋白酶、轉移酶、金屬蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纖維素酶、氧化 酶、角質酶和脂肪酶。本發(fā)明還提供了蛋白質工程化方法，包括步驟提供蛋白質變體文庫；在目的測 試中測試蛋白質變體文庫的至少兩種目的性質；為所述至少兩種目的性質鑒定值的范圍； 鑒定該值范圍內與目的測試中的有利結果相關的最小值；和提供高于所述至少兩種目的性 質的范圍的最小值的多種蛋白質變體，從而提供富含在目的測試中具有有利結果的成員的 蛋白質變體文庫。在一些優(yōu)選實施方案中，有利的結果對應于在上面第一步中給出的測試 中觀察到的最大值的約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、或約95%的值。在一些優(yōu) 選實施方案中，蛋白質是酶。在一些尤其優(yōu)選的實施方案中，所述酶選自蛋白酶、轉移酶、金 屬蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纖維素酶、氧化酶、角質酶和脂肪酶。本發(fā)明還提供了蛋白質工程化方法，包括步驟提供野生型蛋白質和野生型蛋白 質的蛋白質變體的文庫；在目的測試中測試蛋白質變體文庫和野生型蛋白質的至少一種目 的性質；鑒定所述至少一種目的性質的值范圍；鑒定與目的測試中有利結果相關的值范圍 中的最小值；鑒定與為野生型所得的結果相比具有有利結果的蛋白質變體，其中有利結果 是改進的目的性質；并提供高于所述至少一種目的性質范圍的最小值的多種蛋白質變體， 從而提供富含在目的測試中具有有利結果的成員的改進蛋白質變體的文庫。在一些優(yōu)選 實施方案中，所述方法還包括確定性能指數的步驟，其中通過將為每種改進的蛋白質變體 得到的值和為野生型蛋白質得到的值相除確定性能指數。在一些尤其優(yōu)選的實施方案中， 方法還包括鑒定改進的蛋白質變體的步驟，其中改進的蛋白質變體在目的測試中實現大于 1.1的性能指數值。在一些額外實施方案中，所述蛋白質是酶。在一些尤其優(yōu)選的實施方 案中，所述酶選自蛋白酶、轉移酶、金屬蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纖維素酶、氧化酶、角質酶和脂肪酶。在一些備選實施方案中，所述蛋白質選自抗體和生長因子。在額外優(yōu)選的實施方 案中，所述野生型蛋白質是選自蛋白酶、轉移酶、金屬蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纖維素酶、氧化 酶、角質酶和脂肪酶的成熟形式。在一些優(yōu)選實施方案中，目的性質選自電荷、洗滌性能、 硬表面清潔性能、溶解度、熱穩(wěn)定性、保存穩(wěn)定性、洗滌劑穩(wěn)定性、底物結合、酶抑制、表達水 平、反應速率和底物降解。在一些實施方案中，野生型蛋白質和蛋白質變體是至少一種洗滌 劑組合物的組分。在一些優(yōu)選實施方案中，在配制成具有5到12. 0的pH的粉狀或液體洗 滌劑的洗滌劑組合物中測試洗滌性能。本發(fā)明還提供了產生在蛋白質折疊內親本蛋白的改進變體的方法，包括在目的 測試中測定跨越目的性質范圍的蛋白質折疊內測試蛋白的多種變體；鑒定與目的測試中有 利結果有關的目的性質范圍內的最小值；在目的測試中測試蛋白質折疊的親本蛋白；并通 過在親本蛋白質中引入氨基酸突變產生親本蛋白的改進變體使得改進的變體高于目的性 質范圍的最小值。在一些優(yōu)選實施方案中，親本蛋白和測試蛋白是不同的。在一些實施方 案中，所述方法還包括確定性能指數的步驟，其中通過將為每種改進的蛋白質變體得到的 值和為親本蛋白質得到的值相除確定性能指數。在一些實施方案中，測試蛋白和親本蛋白 是酶。在一些尤其優(yōu)選的實施方案中，所述酶選自蛋白酶、轉移酶、金屬蛋白酶、酯酶、淀粉 酶、纖維素酶、氧化酶、角質酶和脂肪酶。在一些備選實施方案中，測試和親本蛋白質選自抗 體和生長因子。在額外優(yōu)選的實施方案中，所述親本蛋白質是選自蛋白酶、轉移酶、金屬蛋 白酶、酯酶、淀粉酶、纖維素酶、氧化酶、角質酶和脂肪酶的成熟形式。在一些優(yōu)選實施方案 中，目的性質選自電荷、洗滌性能、硬表面清潔性能、熱穩(wěn)定性、溶解度、保存穩(wěn)定性、洗滌劑 穩(wěn)定性、底物結合、酶抑制、表達水平、反應速率和底物降解。在一些實施方案中，測試蛋白 和親本蛋白是至少一種洗滌劑組合物的組分。在一些備選實施方案中，改進的蛋白質是洗 滌劑組合物的組分。在一些優(yōu)選實施方案中，在配制成具有約5到約12. 0的pH的粉狀或 液體洗滌劑的洗滌劑組合物中測試洗滌性能。本發(fā)明還提供了分離的芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶的枯草桿菌蛋白酶變體，其中枯 草桿菌蛋白酶變體是成熟形式，具有蛋白水解活性并且在選自以下位置的一個或多個位置 包含取代1,2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24， 25，26，27，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52， 53，54，55，56，57，58，59，60，62，65，66，67，71，72，73，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86， 87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，101，102，103，104，105，106，107，109，110， 111，112，113，114，115，116，117，118，119，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131， 132，133，134，135，136，137，139，141，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153， 156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176， 177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，194，195，196， 197，198，199，200，201，203，204，206，207，209，210，212，213，214，215，216，217，218，219， 220，222，223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241， 242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260， 261,262, 263，264，265，267,268, 269，270，271，272，273 和 274，其中所述位置通過與 SEQ ID NO 2給出的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列對應進行編號。在一些實 施方案中，所述一個或多個位置選自1，2，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，43，44，45，46，47， 48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，62，65，66，67，71，72，73，77，78，79，81，82， 83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，101，102，103，104，105，106， 107，109，110，111，112，113，114，115，116，118，119，122，123，124，125，126，127，128，129， 131，133，134，135，136，137，139，141，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153， 156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176， 177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，194，195，196， 197，198，199，200，201，203，204，206，207，212，213，214，215，216，217，218，219，220，222， 223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243， 244，245，246，247，248，249，250，251，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263， 264，265，267，268，269，270，271，272，273和 274，其中所述位置通過與 SEQ ID NO :2給出的 解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列對應進行編號。在一些其他實施方案 中，所述一個或多個位置選自2，3，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，19，20，21，21， 22，23，25，26，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，44，46，47，48，49，50，51，53，54， 55，56，57，58，59，60，62，65，66，67，71，73，77，78，79，81，82，83，84，85，86，88，89，90，91， 92，93，94，95，96，102，105，106，110，111，112，113，114，115，116，122，123，124，125，126， 128，129，131，133，134，135，136，137，139，141，143，145，146，147，148，149，150，151，152， 153，156，157，158，159，160，162，165，166，167，169，170，171，173，174，175，176，177，178， 179，180，181，182，183，184，186，187，189，190，191，192，194，195，196，197，198，199,200, 201，203，204，206，207，212，214，216，217，218，219，220，222，223，224，225，228，229，230， 231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，249，250， 251，253，254，255，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272， 273，和274，其中所述位置通過與SEQ ID NO :2給出的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶 BPN'的氨基酸序列對應進行編號。在一些實施方案中，所述枯草桿菌蛋白酶變體還包含選 自18，52，72，117，119，127，144，185，209和213的一個或多個位置上的取代，并且其中所述 位置通過與SEQ ID NO :2給出的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列對應進行編號。在-一些優(yōu)選實施方案中，所述取代包含如下的一個或多個位置:A001C,A001D,A001E,A001F,A001G,A001H,A001I,A001K,A001L,A001M,A001N,A001Q,A001R,A001S,A001V,A001W,Q002A,Q002D,Q002E,Q002G,Q002S,S003A,S003D,S003F,S003G,S003I,S003K,S003L,S003M,S003N,S003P,S003Q,S003R,S003T,S003V,S003W,S003Y,P005C,P005E,P005G,P005N,P005Q,P005T,Y006A,Y006C,Y006E,Y006F,Y006G,Y006K,Y006M,Y006N,Y006P,Y006Q,Y006R,Y006T,Y006V,Y006W,S009A,S009C,S009E,S009F,S009G,S009H,S009K,S009L,S009M,S009P,S009Q,S009R,S009T,S009V,S009W,Q010A,Q010C,Q010E,Q010F,Q010G,Q010H,Q010I,Q010K,Q010L,Q010M,Q010R,Q010S,Q010T,Q010V,Q010W,I011C,I011L,I011T,I011V,I011Y,K012A,K012C,K012D,K012E,K012F,K012G,K012H,K012I,K012N,K012Q,K012S,K012T,K012V,K012W,K012Y,A013C,A013F,A013G,A013H,A013L,A013R,A013S,A013T,A013V,P014A,P014C,P014D,P014E,P014F,P014G,P014I,P014K,P014L,P014M,P014N,P014Q,P014R,P014S,P014T,P014V,P014W,P014Y,A015C,A015D,A015E,A015F,A015G,A015H,A015I,A015K,A015L,A015M,A015P,A015Q,A015R, A015T, A015V, A015Y, L016A, L016C, L016I, L016M, L016Q, L016S, L016T, H017F, H017I, H017L, H017M, H017V, H017W, H017Y, S018A, S018E, S018F, S018G, S018H, S018I, S018K, S018L, S018M, S018N, S018P, S018Q, S018R, S018T, S018V, S018W, S018Y, Q019A, Q019C, Q019D, Q019E, Q019G, Q019I, Q019K, Q019M, Q019R, Q019T, Q019V, G020A, G020C, G020D, G020E, G020F, G020H, G020K, G020M, G020N, G020P, G020Q, G020R, G020S, G020W, Y021A, Y021C, Y021D, Y021E, Y021F, Y021G, Y021H, Y021K, Y021M, Y021R, Y021S, Y021T, Y021V, Y021W, T022A, T022C, T022E, T022F, T022G, T022H, T022I, T022K, T022L, T022M, T022N, T022Q, T022S, T022V, T022W, T022Y, S024C, S024F, S024G, S024H, S024I, S024K， S024L, S024M, S024N, S024Q, S024R, S024T, S024W, S024Y, N025C, N025E, N025F, N025G, N025H, N025I, N025K, N025L, N025M, N025P, N025R, N025S, N025T, N025V, N025W, K027A, K027D, K027E, K027F, K027G, K027H, K027L, K027M, K027P, K027R, K027S, K027W, K027Y, S033A, S033F, S033G, S033H, S033P, S033T, S033W, I035A, I035C, I035D, I035R, I035S, I035T,I035V,D036A,D036C,D036E,D036Q,D036S,D036W,S037A,S037C,S037E,S037F,S037G ，S037H, S037K, S037L, S037M, S037P, S037Q, S037R, S037T, S037W, H039C, H039Q, H039T, H039V, P040A, P040C, P040E, P040F, P040G, P040G, P040H, P040I, P040K, P040L，P040M, P040N, P040Q, P040R, P040S, P040T, P040V, P040W, D041E, L042I, L042M, L042V, K043A, K043C, K043D, K043E, K043F, K043G, K043I, K043L, K043M, K043N, K043R, K043S, K043T, K043V, K043W, K043Y, V044A, V044C, V044I, V044L, V044M, V044P, V044S, V044T, A045C, A045E, A045F, A045H, A045I, A045K, A045L, A045M, A045N, A045P, A045Q, A045S, A045T, A045V, A045Y, G046A, G046C, G046E, G046H, G046K, G046M, G046N, G046Q, G046T, G046W, G046Y, A048C, A048D, A048E, A048F, A048H, A048I, A048K, A048L, A048M, A048Q, A048R, A048S, A048T, A048V, A048W, A048Y, M050A, M050C, M050F, M050H, M050I, M050K, M050L, M050Q, M050R, M050S, M050T,M050V,M050W,M050Y,V051A,V051C,V051D,V051E,V051H,V051I ，V051L, V051P, V051Q, P052C, P052D, P052E, P052F, P052H, P052I, P052K, P052L, 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P225F, P225G, P225H, P225I, P225K, P225L, P225M, P225R, P225S, P225T, P225V, P225Y, A228P，A228R，A228S,A228T,A228W,G229A,G229H,G229I，G229S，A230C，A230E，A230G ，A230Q, A230R, A230S, A230T, A230V, A231C, A231I, A231P, A231R, I234A, I234C, I234L, I234M, I234N, I234P, I234Q, I234S, I234T, I234V, L235A, L235C, L235G, L235I，L235K, L235M, L235N, L235Q, L235R, L235S, L235T, L235V, L235W, L235Y, S236A, S236C, S236D, S236E, S236G, S236H, S236N, S236Q, S236T, S236V, S236Y, K237A, K237E，K237F, K237G,K237H,K237I,K237L,K237M,K237N,K237Q,K237R,K237S,K237T,K237V,K237W,K237Y,H238C,H238D,H238E,H238F,H238M,H238R,H238S,P239C,P239D,P239E,P239F,P239H,P239L,P239M,P239N,P239Q,P239R,P239S,P239T,P239V,P239W,P239Y,N240A,N240C,N240D,N240F,N240G,N240K,N240L,N240Q,N240R,N240S,N240T,N240V,N240W,N240Y,W241A,W241F,W241G,W241H,W241I,W241K,W241M,W241Q,W241T,W241V,T242A,T242C,T242E,T242F,T242G,T242K,T242M,T242N,T242P,T242R,T242S,T242W,T242Y,N243C,N243E,N243F,N243G,N243I,N243Q,N243S,N243T,N243V,N243W,N243Y,T244A,T244D,T244F,T244G,T244H,T244K,T244L,T244M,T244N,T244P,T244Q,T244R,T244S,T244V,T244W,T244Y,Q245A,Q245C,Q245D,Q245E,Q245H,Q245I,Q245K,Q245L,Q245M,Q245R,Q245T,Q245V,Q245Y,R247W,S248A,S248E,S248F,S248G,S248H,S248I,S248L,S248M,S248N,S248Q,S248R,S248T,S248V,S248W,S248Y,S249C,S249D,S249H,S249I,S249K,S249L,S249M,S249N,S249Q,S249R,S249T,S249V,S249W,S249Y,L250D,L250F,L250H,L250I,L250M,L250T,L250V,E251A,E251T,E251W,N252A,N252C,N252E,N252G,N252H,N252I,N252L,N252M,N252Q,N252R,N252S,N252T,N252V,N252Y,T253A,T253C,T253E,T253G,T253H,T253K,T253M,T253S,T253V,T254A,T254C,T254L,T254M,T254R,T254S,T254V,T255A,T255C,T255D,T255E,T255F,T255G,T255H,T255I,T255K,T255L,T255M,T255R,T255S,T255V,K256A,K256C,K256D,K256E,K256F,K256H,K256I,K256L,K256M,K256N,K256P,K256Q,K256R,K256S,K256T,K256V,K256W,K256Y,L257A,L257C,L257F,L257G,L257H,L257I,L257K,L257M,L257N,L257R,L257S,L257T,L257V,L257W,L257Y,G258Q,D259A,D259E,D259F,D259G,D259L,D259N,D259P,D259Q,D259R,D259S,D259T,D259V,D259W,D259Y,S260A,S260C,S260D,S260E,S260F,S260G,S260H,S260L,S260M,S260N,S260P,S260R,S260V,S260W,S260Y,F261H,F261W,Y262A,Y262C,Y262E,Y262F,Y262H,Y262L,Y262M,Y262N,Y263F,Y263M,Y263T,G264F,G264I,G264L,K265A,K265C,K265E,K265G,K265H,K265L,K265M,K265N,K265Q,K265R,K265S,K265W,K265Y,G266C,G266F,G266L,G266M,G266P,G266R,G266V,G266W,G266Y,L267A,L267C,L267E,L267G,L267H,L267I,L267M,L267N,L267Q,L267S,L267T,L267V,I268A,I268C,I268K,I268L,I268M,I268P,I268R,I268V,N269D,N269E,N269K,N269L,N269P,N269Q,N269S,Q271A,Q271C,Q271D,Q271E,Q271F,Q271G,Q271H,Q271I,Q271K,Q271L,Q271M,Q271N,Q271P,Q271R,Q271S,Q271T,Q271V,Q271W,Q271Y,A272E,A272F,A272G,A272H,A272K,A272L,A272M,A272N,A272Q,A272R,A272S,A272T,A272V,A272W,A272Y,A274C,A274D,A274F,A274G, A274H, A274I, A274K, A274L, A274Q, A274S, A274T，和 A274V。 在一些優(yōu)選實施方案中，所述取代包含選自Y021H-A045V-Y217E，Y02Iff-S10IE-G128R-Y217Q, Y021H-Y217E, YO21H-AO45V-S101 N-Y217Q ,Y021H-A045I-Y217E, Y021H-A045I-S101E-Y217Q, Y021W-A045I-S101E-Y217E, D036N-S101E-Y217L, YO21H-AO45V-Y217Q , YO2 1H-AO45 I-S 101E-Y217L， Y021H-A045I-Y217E, Y021H-Y217Q, Y021W-S101E-Y217L, Y021W-A045V-S101E-Y217L, Y021H-A045V-S101E-Y217E, S101E-Y217L, Y021H-A045V-S101E-Y217Q, Y021H-Y217L, Y021W-A045I-S101N-Y217L, S 101N-K213 I-Y217Q，YO21W-S101 N-Y217L , Y021H-S101E-Y217E, M119F-K213K-Y217Q, Y021W-A045V-Y217E, Y021W-A045I-Y217E, M119F-K213I-Y217Q, Y021W-Y217E-N212S, Ml19F-K213L-Y217E, K213I-Y217Q, A045I-Y217Q, YO21ff-AO45V-S101E-Y217Q , YO21H-AO45V-S101E-Y217L , SlOlS-Ml19F-K213I-Y217Q, K213N-Y217Q, M119F-Y217Q, S024H-A092G-A114G, S101N-M119F-K213I-Y217Q, S101N-K213L-Y217Q, SlOlN-Ml19F-K213K-Y217L, SlOlN-Ml19F-K213I-Y217L, Y021H-A045V-S101E, S101N-K213L-Y217E, A045V-Y217L, S101N-K213I-Y217L, SlOlS-Ml19M-K213K-Y217L, Y021H-Y217L, S101E-K213L-Y217L, K213I-Y217E, S 101N-M119F-Y217E，Y021W-A045V-Y217L, A092G-A114G, S024H-A092G-Q103E, Y021W-S101E, V26Q-K213I, Y021H-S101N, S101E-K213N-Y217E 的組合。在一些實施方案中，所述取代包含選自S024S-V028V-M050M-A092A-Q10 3E-A114G-V246V, S024S-V028V-M050V-A092A-Q 103Q-A114A-V246V, S024S-V028V -M050V-A092A-Q103Q-A114G-V246V， S024H-V028V-M050V-A092A-Q103Q-A114A-V2 46T, S024H-V028V-M050V-A092A-Q103E-A114A-V246V, S024H-V028V-M050V-A092A -Q103Q-A114G-V246V, S024H-V028V-M050M-A092A-Q103E-A114A-V246V, S024H-V 028V-M050M-A092A-Q103E-A114A-V246T, S024S-V028V-M050M-A092G-Q103Q-A114 A-V246T, S024H-V028V-M050M-A092A-Q103Q-A114G-V246T, SlOlE-Ml19N-K213N, S101N-K213I, S101N-M119H, Ml19H-K213I-Y217L, SlOlN-Ml19H-K213N-Y217L, S101N-K213L-Y217E, Ml19N-K213N-Y217L, Ml19F-K213L-Y217E, S101P-K213N, S101N-M119H-K213N, S10IN-Ml19F-K2131-Y217L, K213L, M119N-K213N, K213N, K213I-Y217E, SlOlN-Ml19H-Y217Q, S101P-K213N-Y217L, M119N-K213I, K213N-Y217Q, Ml 19H-K213N, S 1 0 1N-K213L-Y217Q，S101P-K213N, S 1 0 1 E_K213N-Y217E， SlOlE-Ml19H-K213I-Y217Q, S101E-M119H-K213N， K213I-Y217Q, S101N-K213I-Y217Q， M119H-Y217Q, SlOIN-MI19N-K213N-Y217Q，Ml19H-K213I-Y217Q，K213I-Y217Q， S101E-M119N-Y217L, M119F-K213L, Ml19H-K213N-Y217E, SlOlN-Ml19N-K213N-Y217Q, SlOlN-Ml19H-K213N-Y217Q, Ml19H-K213I-Y217Q， Y217Q, Ml19H-K213N-Y217Q， S101N-M119F-Y217E, M119F-Y217Q， SlOlN-Ml19F-K213I-Y217Q, S101N-K213I-Y217L， SlOlN-Ml19H-K213N-Y217L, S 101E-K213L-Y217L，S 101N_K213N-Y217Q， S101N-M119H-K213L, S101N-M119H-K213I， S101P-K213N-Y217L， Ml19F-K213I-Y217Q， S101N-K213I-Y217Q, SlOlE-Ml19H-K213I-Y217L, SlOlN-Ml19H-K213I-Y217Q, M119H-K213N-Y217E, S10IN-Ml19N-K213N-Y217L, A048E-K213L, A048H-K213L, V026Q-A048Y-K213L, K213N, V026N-K213L, V026N-K213L, V026Y-K213N, A048D-K213N, V026Q-A048E-K213L, A048H-K213N, V026Q-A048H-K213L, A048H-K213L, K213L, K213N, V147D-K213L, K213I, V026Q-A048E-K213N, V026N-A048E-K213N, A048E-K213L, VO26Y-A048E-K2 1 3 I, A048D-K213N, K213I, A048H-K213N,V147D-K213N, Y021H-A045V-S101E-Y217L, Y021H-Y217L, Y021H-A045V-S101E-Y217Q, Y021H-A045I-S101E-Y217L, Y021H-Y217Q, Y021H-A045V-Y217E, A045V-Y217L, Y021H-A045V-S101N-Y217Q, YO21W-S101 P-Y217L , YO21ff-AO45 I-Y217E , Y021H-A045V-S101E-Y217E, Y021H-A045I-S101E-Y217L, Y021H-A045I-S101E-Y217Q, Y021H-A045V-Y217E, Y021W-S101E-Y217L, S101E-Y217L, Y021H-A045V-Y217Q, Y021H-Y217E, Y021W-Y217E-(N0212S) , A045I-Y217Q, Y021H-A045V-Y217E, Y021W-A045V-S101E-Y217Q, Y021H-S101E-Y217E, Y021W-S101N-Y217L, S024S-V028V-M050M-A092A-Q103Q-A114A-V246T, Y021H-A045V-S101E, Y021W-A045V-S101E-Y217L, SlOlN-Ml19H-K213K-Y217Q, SlOlS-Ml19N-K213N-Y217Q, Y021H-A045V-S101P-Y217L, S024S-V028V-M050M-A092A-Q103Q-A114G-V246T, S10 1 S-Ml19F-K2131-Y217Q, SlOlS-Ml19M-K213K-Y217L, Y021H-A045I-S101E-Y217Q, Y021H-A045V-S101E-Y217E, Y021H-A045V-S101E, Y021H-Y217L, Y021H-A045I-Y217E, Y021W-A045I-S101E-Y217E, S101N-M119F-K213K-Y217L, SlOlE-Ml19H-K213N-Y217E, Y021H-A045I-Y217E, S101S-M119H-K213L-Y217L, Y021H-Y217E, S101S-M119F-K213K-Y217Q，禾P Y021H-A045I-S101E-Y217L的組合。在一些實施方案中，所述取代包含選自S0MS_ V028T-M050V-A092G-Q103E-A114G-V246T, S101N-M119H, M119N-K213N-Y217L, Y217L, M119N-K213N, K213N, K213N-Y217Q, S101E-K213N-Y217E, SlOlE-Ml19N-Y217L, Y217Q, SlOlN-Ml19N-K213N-Y217E, SlOlN-Ml19N-K213N-Y217L, Y021H-A045I-S101E-Y217L, S101E-Y217L, A045I-Y217Q，SlOlS-Ml 19M-K213K-Y217L, Y021H-A045I-S101E-Y217L 的組口 O本發(fā)明還提供了包括在實施例中提供的表中給出的變體，以及包含這些變體的組 合物。本發(fā)明還提供了分離的編碼枯草桿菌蛋白酶變體的核酸、包含所述核酸的表達載 體，和包含該表達載體的宿主細胞。此外，本發(fā)明提供了包含枯草桿菌蛋白酶變體的清潔組 合物。在一些實施方案中，清潔組合物是洗衣洗滌劑。在一些實施方案中，洗衣洗滌劑是冷 水洗滌劑、低PH洗滌劑或者濃縮洗滌劑。此外，本發(fā)明提供了生產芽孢桿菌枯草桿菌蛋白 酶的枯草桿菌蛋白酶變體的方法，包括用包含編碼枯草桿菌蛋白酶變體的核酸的表達載 體轉化宿主細胞；并在適于產生該枯草桿菌蛋白酶變體的條件下培養(yǎng)轉化的宿主細胞。在 一些實施方案中，所述方法還包括收獲產生的枯草桿菌蛋白酶變體的步驟。在一些實施方 案中，宿主細胞是芽孢桿菌物種，在這些實施方案的子集中，所述芽孢桿菌物種是枯草芽孢 桿菌。此外，本發(fā)明提供了清潔方法，包括將包含織物的表面和/或物品與包含分離的枯草 桿菌蛋白酶變體的清潔組合物接觸。此外，本發(fā)明提供了蛋白酶工程化方法，包括步驟a)提供多個位點評估文庫 (SEL)，每個文庫包含在蛋白酶的相同氨基酸位置具有不同取代的多個蛋白酶變體；b)在 目的性質測試中測試SEL的蛋白酶變體和標準蛋白酶；c)為該測試的蛋白酶變體的每一種 確定性能指數(PI) ；d)將兩個或多個氨基酸位置鑒定為非限制性位置；其中兩個SEL的每 一個中所述多種蛋白酶變體的至少一種具有大于0.5的PI ；和f)提供多突變文庫，其包含 許多多取代的蛋白酶變體，每種變體在兩個或更多非限制性位置包含取代。在一些實施方 案中，所述測試包括選自污漬去除測定(微樣品)、LAS穩(wěn)定性測定、洗滌劑穩(wěn)定性測定和比活性測定的兩種或多種不同的測定法。在一些實施方案中，蛋白酶選自細菌絲氨酸蛋白酶、 細菌枯草桿菌蛋白酶和細菌中性金屬蛋白酶。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了產生芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶的多取代 的枯草桿菌蛋白酶變體的方法，包括在第一種性質的第一種測試和第二種性質的第二種 測試中測試多種單取代的枯草桿菌蛋白酶變體，其中親本枯草桿菌蛋白酶的性質在每種測 試中被給予1.0的值，有利的第一種或第二種性質具有大于1. 0的值，并且過分不利的第一 種或第二種性質具有小于約0. 80的值或者在一些優(yōu)選實施方案中，小于約0. 60 ；鑒定至少 一種單取代的枯草桿菌蛋白酶變體中與有利的第一種性質相關并且不與過分不利的第二 種性質相關的取代；鑒定至少一種單取代的枯草桿菌蛋白酶變體中與有利的第二種性質相 關并且不與過分不利的第一種性質相關的取代；并將來自前面步驟的取代引入枯草桿菌蛋 白酶中以產生多取代的枯草桿菌蛋白酶變體。在一些實施方案中，方法還包括在第一種測 試和第二種測試中測試多取代的枯草桿菌蛋白酶變體，其中改進的枯草桿菌蛋白酶變體實 現在第一種和第二種中測試中均大于1. 0的值，或者在第一種測試中大于1. 0的值并且在 第二種測試中為0. 80到1. 0的值。在一些實施方案中，方法還包括產生改進的枯草桿菌蛋 白酶變體。在一些實施方案中，第一種和第二種性質負相關。在一些實施方案中，有利的第 一種或第二種性質具有大于約1. 2的值。在一些實施方案中，過分不利的第一種或第二種 性質具有小于約0. 40的值。在一些實施方案中，第一種性質是穩(wěn)定性，第二種性質是洗滌 性能。在這些性質的子集中，穩(wěn)定性包括洗滌劑中的穩(wěn)定性并且洗滌性能包括洗滌劑中的 血奶墨(BMI)洗滌性能。在一些實施方案中，親本細菌枯草桿菌蛋白酶是具有SEQ ID NO 2給出的氨基酸序列的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的野生型成熟形式。在其他實 施方案中，親本細菌枯草桿菌蛋白酶是遲緩芽孢桿菌(B. lentUS)GG36枯草桿菌蛋白酶的 野生型，具有SEQ ID NO :562給出的氨基酸序列，或者是BPN”，包含Y217L取代(SEQ IDNO 565)，單獨或者與其他修飾組合。在本發(fā)明的一些實施方案中，在具有5到12. 0的pH的粉 狀或者液體洗滌劑組合物中測試洗滌性能。所述步驟不意在局限于上面所列的確切順序， 因為任何合適的順序可用于本發(fā)明。然而，在一些優(yōu)選實施方案中，所述取代是在親本枯草 桿菌蛋白酶中具有大于約50%或大于約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置中。附圖
簡述圖IA 提供 了 pHPLT-VAAc 1 的圖，而圖 IB 提供 了 pHPLT-BPN，的圖。圖2A描述了北美洗衣洗滌劑中BPN，_Y217L CCL的BMI清潔性能作為電荷改變的 函數。類似地，圖2B描繪了在北美洗衣洗滌劑中GG36CCL的BMI清潔性能作為電荷改變的函數。圖3A描繪了西歐液體洗衣洗滌劑中BPN，_Y217L CCL的BMI清潔性能作為電荷改 變的函數。類似地，圖3B描繪了西歐液體洗衣洗滌劑中GG36CCL的BMI清潔性能作為電荷 改變的函數。圖4A描繪了日本粉狀洗衣洗滌劑中BPN，-Y217L CCL的BMI清潔性能作為電荷改 變的函數。類似地，圖4B描繪了日本粉狀洗衣洗滌劑中GG36 CCL的BMI清潔性能作為電 荷改變的函數。圖5A描繪了自動餐具洗滌劑中BPN’_Y217L CCL的烘焙蛋黃清潔性能作為電荷改 變的函數。類似地，圖5B描繪了自動餐具洗滌劑中GG36CCL的烘焙蛋黃清潔性能作為電荷改變的函數。圖6描繪了對于含有80種變體的文庫，LAS/EDTA穩(wěn)定性作為相對于親本 BPN，-Y217L的凈電荷改變的函數。發(fā)明描述本發(fā)明提供了蛋白質工程化方法。特別地，本發(fā)明提供了利用位點評估文庫的方法。為了實際目的，通常不必在蛋白質空間中發(fā)現最好的序列以便產生對于具體應用 為最優(yōu)的蛋白質。對于多數應用，待解決的問題是鑒定滿足或者超過許多性質所需的最小 值的至少一種蛋白質序列。這需要對于具體性質有益的突變的知識，以及對于任何希望的 性質有害的那些突變的知識。本發(fā)明通過鑒定蛋白質中可以被改變以改善主要性質和將對 于其他性質的值保持在希望的范圍內的那些位置，提供了滿足該目標的方法。本發(fā)明提供了通過在每個位點建立“文庫評估文庫”評估蛋白質中所有位置的所 有目的性質的方法。在優(yōu)選實施方案中，這些文庫在每個位置含有9-19個突變，并且用于 評估每個位置在工程化蛋白質和構建文庫中的用途。測量相對于親本酶的每種性質并且計 算每種突變體相對于野生型的表觀自由能差異。然后將這些delta delta G(即，Δ AG”) 表觀值用于確定可加性。一種分析變體的理想方法將是通過在目的過程中變體相對于親本蛋白的自由能 差異。過程的吉布斯自由能代表系統(tǒng)可以做功的最大量。相對于親本酶的自由能改變 (Δ AG)在如下給出Δ Δ G = -RT In (k 變體 /k 親本)其中是變體酶的速率常數，并且是親本酶的速率常數，R是氣體常數，T是 絕對溫度。多數測定法沒有被構建成允許測定真正的自由能，因此我們利用量Δ Δ Gapp = -RT In (P 變體 /P 親本)其中是變體的性能值，P1^是在相同條件下親本酶的性能值。可以預期 Δ △ Gapp值對于數據分布和可加性具有與Δ △ G相似的方式。然而，因為Δ Δ G是與親本酶 相比變體可以做功的最大量，所以量Δ AGapp將通常低估了 Δ AG并且導致似乎協同的結 果，因為兩個相加位置的性質可以大于通過將它們Δ AGapp值相加預測的值。本發(fā)明的方法用于設計有效文庫，該文庫用于平行地改造多個性質。盡管在本文 描述了一些酶，但是方法適用于任何用于工程化的目的蛋白質。通過在每個位置引入12到 19個取代，如本文所述的構建位點評估文庫(SEL)。使用活性和穩(wěn)定性測定法分析所得的 突變。將野生型氨基酸列為每個位置的參考點。對于每種性質，用測量結果確定親本蛋白 的Δ AGapp的平均值和標準差。將親本平均值(μ 歸一化為0，并確定Δ AGapp的標準 差(σ ^J。這些值用作分子的每個位置上每種性質的參考值。檢驗位點評估數據的性質 之間的相關性證據。將每種性質的△ AGapp值對每種其他性質作圖并計算相關系數。蛋白 質底物的兩種活性測量結果是相關的。為了分析氨基酸序列內的位置，定義了兩種類型的位點?！胺巧a性”位點沒有好 于親本酶的突變體，而“生產性”位點具有至少一個好于親本酶的取代。位點將是生產性 的概率通過生產性位點除以位點總數給出。盡管任一突變將好于親本酶的概率很低(即， 6% )，但是給定位點將具有至少一個向上突變(Up mutation)的概率相當高。
重要的是確定生產性和非生產性位點在結構特征(例如，埋藏的氨基酸、相互作 用的氨基酸、活性位點附近的位置，等等)方面在蛋白酶中是怎樣分布的，以及在進化中保 守的或者可改變的序列位點。為了做出該確定，檢查結構并將序列與非冗余同源物比對。如實施例中指出，任何性質的有害突變與每個其他性質的有害突變相關，不管性 質的相關性如何。僅僅少數位置(5-10%)具有對所有性質有害的突變。這些位置定義了 “折疊” (fold)并且在進化中保守。其含意是盡管對于任何性質，有益突變的鑒定需要該性 質的真實預測篩選，但是鑒定可能對任一性質有害的突變可以使用ANY篩選完成。一種簡 化的蛋白質工程化策略是建立SEL并使用簡單的活性和/或穩(wěn)定性篩選方法進行篩選。鑒 定有害突變并且具有很少有害突變的那些位置用于構建文庫和組合突變來改進多種性質。 而且，挑選在蛋白質表面上、有很少的相互作用并且在序列比對中可變的位點提供了高比 例的生產性位點。在分子內部、具有許多接觸并且在進化中強烈保守的位點具有有害突變 的概率很高并且應該避免。設想用于分析序列和/或結構信息的任何合適方法將可用于本 發(fā)明，包括但不限于計算機和/或電學方法和/或程序。方法提供了對于兩種性質的每一種具有大于5% Wt活性和小于5%活性的變體數 目的逐對比較，以及這兩種性質的相關系數。文庫設計在一些尤其優(yōu)選的實施方案中，位點評估文庫用于組合文庫設計。常規(guī)的定向進 化建立了隨機文庫并且為單一性質篩選大量文庫，將這些組合并重復該方法。如一些研 究人員已經發(fā)現(見例如，Bloom et al.，Curr. Opin. Struct. Biol.，15 :447-452[2005]； Bloom et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 :5869-5874 [2006]；禾口 Guo et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 :9205-9210 [2004])，一種性質的積極突變的積累通常導致其他性 質中的降低。任一突變對于任一性質將是向上的概率是小的，并且任一突變將是向下的概 率是高的(> 85% )，并且積累三個(3)以上增加活性的突變將導致一些其他性質的降低 的概率是相當高的。通過使用位點評估數據建立將對于多種性質有益的文庫避免了該問 題。在組合文庫中不包括非生產性位點，并且通過向上的突變百分比進一步對生產性位點 分類。清潔組合物本發(fā)明的清潔組合物有利地用于例如洗滌應用、硬表面清潔、自動洗碟應用，以及 美容應用，如義齒、牙齒、頭發(fā)和皮膚。然而，由于在較低溫度溶液中增加的有效性的獨特優(yōu) 點，本發(fā)明的酶理想地適于洗滌應用。此外，本發(fā)明的酶可用于粒狀和液體組合物中。本發(fā)明的變體蛋白酶也可以用于清潔添加劑產品中。在一些實施方案中，可用于 低溫溶液清潔應用。添加劑產品在其最簡單的形式中可以是一種或多種蛋白酶。在一些實 施方案中，將添加劑以劑型包裝用于加入清潔過程中。任何合適的單一劑型也可以用于本 發(fā)明，包括但不限于，丸劑、片劑、軟膠囊、或者其他單一劑量單位，如預先測量的粉劑或液 體。在一些實施方案中，包括填充劑或載體材料以增加此類組合物的體積。合適的填充劑 或者載體材料包括但不限于，多種硫酸鹽、碳酸鹽和硅酸鹽，以及滑石粉、粘土等等。用于液 體組合物的合適填充劑或載體材料包括但不限于水或低分子量伯醇和仲醇，包括多元醇和 二元醇。此類醇的實例包括，但不限于，甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇。在一些實施方案中，組 合物含有約5%到約90%的此類物質。酸性填充劑可用于降低pH。備選地，清潔添加劑包括如下文更詳細描述的附屬成分。本清潔組合物和清潔添加劑需要有效量的至少一種本文提供的蛋白酶變體，其單 獨或者與其他蛋白酶和/或額外酶組合。通過加入一種或多種本發(fā)明的蛋白酶變體實現酶 的所需水平。典型的，本清潔組合物將包含至少約0.0001重量百分比，約0. 0001到約1、約 0. 001到約0. 5、或甚至約0. 01到約0. 1重量百分比的至少一種本發(fā)明的變體蛋白酶。典型地配制本文的清潔組合物使得在水性清潔操作中使用期間，洗滌水將具有約 5. 0到約11. 5或甚至約7. 5到約10. 5的pH。典型地配制液體產品制劑以具有約3. 0到約 9. 0或甚至約3到約5的凈pH。典型地配制粒狀洗衣產品以具有約9到約11的pH。用于 將PH控制在推薦的使用水平的技術包括使用緩沖劑、堿、酸等等，并且是本領域技術人員 公知的。合適的低pH清潔組合物通常具有約3到約5的凈pH，并且通常沒有在這種pH環(huán) 境中水解的表面活性劑。此類表面活性劑包括烷基硫酸鈉表面活性劑，其包含至少一個環(huán) 氧乙烷部分或者甚至約1到約16摩爾的環(huán)氧乙烷。此類清潔組合物通常包含足夠量的pH 修飾劑，如氫氧化鈉、單乙醇胺或者氫氯酸，以提供具有約3到約5的凈pH的此類清潔組合 物。此類組合物通常包含至少一種酸穩(wěn)定的酶。在一些實施方案中，組合物是液體，而在其 他實施方案中，它們是固體。此類液體組合物的PH通常測量為凈pH。此類固體組合物的 PH作為所述組合物的10%固體溶液測量，其中溶劑是蒸餾水。在這些實施方案中，在20°C 進行所有PH測量。在一些實施方案中，當變體蛋白酶用于粒狀組合物或液體中時，希望變體蛋白酶 為經封裝顆粒形式以保護該變體蛋白酶免于保存期間粒狀組合物的其他組分的作用。此 外，封裝也是在清潔過程中控制變體蛋白酶可用性的一種手段。在一些實施方案中，封裝增 強了變體蛋白酶和/或額外酶的性能。在這方面，用本領域已知的任何合適的封裝材料封 裝本發(fā)明的變體蛋白酶。在一些實施方案中，封裝材料通常封裝本發(fā)明變體蛋白酶的至少 部分催化劑。通常，封裝材料是水溶性的和/或水可分散的。在一些實施方案中，封裝材料 具有0°C或更高的玻璃轉化溫度(Tg)。玻璃轉化溫度在WO 97/11151中更詳細描述。封裝材 料選自糖類、天然或合成的樹膠、殼多糖、殼聚糖、纖維素和纖維素衍生物、硅酸鹽、磷酸鹽、 硼酸鹽、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蠟和其組合。當封裝材料是糖類時，其通常選自單糖、寡糖、 多糖和其組合。通常，封裝材料是淀粉。合適的淀粉描述于EP 0 922 499 ；US 4,977, 252 ； US 5，354，559，和US 5，935，826。在一些實施方案中，封裝材料是塑料如熱塑塑料、丙烯腈、 甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈和其混合物制成的微球體；可使用的可商購微球體包 括以 EXPANCEL (Stockviksverken，Sweden) JPPM 6545，PM 6550，PM 7220，PM 7228， EXTENDOSPHERES ，LUXSIL Q-CEL ⑧，和 SPHERICEL (PQ Corp. ,Valley Forge, PA)提 供的微球體。如本文所述，本發(fā)明的變體蛋白酶可尤其用于清潔工業(yè)，包括，但不限于洗衣和洗 碟洗滌劑。這些應用將酶置于多種環(huán)境脅迫下。本發(fā)明的變體蛋白酶由于在多種條件下的 穩(wěn)定性相對于許多當前使用的酶提供了益處。實際上，有多種洗滌條件，包括參與洗滌的蛋白酶所暴露的不同的洗滌劑制劑、 洗滌水體積、洗滌水溫度、和洗滌時間長度。此外，用于不同的地理區(qū)域的洗滌劑制劑 存在于洗滌水中的相關組分具有不同濃度。例如，歐洲洗滌劑通常在洗滌水中具有約4500-5000ppm的洗滌劑組分，而日本洗滌劑通常在洗滌水中具有約667ppm的洗滌劑組分。 在北美，尤其在美國，洗滌劑通常在洗滌水中具有約975ppm的洗滌劑組分。低洗滌劑濃度系統(tǒng)包括其中在洗滌水中存在少于約SOOppm洗滌劑組分的洗滌 劑。日本洗滌劑通常被認為是低洗滌劑濃度系統(tǒng)，因為它們通常在洗滌水中存在約667ppm 的洗滌劑組分。中洗滌劑濃度包括其中在洗滌水中存在約800ppm到約2000ppm洗滌劑組分的洗 滌劑。北美洗滌劑通常被認為是中等洗滌劑濃度系統(tǒng)，因為它們通常在洗滌水中存在約 975ppm的洗滌劑組分。巴西洗滌劑通常具有存在于洗滌水中約1500ppm的洗滌劑組分。高洗滌劑濃度系統(tǒng)包括洗滌劑，其中洗滌水中存在大于約2000ppm的洗滌劑組 分。通常認為歐洲洗滌劑是高洗滌劑濃度系統(tǒng)，其通常在洗滌水中含有約4500-5000ppm的 洗滌劑組分。拉丁美洲洗滌劑通常是高泡磷酸增潔洗滌劑，拉丁美洲使用的洗滌劑范圍可落入 中洗滌劑濃度和高洗滌劑濃度之間，因為它們在洗滌水中的洗滌劑組分范圍在1500ppm至 6000ppmo如上所述，巴西洗滌劑通常在洗滌水中含有約1500ppm的洗滌劑組分。然而，其 他高泡磷酸增潔洗滌劑地區(qū)，不限于其他拉丁美洲國家，可具有高洗滌劑濃度系統(tǒng)，在洗滌 水中存在高達約6000ppm的洗滌劑組分。鑒于上述內容，很顯然，典型的洗滌溶液中洗滌劑組合物的濃度在世界范圍內變 動，從低于約SOOppm的洗滌劑組合物(“低洗滌劑濃度系統(tǒng)”)，例如日本的約667ppm，到在 約800ppm至約2000ppm之間(“中洗滌劑濃度系統(tǒng)”)，例如美國的約975ppm和巴西的約 1500ppm,到大于約2000ppm( “高洗滌劑濃度系統(tǒng)”)，例如歐洲的約4500ppm至約5000ppm， 以及高泡磷酸增潔洗滌劑地區(qū)的約6000ppm。根據經驗確定典型洗滌溶液的濃度。例如，在美國，典型的洗衣機容納體積約 64. 4L的洗滌溶液。因此，為了獲得洗滌溶液中約975ppm的洗滌劑濃度，應該向64. 4L洗滌 溶液中添加62. 79g的洗滌劑組合物。該量是消費者利用洗滌劑提供的量杯量入洗滌水中 的典型量。在另一實例中，不同地區(qū)使用不同的洗滌溫度。日本的洗滌水的溫度通常低于歐 洲使用的溫度。例如，北美和日本的洗滌水溫度通常在10至30°C (如，約20°C )，而歐洲洗 滌水溫度一般在30至60°C (如，約40°C )。在另一實例中，不同地區(qū)通常具有不同的水硬度。水硬度一般通過每加侖混合的 Ca2+/Mg2+的格令(grain)數來描述。硬度是水中鈣(Ca2+)和鎂(Mg2+)的量的度量。美國的 多數水是硬水，但硬度值不同。中等硬度水(60-120ppm)至硬水(121-181ppm)具有60至 ISlppm的硬度礦物(ppm轉換成格令/美制加侖是ppm數除以17. 1等于格令/加侖)。
權利要求
1.芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋 白酶變體是成熟形式，具有蛋白水解活性并且包含在一個或多個位置上的取代，所述位置 選自:1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26， 27，28，29，30，31，33，35，36，37，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54， 55，56，57，58，59，60，64，65，66，67，71，72，73，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88， 89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，101，102，103，104，105，106，107，109，110，111，112， 113，114，115，116，117，118，119，122，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134， 135，136，137，139，141，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，156，157，158， 159，160，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179， 180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，194，195，196，197，198，199， 200，201，203，204，206，207，209，210，212，213，214，215，216，217，218，219，220，222，223， 224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244， 245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263， 264，265，267，268，269，270，271，272，273和 274，其中所述位置對應于SEQ ID NO :2給出的 解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
2.權利要求1的分離的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述一個或多個位置選自1，2，5， 6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，21，22，23，24，25，26，28，29，30，31，33， 35，36，37，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60， 64，65，66，67，71，72，73，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95， 96，97，98，99，101，102，103，104，105，106，107，109，110，111，112，113，114，115，116，118， 119，122，124，125，126，127，128，129，131，133，134，135，136，137，139，141，143，144，145， 146，147，148，149，150，151，152，153，156，157，158，159，160，162，163，164，165，166，167， 169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187， 188，189，190，191，192，194，195，196，197，198，199，200，201，203，204，206，207，212，213， 214，215，216，217，218，219，220，222，223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235， 236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，253，254，255， 256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268，269，270，271，272，273 和 274，其 中所述位置對應于SEQ ID NO :2給出的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序 列。
3.權利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述一個或多個位置選自2，3，5，6，7，8， 9，10，11，12，13，14，15，16，17，19，20，21，21，22，23，25，26，28，29，30，31，33，35，36，37，39， 40，41，42，44，46，47，48，49，50，51，53，54，55，56，57，58，59，60，64，65，66，67，71，73，77， 78，79，81，82，83，84，85，86，88，89，90，91，92，93，94，95，96，102，105，106，110，111，112， 113，114，115，116，122，124，125，128，129，131，133，134，135，136，137，139，141，143，145， 146，147，148，149，150，151，152，153，156，157，158，159，160，162，165，166，167，169，170， 171，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，186，187，189，190，191，192， 194，195，196，197，198，199，200，201，203，204，206，207，212，214，216，217，218，219，220， 222，223，224，225，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242， 243，244，245，246，247，249，250，251，253，254，255，257，258，259，260，261，262，263，264，-265，267，268，269，270，271，272，273，和 274，其中所述位置對應于 SEQ ID NO :2 給出的解 淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
4.權利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述枯草桿菌蛋白酶變體還包含在選自 18，52，72，117，119，127，144，185，209和213的一個或多個位置上的取代，其中所述位置對 應于SEQ ID NO :2給出的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
5.權利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述取代包含如下的一個或多個:A001C,A001D,A001E,A001F,A001G,A001H,A001I,A001K,A001L,A001M,A001N,A001Q,A001R,A001S,A001V,A001W,Q002A,Q002D,Q002E,Q002G,Q002S,S003A,S003D,S003F,S003G,S003I,S003K,S003L,S003M,S003N,S003P,S003Q,S003R,S003T,S003V,S003W,S003Y,P005C,P005E,P005G,P005N,P005Q,P005T,Y006A,Y006C,Y006E,Y006F,Y006G,Y006K,Y006M,Y006N,Y006P,Y006Q,Y006R,Y006T,Y006V,Y006W,S009A,S009C,S009E,S009F,S009G,S009H,S009K,S009L,S009M,S009P,S009Q,S009R,S009T,S009V,S009W,Q010A,Q010C,Q010E,Q010F,Q010G,Q010H,Q010I,Q010K,Q010L,Q010M,Q010R,Q010S,Q010T,Q010V,Q010W,I011C,I011L,I011T,I011V,I011Y,K012A,K012C,K012D,K012E,K012F,K012G,K012H,K012I,K012N,K012Q,K012S,K012T,K012V,K012W,K012Y,A013C,A013F,A013G,A013H,A013L,A013R,A013S,A013T,A013V,P014A,P014C,P014D,P014E,P014F,P014G,P014I,P014K,P014L,P014M,P014N,P014Q,P014R,P014S,P014T,P014V,P014W,P014Y,A015C,A015D,A015E,A015F,A015G,A015H,A015I,A015K,A015L,A015M,A015P,A015Q,A015R,A015T,A015V,A015Y,L016A,L016C,L016I,L016M,L016Q,L016S,L016T,H017F,H017I,H017L,H017M,H017V,H017W,H017Y,S018A,S018E,S018F,S018G,S018H,S018I,S018K,S018L,S018M,S018N,S018P,S018Q,S018R,S018T,S018V,S018W,S018Y,Q019A,Q019C,Q019D,Q019E,Q019G,Q019I,Q019K,Q019M,Q019R,Q019T,Q019V,G020A,G020C,G020D,G020E,G020F,G020H,G020K,G020M,G020N,G020P,G020Q,G020R,G020S,G020W,Y021A,Y021C,Y021D,Y021E,Y021F,Y021G,Y021H,Y021K,Y021M,Y021R,Y021S,Y021T,Y021V,Y021W,T022A,T022C,T022E,T022F,T022G,T022H,T022I,T022K,T022L,T022M,T022N,T022Q,T022S,T022V,T022W,T022Y,S024C,S024F,S024G,S024H,S024I，S024K ，S024L, S024M, S024N, S024Q, S024R, S024T, S024W, S024Y, N025C, N025E, N025F, N025G, N025H, N025I, N025K, N025L, N025M, N025P, N025R, N025S, N025T, N025V, N025W, K027A, K027D, K027E, K027F, K027G, K027H, K027L, K027M, K027P, K027R, K027S, K027W, K027Y, D032A, D032C, D032E, D032G, D032I, D032K, D032L, D032M, D032N, D032R, D032S, D032T, D032V, D032Y, S033A, S033F, S033G, S033H, S033P, S033T, S033W, I035A, I035C, I035D, I035R, I035S, I035T, I035V, D036A, D036C, D036E, D036Q, D036S, D036W, S037A, S037C, S037E, S037F, S037G ， S037H, S037K, S037L, S037M, S037P, S037Q, S037R, S037T, S037W, H039C, H039Q, H039T, H039V, P040A, P040C, P040E, P040F, P040G, P040G, P040H, P040I, P040K, P040L，P040M, P040N, P040Q, P040R, P040S, P040T, P040V, P040W, D041E, L042I, L042M, L042V, K043A, K043C, K043D, K043E, K043F, K043G, K043I, K043L, K043M, K043N, K043R, K043S, K043T, K043V, K043W, K043Y, V044A, V044C, V044I, V044L, V044M, V044P, V044S, V044T, A045C, A045E, A045F, A045H, A045I, A045K, A045L, A045M, A045N, A045P, A045Q, A045S, A045T, A045V, A045Y, G046A, G046C, G046E, G046H, G046K, G046M, G046N,G046Q,G046T,G046W, G046YA048C,A048D,A048E,A048F,A048H,A048I, A048K,A048L,A048M,A048Q,A048R, A048SA048T,A048V,A048W,A048Y,M050A,M050C, M050F,M050H,M050I,M050K,M050L, M050QM050R,M050S,M050T,M050V,M050W,M050Y, V051A,V051C,V051D,V051E,V051H,V051I，V051L, V051PV051QP052C,P052D,P052E, 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Q206G,Q206HQ206IQ206LQ206MQ206NQ206P, Q206R,Q206S,Q206T,Q206V,Q206W, Q206Y,S207DS207ES207KS207QS207TS207V, P210A,P210C,P210S,P210T,N212A, N212C,N212EN212FN212GN212HN212KN212L, N212M,N212P,N212Q,N212R,N212S, N212V,K213A,K213C,K213D,K213E,K213F,K213H, K213I，K213L,K213M,K213N,K213Q,K213R,K213SK213TK213VK213YY214WG215A,G215C,G215D,G215E,G215I,G215M,G215N,G215QG215SG215TG215VA216CA216D,A216E,A216G,A216K,A216L,A216M,A216N,A216PA216QA216RA216SA216VA216W,Y217A,Y217C,Y217D,Y217E,Y217F,Y217G,Y217HY217IY217KY217LY217MY217N,Y217Q,Y217R,Y217S,Y217T,Y217V,Y217W,N218AN218CN218EN218FN218GN218H,N218K,N218M,N218R,N218S,N218T,N218W,N218YG219AG219CG219DG219HG219I,G219M,G219P,G219Q,G219R,G219S,G219T,G219VG219WT220DT220ET220FT220G,T220K,T220M,T220S,T220Y,A223E,A223F,A223LA223MA223RA223SA223VA223W,A223Y,S224A,S224C,S224F,S224G,S224H,S224MS224NS224QS224RS224TP225A,P225C,P225F,P225G,P225H,P225I,P225K,P225LP225MP225RP225SP225TP225V,P225Y,A228P,A228R,A228S,A228T,A228W,G229AG229HG229IG229SA230CA230E,A230G,A230Q,A230R,A230S,A230T,A230V,A231CA231IA231PA231RI234AI234C,I234L,I234M,I234N,I234P,I234Q,I234S,I234TI234VL235AL235CL235GL235I,L235K,L235M,L235N,L235Q,L235R,L235S,L235TL235VL235WL235YS236AS236C,S236D,S236E,S236G,S236H,S236N,S236Q,S236TS236VS236YK237AK237EK237F,K237G,K237H,K237I,K237L,K237M,K237N,K237QK237RK237SK237TK237VK237W,K237Y,H238C,H238D,H238E,H238F,H238M,H238RH238SP239CP239DP239EP239F,P239H,P239L,P239M,P239N,P239Q,P239R,P239SP239TP239VP239WP239YN240A,N240C,N240D,N240F,N240G,N240K,N240L,N240QN240RN240SN240TN240VN240W,N240Y,W241A,W241F,W241G,W241H,W241I,W241KW241MW241QW241TW241VT242A,T242C,T242E,T242F,T242G,T242K,T242M,T242NT242PT242RT242ST242WT242Y,N243C,N243E,N243F,N243G,N243I,N243Q,N243SN243TN243VN243WN243YT244A,T244D,T244F,T244G,T244H,T244K,T244L,T244MT244NT244PT244QT244RT244S,T244V,T244W,T244Y,Q245A,Q245C,Q245D,Q245EQ245HQ245IQ245KQ245LQ245M,Q245R,Q245T,Q245V,Q245Y,R247W,S248A,S248ES248FS248GS248HS248IS248L,S248M,S248N,S248Q,S248R,S248T,S248V,S248WS248YS249CS249DS249HS249I,S249K,S249L,S249M,S249N,S249Q,S249R,S249TS249VS249WS249YL250DL250F,L250H,L250I,L250M,L250T,L250V,E251A,E251TE251WN252AN252CN252EN252G,N252H,N252I,N252L,N252M,N252Q,N252R,N252SN252TN252VN252YT253AT253C,T253E,T253G,T253H,T253K,T253M,T253S,T253VT254AT254CT254LT254MT254R,T254S,T254V,T255A,T255C,T255D,T255E,T255F,T255G,T255H,T255I,T255K,T255L,T255M,T255R,T255S,T255V,K256A,K256C,K256D,K256E,K256F,K256H,K256I,K256L,K256M,K256N,K256P,K256Q,K256R,K256S,K256T,K256V,K256W,K256Y,L257A,L257C,L257F,L257G,L257H,L257I,L257K,L257M,L257N,L257R,L257S,L257T,L257V,L257W,L257Y,G258Q,D259A,D259E,D259F,D259G,D259L,D259N,D259P,D259Q,D259R,D259S,D259T,D259V,D259W,D259Y,S260A,S260C,S260D,S260E,S260F,S260G,S260H,S260L,S260M,S260N,S260P,S260R,S260V,S260W,S260Y,F261H,F261W,Y262A,Y262C,Y262E,Y262F,Y262H,Y262L,Y262M,Y262N,Y263F,Y263M,Y263T,G264F,G264I,G264L,K265A,K265C,K265E,K265G,K265H,K265L,K265M,K265N,K265Q,K265R,K265S,K265W,K265Y,G266C,G266F,G266L,G266M,G266P,G266R,G266V,G266W,G266Y,L267A,L267C,L267E,L267G,L267H,L267I,L267M,L267N,L267Q,L267S,L267T,L267V,I268A,I268C,I268K,I268L,I268M,I268P,I268R,I268V,N269D,N269E,N269K,N269L,N269P,N269Q,N269S,Q271A,Q271C,Q271D,Q271E,Q271F,Q271G,Q271H,Q271I,Q271K,Q271L,Q271M,Q271N,Q271P,Q271R,Q271S,Q271T,Q271V,Q271W,Q271Y,A272E,A272F,A272G,A272H,A272K,A272L,A272M,A272N,A272Q,A272R,A272S,A272T,A272V,A272W,A272Y,A274C,A274D,A274F,A274G,A274H,A274I, A274K, A274L, A274Q, A274S,A274T，和A274V，其中所述位置對應于SEQ IDNO 2給出的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
6.權利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述取代包含選自Y021H-Y217E， Y021H-Y217Q, S101E-Y217L, Y021H-Y217L, K213I-Y217Q, A045I-Y217Q, M119F-Y217Q, A045V-Y217L, Y021H-Y217L， K213I-Y217E， A092G-A114G， Y021W-S101E, V26Q-K213I,和 Y021H-S101N的取代組合，其中所述位置對應于SEQ ID NO :2給出的解淀粉芽孢桿菌枯草 桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
7.權利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述取代包含選自S101N-K213I， S101N-M119H, K213L, M119N-K213N， K213N, K213I-Y217E， M119N-K213I， K213N-Y217Q， M119H-K213N, S101P-K213N, M119H-Y217Q, K213I-Y217Q, M119F-K213L, Y217Q, M119F-Y217Q, A048E-K213L, A048H-K213L, K213N, V026N-K213L, V026N-K213L, V026Y-K213N, A048D-K213N, A048H-K213N, A048H-K213L, K213L, K213N, V147D-K213L, K213I, A048E-K213L, A048D-K213N, K213I, A048H-K213N, V147D-K213N, Y021H-Y217L, Y021H-Y217Q, A045V-Y217L, S101E-Y217L, Y021H-Y217E, A045I-Y217Q, Y021H-Y217L, Y021H-Y217E的組合，其中所述位置對應于SEQ ID NO :2給出的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌 蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
8.權利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體，其中所述取代包含選自S101N-M119H，Y217L， M119N-K213N, S101E-Y217L, A045I-Y217Q 的組合，其中所述位置對應于 SEQ ID NO 2 給出 的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列。
9.編碼權利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體的分離的核酸。
10.包含權利要求9的核酸的表達載體。
11.包含權利要求10的表達載體的宿主細胞。
12.包含權利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體的清潔組合物。
13.其中所述清潔組合物是洗衣洗滌劑。
14.其中所述洗衣洗滌劑是冷水洗滌劑、低PH洗滌劑，或者濃縮洗滌劑。
15.產生芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的枯草桿菌蛋白酶變體的方法，包括步驟a)用包含編碼權利要求1的枯草桿菌蛋白酶變體的核酸的表達載體轉化宿主細胞；和b)在適于產生枯草桿菌蛋白酶變體的條件下培養(yǎng)轉化的宿主細胞，以產生枯草桿菌蛋 白酶變體。
16.權利要求15的方法，還包括收獲所產生的枯草桿菌蛋白酶變體的步驟。
17.權利要求15的方法，其中所述宿主細胞是芽孢桿菌屬物種。
18.權利要求17的方法，其中所述芽孢桿菌屬物種是枯草芽孢桿菌。
19.清潔方法，包括將表面和/或包含織物的物品與包含權利要求1-8任一項的分離的 枯草桿菌蛋白酶變體的清潔組合物接觸的步驟。
20.蛋白酶工程化方法，包括a)提供多個位點評估文庫(SEL)，每個文庫包含在所述蛋白酶的相同氨基酸位置具有 不同取代的多個蛋白酶變體；b)在目的性質測試中測試所述SEL的所述蛋白酶變體和標準蛋白酶；c)為所述測試確定所述蛋白酶變體的每一種的性能指數(PI)；d)鑒定兩個或更多所述氨基酸位置為非限制性位置，其中兩個所述SEL的每一個中所 述多個蛋白酶變體的至少一個具有大于0. 5的PI ；和f)提供多突變文庫，其包含多個多取代的蛋白酶變體，每個變體在所述兩個或更多非 限制性位置中包含取代。
21.權利要求20的方法，其中所述測試包括選自污物去除測定法(微樣品)、LAS穩(wěn)定 性、EDTA穩(wěn)定性、洗滌劑穩(wěn)定性測定法和比活性測定法的兩種或多種不同的測定法。
22.權利要求20和21任一項的方法，其中所述蛋白酶是細菌枯草桿菌蛋白酶。
23.產生芽孢桿菌屬枯草桿菌蛋白酶的多取代的枯草桿菌蛋白酶變體的方法，包括a)在第一種性質的第一種測試和第二種性質的第二種測試中測試多個單取代的枯草 桿菌蛋白酶變體，其中在每個測試中給予親本枯草桿菌蛋白酶的性質1.0的值，有利的第 一種或第二種性質具有大于1.0的值，并且過度不利的第一種或第二種性質具有小于約0.80或在一些優(yōu)選實施方案中小于約0. 60的值；b)鑒定至少一種單取代的枯草桿菌蛋白酶變體中與有利的第一種性質相關并且不與 過度不利的第二種性質相關的取代；c)鑒定至少一種單取代的枯草桿菌蛋白酶變體中與有利的第二種性質相關并且不與 過度不利的第一種性質相關的取代；d)將來自前面步驟的取代引入枯草桿菌蛋白酶以產生多取代的枯草桿菌蛋白酶變體。
24.權利要求23的方法，還包括在第一種測試和第二種測試中測試所述多取代的枯草 桿菌蛋白酶變體，其中改進的枯草桿菌蛋白酶變體在所述第一種和第二種測試中實現大于1.0的值，或者在第一種測試中大于1. 0的值并且在第二種測試中0. 80到1. 0的值。
25.權利要求對的方法，還包括產生所述改進的枯草桿菌蛋白酶變體。
26.權利要求25的方法，其中所述第一種和第二種性質負相關。
27.權利要求沈的方法，其中有利的第一種或第二種性質具有大于約1.2的值。
28.權利要求M的方法，其中過度不利的第一種或第二種性質具有小于約0.40的值。
29.權利要求M的方法，其中所述第一種性質是穩(wěn)定性，并且第二種性質是洗滌性能。
30.權利要求四的方法，其中所述穩(wěn)定性包括在洗滌劑中的穩(wěn)定性并且所述洗滌性能 包括在洗滌劑中的血奶墨(BMI)洗滌性能。
31.權利要求M的方法，其中在具有5到12.0的pH的粉末或液體洗滌劑組合物中測 試洗滌性能。
32.權利要求M的方法，其中所述親本細菌枯草桿菌蛋白酶是具有如SEQID N0:2給 出氨基酸序列的解淀粉芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶BPN’的野生型成熟形式。
33.權利要求M的方法，其中所述位置在親本枯草桿菌蛋白酶中具有大于約50%的溶 劑可及表面(SAS)。
34.權利要求33的方法，其中所述親本枯草桿菌蛋白酶中所述一個或多個位置是具有 大于約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置。
全文摘要
本發(fā)明提供了蛋白質工程化的方法。特別地，本發(fā)明提供了利用位點評估文庫設計優(yōu)化蛋白質的兩種或多種性質的文庫的方法。本發(fā)明還提供了適于多種用途的變體枯草桿菌蛋白酶。
文檔編號C12N9/54GK102046783SQ200980120416
公開日2011年5月4日 申請日期2009年6月3日 優(yōu)先權日2008年6月6日
發(fā)明者D·A·伊斯泰爾, F·齊德戈伯, J·T·小凱利斯, L·G·卡斯康-佩雷拉 申請人:丹尼斯科美國公司