專利名稱：抗微生物肽變體及編碼其的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗微生物肽的變體，編碼所述變體的多核苷酸，產(chǎn)生所述變體的方法和使用所述變體的方法。相關(guān)技術(shù)描述在文獻中已經(jīng)描述了幾種類型的抗微生物肽(AMPs)，其實例包括防衛(wèi)素和α _螺旋肽。本發(fā)明提供了從沙躅(Arenicola marina)分離，并描述于W02007/023163的抗微生物肽的變體。 本發(fā)明的變體抗微生物肽與親本抗微生物肽相比呈現(xiàn)改善的抗微生物活性。具體而言，所述變體在血清和血液蛋白的存在下呈現(xiàn)改善的抗微生物活性。本發(fā)明的變體肽的另一個優(yōu)點是對例如血清和血液蛋白的蛋白結(jié)合減少，其導(dǎo)致與親本抗微生物肽相比改善的生物利用度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的抗微生物肽的分離的變體，其在SEQID NO:2 的成熟肽的位置 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，15，17，19和 21 中的一個或多個(幾個)包含改變，其中所述變體具有抗微生物活性。本發(fā)明亦涉及編碼所述變體的分離的多核苷酸，包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞，以及產(chǎn)生所述變體的方法。本發(fā)明亦涉及使用本發(fā)明的變體處理微生物感染的方法，以及所述變體在制備處理微生物感染的藥物中的用途。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的抗微生物肽的分離的變體，其在SEQID NO:2 的成熟肽的位置 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，15，17，19和21 中的一個或多個(幾個)位置包含改變，其中所述變體具有抗微生物活性。定義抗微生物活性術(shù)語“抗微生物活性”在本文中定義為能夠殺滅或抑制微生物細胞生長的活性。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語旨在意指存在殺細菌和/或抑細菌和/或殺真菌和/或抑真菌作用，和/或殺病毒作用，其中所述術(shù)語“殺細菌”應(yīng)理解為能夠殺滅細菌細胞。術(shù)語“抑細菌”應(yīng)理解為能夠抑制細菌生長，即抑制生長的細菌細胞。術(shù)語“殺真菌”應(yīng)理解為能夠殺滅真菌細胞。術(shù)語“抑真菌”應(yīng)理解為能夠抑制真菌生長，即抑制生長的真菌細胞。術(shù)語“殺病毒”應(yīng)理解為能夠使病毒滅活。術(shù)語“微生物細胞”指細菌或真菌細胞(包括酵母)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“抑制微生物細胞的生長”旨在意指所述細胞處于非生長狀態(tài)，即其無法繁殖。在一個優(yōu)選實施方案中，術(shù)語“抗微生物活性”定義為殺細菌和/或抑細菌活性。更優(yōu)選地，“抗微生物活性”定義為針對埃希氏菌屬(Escherichia)優(yōu)選大腸桿菌(Escherichia coli)的殺細菌和/或抑細菌活性。就本發(fā)明而言，抗微生物活性可根據(jù)Lehrer等，Journal of ImmunologicalMethods, Vol. 137 (2)pp. 167-174(1991)所述的步驟確定?；蛘?，抗微生物活性可根據(jù)來自CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute ;之前稱作 National Committeefor Clinical and Laboratory Standards)的 NCCLS 指南來確定。具有抗微生物活性的肽可在37°C在相關(guān)微生物生長底物中在具有抗微生物活性的肽為500 μ g/ml的濃度，優(yōu)選250 μ g/ml的濃度，更優(yōu)選100 μ g/ml的濃度，甚至更優(yōu)選50 μ g/ml的濃度,最優(yōu)選25 μ g/ml的濃度；并且特別是10 μ g/ml的濃度下,溫育8小時之后(優(yōu)選4小時之后，更優(yōu)選2小時之后，最優(yōu)選I小時之后，且特別是30分鐘之后)能夠?qū)⒋竽c桿菌(DSM1576)的活細胞的數(shù)目減少至1/100。具有抗微生物活性的肽亦可在37°C 8小時在相關(guān)的微生物生長底物中，當以500 μ g/ml的濃度添加時,優(yōu)選當以250 μ g/ml的濃度添加時,更優(yōu)選當以100 μ g/ml的濃度添加時，甚至更優(yōu)選當以50 μ g/ml的濃度添加時,最優(yōu)選當以10 μ g/ml的濃度添加時，并且特別是當以5 μ g/ml的濃度添加時能夠抑制大腸桿菌(DSM1576)的長出(outgrowth)。本發(fā)明的變體肽與SEQ ID N O:2的抗微生物肽相比具有改善的抗微生物活性。在一個實施方案中，本發(fā)明的變體肽在血液血清的存在下，具有多于100%的SEQ ID NO:2的肽的抗微生物活性。變體術(shù)語“變體”意指具有抗微生物活性的肽，其在一個或多個(幾個)位置包含改變，即取代、插入和/或缺失。取代意指用不同的氨基酸替代占據(jù)某位置的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)某位置的氨基酸；而插入意指鄰接于占據(jù)某位置的氨基酸添加1-3個氨基酸。突變體術(shù)語“突變體”意指編碼變體的多核苷酸。野生型抗微生物肽術(shù)語“野生型”抗微生物肽意指由天然存在的微生物，如見于自然界的細菌、酵母或絲狀真菌表達的抗微生物肽。親本或親本抗微生物肽術(shù)語“親本”或“親本抗微生物肽”意指對其進行改變以產(chǎn)生本發(fā)明的酶變體的抗微生物肽。該親本可為天然存在(野生型)肽或其變體。分離的變體術(shù)語“分離的變體”意指經(jīng)人力修飾的變體。在一個方面，所述變體如通過SDS-PAGE測定的，為至少1%純，例如至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，和至少90%純?；旧霞兊淖凅w術(shù)語“基本上純的變體”意指制備物，其含有按重量計最多10%，最多8%，最多6%，最多5%，最多4%，最多3%，最多2%，最多1%，和最多0. 5%的與其天然或重組結(jié)合的其它肽材料。優(yōu)選地，所述變體按制備物中存在總肽材料的重量計為至少92%純，例如至少94%純，至少95%純，至少96%純，至少97%純，至少98%純，至少99%，至少99. 5%純，和100%純。本發(fā)明的變體優(yōu)選為基本上純的形式。這可通過，例如藉由公知的重組方法或經(jīng)典的純化方法制備所述變體來實現(xiàn)。成熟肽術(shù)語“成熟肽”意指以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的肽，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。成熟肽編碼序列術(shù)語“成熟肽編碼序列”意指編碼具有抗微生物活性的成熟肽的多核苷酸。序列同一性參數(shù)“序列同一性”描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000, Trends Genet. 16:276-277),優(yōu)選3. 0. 0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口開放罰分(gap open penalty) 10,缺口延伸罰分(gap extensionpenalty) 0. 5 和 EBL0SUM62 (BL0SUM62 的 EMBOSS 版)取代矩陣。使用 Needle 標記為“最高同一11"生(longest identity) ”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一11"生，并計算如下(同樣的殘基X 100)/(比對長度一比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice等，2OOO,見上文)，優(yōu)選3. 0. 0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970，見上文)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口開放罰分10，缺口延伸罰分0. 5和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最高同一性”的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度一比對中缺口的總數(shù))片段術(shù)語“片段”意指從成熟肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(幾個)氨基酸的肽；其中所述片段具有抗微生物活性。在一個方面，片段含有至少15個氨基酸殘基，例如至少17和至少19個氨基酸殘基(例如，SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基I至20)。亞序列術(shù)語“亞序列(subsequence) ”意指從成熟肽編碼序列的5’和/或3’端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的多核苷酸；其中所述亞序列編碼具有抗微生物活性的片段。等位變體(allelic variant):術(shù)語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的肽。肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的肽。分離的多核苷酸術(shù)語“分離的多核苷酸”意指經(jīng)人力修飾的多核苷酸。在一個方面，所述變體如通過瓊脂糖凝膠電泳測定的，為至少1%純，例如至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，至少90%純，和至少95%純。所述多核苷酸可為基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源，或其任何組合。基本上純的多核苷酸術(shù)語“基本上純的多核苷酸”意指不含其它外來的或不需要的核苷酸并以適用于遺傳工程改造的肽產(chǎn)生系統(tǒng)的形式存在的多核苷酸制備物，因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計最多10%，最多8%，最多6%，最多5%，最多4%，最多3%，最多2%，最多1%，和最多O. 5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可包括天然存在的5’ -和3’ -非翻譯區(qū)，如啟動子和終止子。優(yōu)選所述基本上純的多核苷酸為按重量計至少90%純，例如至少92%純，至少94%純，至少95%純，至少96%純，至少97%純，至少98%純，至少99%，和至少99. 5%純。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式。編碼序列術(shù)語“編碼序列”意指直接指定其肽產(chǎn)物氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或其他起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的多核苷酸。cDNA :術(shù)語“cDNA”意指能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的包括剪接的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。核酸構(gòu)建體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”意指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或受修飾以本來不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的區(qū)段，或是合成的。當所述核酸構(gòu)建體含有表達本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達盒”同義。
`
調(diào)控序列(control sequence):術(shù)語“調(diào)控序列”意指對編碼本發(fā)明變體的多核苷酸表達是必需的所有成分。各個調(diào)控序列對于編碼所述變體的多核苷酸可以是天然的或異源的，或各個調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或異源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼變體的多核苷酸編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語“可操作地連接”意指這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸的編碼序列的適當位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)該編碼序列的表達。表達術(shù)語“表達”包括涉及變體產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術(shù)語“表達載體”意指線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼變體的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞“宿主細胞”意指任何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)。術(shù)語“宿主細胞”涵蓋親本細胞的任何后代，所述后代由于在復(fù)制過程中發(fā)生的突變而不同于親本細胞。變體命名規(guī)則就本發(fā)明而言，使用SEQ ID NO:2中公開的成熟肽以確定在其他抗微生物肽中對應(yīng)的氨基酸殘基。將其他抗微生物肽的氨基酸序列與SEQ ID N0:2中公開的成熟肽進行比對，并基于該比對，使用如 EMBOSS 軟件包(EMBOSS:The European Molecular BiologyOpen Software Suite, Rice 等，2000，Trends Genet. 16:276-277),優(yōu)選 3. 0. 0 版或更高版本的 Needle 程序中所執(zhí)行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J. Mol.Biol. 48:443-453)確定與SEQ ID NO: 2中公開的成熟肽中任何氨基酸殘基對應(yīng)的氨基酸位
置編號。在另一個抗微生物肽中對應(yīng)氨基酸殘基的鑒定可通過使用“ClustalW” (Larkin等，2007, Bioinformatics23:2947-2948)進行的多個肽序列的比對來確證。當其他酶與SEQ ID N0:2的成熟肽歧異到傳統(tǒng)的基于序列的比較無法檢測出其關(guān)系時(Lindahl 和 Elofsson, 2000，J. Mol. Biol. 295:613-615)，可使用其他配對序列比較算法。在基于序列的搜索中較高的敏感度可使用采用肽家族的概率表現(xiàn)(probabilisticrepresentation)(序型)搜索數(shù)據(jù)庫的搜索程序來獲得。例如，PS1-BLAST程序通過迭代的(iterative)數(shù)據(jù)庫搜索過程來產(chǎn)生序型，并能夠檢測出較遠的同源物(Atschul等，1997，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)。當肽的家族或超家族在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中具有一個或多個代表時，甚至可達成更高的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones 1999，J.Mol. Biol. 287:797-815;McGuffin 和 Jones, 2003, Bioinformaticsl9:874-881)使用來自不同來源(PS1-BLAST、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(secondary structure prediction)、結(jié)構(gòu)比對序型(structural alignment profile)以及溶解勢(solvation potential))的信息作為預(yù)測所查詢序列(query sequence)的結(jié)構(gòu)折疊(structural fold)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入。類似地，Gough等，2000，J. Mol. Biol. 313:903-919的方法可用于將未知結(jié)構(gòu)的序列與存在于SCOP數(shù)據(jù)庫中的超家族模型進行比對。這些比對可接著用于生成所述肽的同源性模型，且上述模型可就其準確度使用多種為此目的開發(fā)的工具加以評價。對于已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),可獲取數(shù)種工具和資源以供找回(retrieve)和生成結(jié)構(gòu)比對。例如，已將SCOP超家族的蛋白質(zhì)進行了結(jié)構(gòu)比對，且這些比對是可獲取并可下載的。兩個或更多蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可使用多種算法，如距離比對矩陣(distance alignmentmatrix) (Holm 和 Sander, 1998，Proteins33:88-96)或組合延伸(combinatorialextension) (Shindyalov 和 Bourne, 1998, Protein Engineering. 11:739-747)進行比對，且這些算法的實施可另外用于查詢具有目標結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，以發(fā)現(xiàn)可能的結(jié)構(gòu)同源物(例如 Holm 和 Park, 2000, Bioinformatics 16:566-567)。在描述本發(fā)明的抗微生物肽變體時，為了參照方便起見，采用了下面所述的命名法。使用通用的IUPAC單字母或三字母氨基酸縮寫。座也。對于氨基酸取代，使用下述命名法初始氨基酸，位置，取代氨基酸。相應(yīng)地，在226位用丙氨酸取代蘇氨酸命名為“Thr226Ala”或“T226A”。多重突變可以用加號(“ +，，)分開，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表分別在 205 和 411 位用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，以及用苯丙氨酸(F)取代絲氨酸(S)。跡失。對于氨基酸缺失，使用了如下命名法初始氨基酸，位置*。相應(yīng)地，在位置195缺失甘氨酸命名為“Glyl95*”或“G195*”。多個缺失通過加法符(“ + ”)分開，例如，“Glyl95*+Ser411*，，或 “G195*+S411*，，。通入。對于氨基酸插入，使用了如下的命名法初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入的氨基酸。因此，在位置195的甘氨酸之后插入賴氨酸命名為“Glyl95GlyLys”或“G195GK”。多個氨基酸的插入命名為[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入的氨基酸#1，插入的氨基酸#2 ;等等]。例如，在位置195的甘氨酸之后插入賴氨酸和丙氨酸記為“Glyl95GlyLysAla” 或 “G195GKA”。在此情況下，通過在插入的氨基酸殘基前的氨基酸殘基的位置號添加小寫字母而對插入的氨基酸殘基進行編號。因此，在上一例子中序列為
權(quán)利要求
1.一種具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的抗微生物肽的分離的變體，其在SEQ ID NO:2的氨基酸序列的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、17、19和21中的一個或多個(幾個)位置包含取代；其中所述變體具有抗微生物活性，且取代數(shù)為1-11。
2.權(quán)利要求1的變體，其中取代數(shù)為1-10，例如1-9個取代，1-8個取代，1-7個取代，1-6個取代，1-5個取代，1-4個取代，1-3個取代，和1-2個取代。
3.權(quán)利要求1-2任一項的變體，其包含一個或多個(幾個)選自下組的取代 GlA, GlD, GIF, GlH, GlI, GlK, GlM, GlQ, GlR, GlS, GIT, GlV, Glff, GlY,F2A, F2G, F2H, F2I, F2L, F2M, F2P, F2S, F2V, F2W, F2Y,C3L,W4A, W4E, W4F, W4G, W4I, W4L, W4M, W4N, W4Q, W4S, W4T, W4V, W4Y,Y5E, Y5F, Y5G, Y5H, Y5K, Y5N, Y5R, Y5S, Y5W,V6A, V6C, V6E, V6F, V6G, V6H, V6I, V6L, V6M, V6N, V6Q, V6R, V6S, V6T, V6W, V6Y,C7V,V8A, V8F, V8G, V8H, V8I, V8L, V8N, V8S, V8T, V8W, V8Y,Y9A, Y9D, Y9F, Y9G, Y9H, Y9I, Y9K, Y9M, Y9Q, Y9R, Y9S, Y9T, Y9V, Y9W,R10K, RlOP，RIOS, RIOT,N11A, N11G, N11H, N11Q, N11R, N11S, N11Y,G12A, G12D, G12E, G12F, G12H, G12K, G12N, G12R, G12S, G12Y,V13A, V13C, V13F, V13G, V13H, V13K, V13L, V13P, V13Q, V13R, V13S, V13T, V13W, V13Y,V15A, V15C, V15F, V15G, V15H, V15I, V15K, V15L, V15M, V15N, V15P, V15Q, V15R, V15S,V15T, V15W, V15Y,Y17C, Y17F, Y17G, Y17H, Y17I, Y17K, Y17L, Y17M, Y17N, Y17Q, Y17R, Y17S, Y17T, Y17V,Y17W,R19D, R19H, R19K, R19M, R19T, R19Y,N21A, N21C, N21F, N21G, N21H, N21I, N21K, N21L, N21M, N21P, N21Q, N21R, N21S, N21T,N21W，和 N21Y。
4.權(quán)利要求1-3 任一項的變體，其在位置 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、17、19和21中的兩個位置包含取代。
5.權(quán)利要求1-3 任一項的變體，其在位置 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、17、19和21中的三個位置包含取代。
6.權(quán)利要求1-3 任一項的變體，其在位置 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、17、19和21中的四個位置包含取代。
7.權(quán)利要求1-3任一項的變體，其包含SEQID N0:3至SEQ ID N0:548任一個的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求1-3任一項的變體，其由SEQID N0:3至SEQ ID NO:548任一個的氨基酸序列組成。
9.一種分離的多核苷酸,其編碼權(quán)利要求1-8任一項的變體。
10.一種核酸構(gòu)建體，其包含SEQ ID N0:9的多核苷酸。
11.一種表達載體，其包含權(quán)利要求9的多核苷酸。
12.—種宿主細胞，其包含權(quán)利要求9的多核苷酸。
13.—種產(chǎn)生具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的抗微生物肽的變體的方法，其包括a)在適于所述變體的表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求12的宿主細胞；和b)回收所述變體。
14.權(quán)利要求1-8任一項的變體，其用作藥物。
15.權(quán)利要求1-8任一項的變體在制備用于處理微生物感染的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及親本抗微生物肽的變體。本發(fā)明還涉及編碼所述變體的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細胞；和使用所述變體的方法。
文檔編號A61K38/17GK103068840SQ201180038676
公開日2013年4月24日 申請日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者H-H.K.霍根豪格, P.H.邁金德, T.克魯斯, D.R.塞古拉, D.桑德范格, S.尼夫 申請人:阿德寧生物技術(shù)公司