專利名稱：包括微生物蛋白酶變體的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供枯草蛋白酶變體及包含至少一種本文所述枯草蛋白酶變體的組合物， 以及使用這些變體和組合物的方法。
背景技術(shù)：
絲氨酸蛋白酶是包含多種具有廣泛特性和生物學(xué)功能的酶類別的羰基水解酶的 一個(gè)亞型。已經(jīng)對(duì)枯草蛋白酶進(jìn)行了很多研究，這很大程度上是由于它們?cè)谇鍧嵓帮暳蠎?yīng) 用中的用途。另外的研究集中在能對(duì)這些酶各種應(yīng)用功能產(chǎn)生不利影響的有害環(huán)境條件上 (如暴露于氧化劑、螯合劑、極端溫度和/或PH中)。然而，本領(lǐng)域中仍需要能夠抵抗這些 不利條件并且保持或比本領(lǐng)域已知的那些活性具有改善的活性的酶系統(tǒng)。
發(fā)明概要本發(fā)明提供枯草蛋白酶變體及包含至少一種本文所述的枯草蛋白酶變體的組合 物，以及使用這些變體和組合物的方法。具體而言，本發(fā)明提供了適合于衣物清潔用途的蛋 白酶變體。本發(fā)明提供了包含至少一種修飾的枯草蛋白酶變體，其中所述至少一種修飾選 自:G100C、S101D、S101H、Q103D、M124G、L126G、S132H、S161N、Q275Z 和 / 或選自下列的至 少一組修飾A001T/L096V/G097S/A098D/D0991，A001V/G097S/A098R/D099G，V004M/A098D/ D099G, V004M/D099R/G100S/Z100. OIL, V004M/G127C/G128S/P129R, V004M/M119C/D120S, V008I/A098G/D099R, V0081/A098N, V0081/M119C/D120G, Q010L/G097R/A098C/D099S, K012N/A098R/D099V, K012R/G097D/A098H/D099G, A01T/S 101R/Q103S, A013V/G097N/ A098H/D099G/G160S, A013V/G097S/Z097. 01R/A098R, A013V/G100R/S101G, A013V/N118G/ M119I, A013V/P129Z/S130H/S132G, P014L/N062D/S101R/Q103S, P014S/A098S/D099G, A015T/V068N/A069G, L016M/G128R/P129R/Z129. 01G, H017Q/G127R/P129G, H017Y/A098R/ D099I, H017Y/A098R/D099Z/S101G, H017Y/P129R, H017Y/S130Y/G131S/S132L, Q019H/ G128R/Z128. 01R/P129D, Q019H/Z128. 01G/Z128. 02G, G020D/G097R/A098G/D099C, G020D/ P129Z/S130G/G131R/S132C, N025Y/S101L/Q103N, A029V/G097R/A098S, S033I/T066G/ H067R/V068D/A216E, S038F/A098R/D099S, V044I/G097C/A098D/D099G, V044I/G097R/ A098R, V044I/G100S/S101G, A045V/G097C/A098R/D099S, A048V/G097L/A098G/D099S, A048V/G100R/S101G, A048V/G128S/P129L/Z129. 01G, M050I/A098G, S053F/S130I/S132G, S0053T/D099H/S101Z, E054D/A098R/D099G, T055I/S101R/Q103R, T055S/T066I/Z066. 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OlR/ P129S, G128H/Z128. 01R/P129S/A144T, G128H/Z129. 01R,128N/P129R/Z129. 01G, G128N/ P129R/Z129. 01R, G128N/P129S/Z129. 01D, G128N/Z128. 01R/P129S, G128R/P129G, G128R/ P129H/Z129. 01G, G128R/P129L/Z130. 01S, G128R/P129R, G128R/P129R/Z129. 01G, G128R/ P129R/Z129. 01G/A216V, G128R/P129S, G128R/P129S/Z129. 01G,128R/P129Z/S130R/S132G, G128R/Z128. 01R/P129D, G128R/Z128. 01R/P129F, G128S/P129C, G128S/P129C/Z129. 01R, G128S/P129D, G128S/P129D/S248R, G128S/P129D/T244N, G128S/P129G, G128S/P129G/ A187V, G128S/P129H/Z129. 01R, G128S/P129R/L209F, G128S/P129R/Z129. 001G, G128S/ P129S/Z129.01D, G128S/P129S/Z129.01R, G128S/P129V, G128Y/P129R/Z129.01G, Z128. 01G, Z128.01G/P129D, Z128. 01G/P129R, Z128. 01G/P129S/A134T, Z128. OlG/ Z128. 02G, Z128. 01R/P129D, Z128.01R/Z128. 02G/P129S, Z128.01R/Z128. 02H/P129G/ G160S, Z128.01R/Z128. 02R/P129D, Z128.01Y/Z128. 02H/P129R, P129C/S130C/S132Z, P129D/Z129.01G/Z129.02D/G160D, P129D/Z129.01G/Z129.02G, P129G/G131Z, P129G/ S130G/Z131. 01G, P129G/S130H/S132Z, P129G/S130R/S132Z, P129G/V270I, P129G/ Z129. 01G, P129G/Z129. 01R/Z129. 02G, P129H/G131Z, P129H/G131Z/S132C, P129H/G131Z/ S132H, P129H/S132Z, P129H/Z130.01D/Z130. 02S, P129R/G131Z/S132H, P129R/S130D/ S132Z, P129R/S130N/G131Z, P129R/S132T, P129R/S132Z, P129R/Z129.01G, P129R/ Z129.01G/Z129.02G, P129R/Z129.01G/Z129.02G/A144T, P129R/Z129. 01G/Z129.02G/ G146D, P129R/Z129. 01G/Z129.02R, P129R/Z129. 01G, P129R/Z129. 01R/Z129. 02G, P129S/ G131ZP129S/S130H/S132Z,P129S/Z129. 01C,P129S/Z129. 01R/Z129. 02S, P129S/Z130. OlN/ Z130. 02S, P129V/S132Z, P129Z, P129Z/G131R/S132C, P129Z/S130G, P129Z/S130G/G131H/ S132H, P129Z/S130G/G131V, P129Z/S130H, P129Z/S130H/S132G, P129Z/S130H/S132N, P129Z/S130L, P129Z/S130R, P129Z/S130R/G131C, P129Z/S130R/G131C, P129Z/S130R/ G131D/S132C, P129Z/S130R/G131H/A144E, P129Z/S130R/G131H/S132D, P129Z/S130R/ G131R/S132D, P129Z/S130R/L267M, P129Z/S130R/S132C, P129Z/S130R/S132G, P129Z/ S130V/S132G, P129Z/S130Z/G131N/S132G, S130D/G131C/S132D, S130D/G131R, S130D/ G131R/S132D, S130D/G131Z, S130D/G131Z/S132H, S130F/G131N/S132V, S130F/G131S/ S132V, S130F/S132V, S130G/G131D/S132C, S130G/G131H/S132D, S130G/G131S/S132I, S130G/S132G, S130H/G131C/S132G, S130H/G131H/S132R, S130H/G131R/S132C, S130H/ G131S, S130H/G131S/S132C, S130H/S132Z, S130I/G131S/S132H, S130I/S132G, S130N/ G131S/S132C, S130R/G131R/S132C, S130R/G131S/S132C/S161N, S130R/S132G, S130R/ S132G/S183N, S130R/S132Z, S130V/G131D/S132I, S130V/G131H/S132C, S130V/S132N, S130V/S132Z, S130Y/G131H/S132C, S130Y/S132G, S130Z/G131H/S132H, G131H/S132L/ W241R, G131N/S132C, G131S/S132G, G131Y/S132G 和 A142V/G211V，其中這些位置對(duì)應(yīng)于序 列為SEQ ID NO 2的BPN，枯草蛋白酶的位置。 本發(fā)明也還提供了包含至少一組修飾的枯草蛋白酶變體，其中所述修飾組選自V072G/G097A/G128A/Y217Q、G097A/G128S/Y217Q, G097A/G128S/P129D/Y217Q, G097A/ G128A/A134T/Y217Q, M124V/L126A/Y217Q, G097A/G128A/P129D/Y217Q/A232P, G097A/ G128A/P129D/Y217Q, G097A/G128S/P129V/A134T/Y217Q, G097A/G128S/P129V/Y217Q, V068I/G097A/G128S/P129D/Y217Q, G097A/S101D/G128S/S204F/Y217Q/S236F/T254P, G097A/S101D/G128S/Y217Q, G097A/G128A/P129V/Y217Q, G097A/S101D/G128A/Y217Q, G097A/S101D/G128S/P129D/Y217Q, G097A/S101D/G128A/A134T/Y217Q, G097A/Z099. OlS/ A114S/G128S/Y217Q, G097A/S101D/G128A/P194L/Y217Q, G097A/Z099. 01S/G128S/Y217Q, G097A/S101D/G128A/P129D/Y217Q, Q019R/G097A/Z099. 01S/G128S/P129D/Y217Q, G097A/ G100S/G128S/Y217Q, G097A/S101D/G128S/P129V/Y217Q, G097A/Z099. 01S/G128A/A134T/ Y217Q, G097A/G100S/I107V/G128S/P129D/Y217Q, G097A/G100S/G128S/Y217Q/A230V, G097A/G100S/G128A/Y217Q/K237N, G097A/Z099. 01S/G128S/P1291D/Y217Q, G097A/G100S/ G128S/P129D/Y217Q, Z096. 01D/G097A/A098R/G128A/Y217Q, G097A/Z099. 01S/I122S/ N123G/G128A/Y217Q, G097A/Z099. 01S/1122S/N123G/G128A/Y217Q/T220A/A232T, P005S/ G097A/Z099.01S/S101D/G128A/Y217Q, G097A/S101D/G128A/P129V/Y217Q, V093Z/K094S/ V095C/L096S/G097A/G128A/Y217Q, G097A/G100S/S101D/G128A/Y217Q/A232P, Z096. OlD/ G097A/A098R/S101D/G128A/Y217Q,和 G097A/Z099. 01S/G100S/G128A/Y217Q,其中這些位置對(duì)應(yīng)于序列SEQ ID NO 2的BPN，枯草蛋白酶的位置。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含至少一組修飾的枯草蛋白酶變體，其中所述修飾組選 自G097A/G128S/P129T/Y217Q、G097A/G128A/P129S/Y217Q, G097A/G128S/P129C/Y217Q, G097A/G128S/P129Q/Y217Q, G097A/G128S/P129E/Y217Q, G097A/P129S/Y217Q, G097A/ G128S/P129A/Y217Q, G097A/G128S/P129K/Y217Q, G097A/P129N/Y217Q, G097A/P129E/ Y217Q, G097A/G128S/P129K/G131S/Y217Q, G097A/G128S/P129R/Y217Q, G097A/G128S/ P129V/Y217Q, G097A/G128S/P129Y/Y217Q, G097A/G128A/P129R/Y217Q, G097A/G128H/ P129S/Y217Q, G097A/G128N/P129S/Y217Q/V270A, G097A/G128S/P129L/Y217Q, G097A/ P129R/Y217Q, G097A/P129W/Y217Q, G097A/P129Z/S130A/Y217Q, G097A/G128H/P129R/ Y217Q, G097A/G128H/P129T/Y217Q, G097A/P129G/Y217Q, G097A/G128N/P129A/Y217Q, G097A/G128H/Y217Q, G097A/G128S/P129W/Y217Q, G097A/P129Z/Y217Q, G097A/G128N/ Z128.01A/P129S/Y217Q, G097A/G128N/Y217Q, G097A/G128A/P129L/Y217Q, G097A/G128T/ P129N/Y217Q, G097A/G128H/P129A/Y217Q, G097A/G128M/P129R/Y217Q, G097A/G128Q/ P129K/Y217Q, G097A/G128T/P129Q/Y217Q, G097A/G128T/P129H/Y217Q, G097A/G128T/ P129R/Y217Q, G097A/G128D/P129E/Y217Q, G097A/G128T/P129T/Y217Q, G097A/G128T/ P129A/Y217Q, G097A/G128Z/P129Z/Y217Q, G097A/G128S/Z128. 01A/P129S/Y217Q, G097A/ G128N/P129M/Y217Q, G097A/G128N/P129V/Y217Q, G097A/G128E/P129K/Y217Q, G097A/ G128N/Z128. 01A/P129F/Y217Q, G097A/G128C/P129R/Y217Q, G097A/G128T/P129M/Y217Q, G097A/G128R/Z128. 01A/P129S/Y217Q, G097A/G128S/Z128.01A/P129A/Y217Q, G097A/ G128D/Y217Q, G097A/G128T/P129Y/Y217Q, G097A/G128R/P129S/Y217Q, G097A/G128R/ Z128.01A/P129T/Y217Q, G097A/G128R/Z128. 01A/P129A/Y217Q, G097A/G128T/P129W/ Y217Q, G097A/G128Y/Z128. 01A/P129R/Y217Q, G097A/G128C/P129D/Y217Q, V084L/G097A/ P129Z/Y217Q, G097A/G128R/P129D/Y217Q, G097A/G128A/Z128. 01A/P129H/E195A/Y217Q,G097A/G128S/Z128. 01A/P129Y/Y217Q, G097A/G128N/P129L/Y217Q, G097A/G128C/P129H/ Y217Q, G097A/G128T/Z128. 01A/P129T/Y217Q, G097A/G128C/Z128. 01A/P129A/Y217Q, G097A/G128S/Z128.01A/P129I/Y217Q, G097A/G128S/Z128. 01A/P129E/Y217Q/Q271H, G097A/G128S/Z128.01A/P129L/Y217Q, G097A/G128Y/Z128. 01A/P129S/Y217Q, G097A/ G128S/Z128.01A/P129M/R186H/Y217Q, G097A/G128E/Z128.01A/P129D/Y217Q, G097A/ G128T/P129L/Y217Q, G097A/C128F/P129D/Y217Q, G097A/G128V/Z128. 01A/P129R/Y217Q, G097A/G128L/Z128.01A/P129S/Y217Q, G097A/G128Y/P129T/Y217Q, G097A/G128C/P129Y/ Y217Q, G097A/G128C/P129T/Y217Q,其中這些位置對(duì)應(yīng)于序列號(hào)為SEQ ID NO 2的BPN，枯草蛋白酶的位置。本發(fā)明還提供了包含至少一組修飾的枯草蛋白酶變體，其中所述修飾組選自 G097A/G128A/Y217Q/M222Q、M124V/L126A/P129V/Y217Q, G128A/P129V/Y217Q, G097A/ G128A/P129V/Y217Q, N123G/P129V/Y217Q, V30I/Z096. 01D/G097A/A098R/G128A/Y217Q, Z096. 01D/A098R/G128A/Y217Q, Z096. 01D/A098R/M124V/L126A/Y217Q, G097A/Z098. OlS/ G128A/Y217Q, Z096.01D/A098R/N123G/Y217Q, Z096.01D/G097A/A098R/G128A/Y217Q/ S236F, Z098. 01S/M124V/L126A/Y217Q, Z098. 01S/G128A/Y217Q, Z096. 01D/G097A/A098R/ G128A/Y217Q, V0931/Z098. 01S/M124V/L126A/Y217Q, A073V/Z098. 01S/N123G/Y217Q, G065D/Z098. 01S/G128A/Y217Q, I011L/Z098. 01S/G128A/Y217Q, L082F/Z096. 01D/A098R/ N123G/Y217Q, Z098. 01S/N123G/A138V/Y217Q，和 Z098. 01S/N123G/Y217Q，其中這些位置對(duì) 應(yīng)于序列號(hào)為SEQ ID NO 2的BPN，枯草蛋白酶的位置。本發(fā)明還提供了包含取代Y217L和至少一組上述的任一修飾組的枯草蛋白酶變 體，其中的位置對(duì)應(yīng)于序列號(hào)為SEQ ID N0:2的BPN’枯草蛋白酶中的位置。本發(fā)明進(jìn)一步 提供了包含取代G97A/G128A/Y217Q并進(jìn)一步包含至少一種本文所述修飾組中任一修飾的 枯草蛋白酶變體，其中的位置對(duì)應(yīng)于序列號(hào)為SEQ ID N0:2的BPN’枯草蛋白酶中的位置。本發(fā)明還提供了包含至少一種本文所述枯草蛋白酶變體的清潔組合物。在一些 優(yōu)選的實(shí)施方式中，該清潔組合物是衣物洗滌劑。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，該衣物 洗滌劑是一種重垢液體衣物洗滌劑。在一些備選的實(shí)施方式中，該清潔組合物是一種餐 具洗滌劑。在一些進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該清潔組合物進(jìn)一步包括一種或多種選自下組 物質(zhì)的其它的酶或酶衍生物半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、脂肪 酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶(cutinase)、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加 氧酶、木質(zhì)素酶(Iigninase)、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶(pentosanase)、甘露聚糖酶 (malanases)、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和淀粉酶，或它們 的混合物。在一些另外的實(shí)施方式中，該清潔組合物還包括至少一種穩(wěn)定劑。在另外一些 實(shí)施方式中，清潔組合物包括至少0. 0001襯％的此處提供的任意枯草蛋白酶變體中的至少 一種，和可選的至少一種適宜的添加劑成分。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了清潔方法，該方法包括如下步驟使包括織物的 表面和/或物品與至少一種本文所述清潔組合物相接觸，和可選地洗滌和/或漂洗所述表 面或物品。本發(fā)明還提供了包含至少一種本發(fā)明所提供的枯草蛋白酶變體的動(dòng)物飼料，以及 包含至少一種本發(fā)明提供的枯草蛋白酶變體的食物加工組合物。


圖1為說明用于制備表達(dá)框內(nèi)缺失和插入的方法的示意圖。設(shè)計(jì)文庫，使其具有 33%的克隆具有取代、33%的克隆具有插入、33%的克隆具有缺失。圖2A :pAC-FNA10的質(zhì)粒圖譜。質(zhì)粒元件如下pUB110 =來自質(zhì)粒 pUBl 10 (McKenzie 等，Plasmid 15 :93_103 [1986])的 DNA 片段，pBR322 =來自質(zhì) 粒 pBR322 (Bolivar 等，Gene 2 :95_113[1977])的 DNA 片段，pC194 =來自質(zhì)粒 pC194 (Horinouchi 和 Weisblum，J. Bacteriol 150 :815_825 [1982])的 DNA 片段圖2B 提供了 pHPLT-FNA 的圖譜。圖2C提供了 pHPLT-BPN的圖譜。載體pHPLT包含LAT啟動(dòng)子(PLAT)、編碼LAT信 號(hào)肽的序列(preLAT)。復(fù)制原點(diǎn)和neoR來自質(zhì)粒pUBllO。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供枯草蛋白酶變體及包含至少一種此處所述枯草蛋白酶變體的組合物， 還提供了應(yīng)用這些變體和組合物的方法。用來產(chǎn)生這些變體枯草蛋白酶的本發(fā)明的蛋白酶 前體修飾包括至少一個(gè)取代、至少一個(gè)缺失或至少一個(gè)插入。在一些實(shí)施方式中，所述修飾 包括突變的組合。例如，在一些實(shí)施方式中，所述修飾包括至少一個(gè)取代和至少一個(gè)缺失的 組合。在其它一些實(shí)施方式中，所述修飾包括至少一個(gè)取代和至少一個(gè)插入的組合。在另 外一些實(shí)施方式中，所述修飾包括至少一個(gè)缺失和至少一個(gè)插入的組合。在又一些實(shí)施方 式中，所述修飾包括至少一個(gè)取代、至少一個(gè)缺失和至少一個(gè)插入的組合。產(chǎn)生本發(fā)明的修飾多核苷酸序列的一些適當(dāng)方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限 于位點(diǎn)飽和誘變技術(shù)、掃描誘變技術(shù)、插入誘變技術(shù)、缺失誘變技術(shù)、隨機(jī)誘變技術(shù)、定 點(diǎn)誘變技術(shù)和定向進(jìn)化技術(shù)，以及很多其它重組方法。常用的方法包括DNA改組(參見 Stemmer, Proc Natl Acad SciU S A. 25 10747-51 [1994])、基于基因非同源重組的方法 (例如 ITCHY) (Ostermeier 等，Bioorg Med Chem. 7 :2139_44[1999])、SCRACHY(Lutz 等 Proc Natl Acad Sci USA. 98 11248-53 [2001])、SHIPREC(Sieber 等，NatBiotechnol.， 19 456-60[2001])和 NRR(Bittker 等，Nat Biotechnol. ,20 1024-9[2001] ；Bittker 等，Proc Natl Acad Sci. USA. 101 7011-6[2004])以及依賴于用寡核苷酸隨機(jī)插入和靶 向突變、缺失和 / 或插入的方法(Ness 等，NatBiotechnol. 20 1251-5[2002] ；Coco 等， Nat Biotechnol. ,20 1246-50[2002] ；Zha 等，Chembiochem. 3 :34_9[2003]，Glaser 等， J Immunol. ,149 3903-13 [1992], Sondek 禾口 Shortle, Proc Natl Acad Sci USA 89: 3581-5 [1992] ,Ydftez等，Nucleic Acids Res.，32 :el58 [2004]，Osuna 等，Nucleic Acids Res. ,32 :el36[2004], Gaytan 等，Nucleic Acids Res. ,29 :E9[2001]，和 Gaytan 等， NucleicAcids Res.，30 :e84[2002])。在一些實(shí)施方式中，全長親本多核苷酸被連接到適宜表達(dá)質(zhì)粒上，接下來雖然也 可使用其它方法，但是誘變方法的應(yīng)用促進(jìn)了本發(fā)明修飾蛋白酶的構(gòu)建。本方法是基于 Pisarchik 等描述的方法(Pisarchik 等，Prot. Eng. Des. Select.，20 :257_265 [2007])。在 一些實(shí)施方式中，提供了另外的優(yōu)點(diǎn)，其中此處使用的限制性內(nèi)切酶在其識(shí)別序列的外側(cè) 切割，這使得幾乎任何核苷酸序列都可以消化，并避免了限制性酶切位點(diǎn)疤痕的形成。首先，如此處所述，獲得編碼全長蛋白酶的天然發(fā)生的基因并測序，掃描尋找在一個(gè)或多個(gè)氨 基酸處期望進(jìn)行突變(缺失、插入、取代，或它們的組合)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。為了改變基 因序列使其與所需序列一致的基因突變根據(jù)公知方法通過引物延長來完成。目標(biāo)突變位 點(diǎn)左右的片段通過PCR擴(kuò)增而且也包括Eamll04I限制性酶切位點(diǎn)。左邊和右邊的片段用 Eamll04I消化，產(chǎn)生多個(gè)具有互補(bǔ)的三堿基突出端的片段，然后合并并連接這些片段產(chǎn)生 包含一個(gè)或多個(gè)突變的經(jīng)修飾序列的文庫。這種方法避免了移碼突變的發(fā)生。另外，由于 所有的寡核苷酸能被合成以便有相同的限制位點(diǎn)，所以這種方法簡化了誘變形成，而且不 像一些其他方法那樣必需合成連接物來形成限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。組合物本發(fā)明提供蛋白酶變體及包含至少一種此處所述枯草蛋白酶變體的組合物。在一 些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)有多種商業(yè)用途的蛋白酶的方法，這些商業(yè)用途需要多 肽的分解或合成，包括清潔組合物，以及飼料成分、紡織品加工、皮革整理、谷物加工、肉類 加工、食物加工、蛋白質(zhì)水解物制備、助消化劑、殺微生物組合物、抑菌組合物、抑真菌組合 物，以及個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品(如口腔護(hù)理，頭發(fā)護(hù)理，和/或皮膚護(hù)理)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了與現(xiàn)在所應(yīng)用的枯草蛋白酶相比具有可比性或更好洗滌性 能的酶組合物。清潔組合物本發(fā)明的清潔組合物可以有利地應(yīng)用到例如洗衣用途。實(shí)際上，由于在較低溫溶 液中增強(qiáng)效果的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的酶理想地適合于洗衣應(yīng)用。此外，本發(fā)明的酶既可以用 于粒狀組合物，又可以用于液體組合物中。本發(fā)明的蛋白酶變體也可以應(yīng)用于衣物清潔添加劑產(chǎn)品中。在一些實(shí)施方式中， 可用于低溫溶液清潔用途。添加劑產(chǎn)品可以是其最簡單形式一種或多種蛋白酶。在一些 實(shí)施方式中，添加劑包裝為劑量形式，用于在清潔過程中添加。本發(fā)明還可以使用任何合適 的單一劑型，包括但不限于丸劑、片劑、軟膠囊或其他單一劑型單位如預(yù)先稱重的粉末或液 體。在一些實(shí)施方式中，包含填充劑或載體材料以增加這些組合物的體積。適當(dāng)?shù)奶畛鋭?或載體材料包括但不限于各種硫酸鹽、碳酸鹽和硅酸鹽以及滑石粉、粘土之類。液體組合物 的適當(dāng)填充劑或載體材料包括但不限于水或低分子量一級(jí)和二級(jí)醇，包括多元醇和二醇。 這些醇的例子包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇。在一些實(shí)施方式中，組合物包含約 5%-約90%這樣的材料。酸性填充劑用于降低pH。另外，清潔添加劑包括下面更全面描 述的添加劑成分。本發(fā)明的清潔組合物和清潔添加劑要求含有至少一種此處提供的有效劑量的蛋 白酶變體，該蛋白酶變體單獨(dú)或與其他蛋白酶和/或另外的酶組合。通過添加本發(fā)明的 一種或更多種的蛋白酶變體來達(dá)到所需的酶水平。通常本發(fā)明的清潔組合物包含至少約 0. OOOlwt %，從約0. OOOlwt %到約Iwt %，從約0. OOlwt %到約0. 5wt%，或甚至含有從約 0. 01wt%到約0. 的至少一種本發(fā)明的蛋白酶變體。此處的清潔組合物通常是這樣配制的在含水清潔操作的應(yīng)用中，洗滌水的pH值 為約5. 0至約11. 5或甚至約7. 5至約10. 5。液體產(chǎn)品制品被通常配制成具有約為3. 0至 9.0或甚至約3至5的凈pH值(neat pH)。粒狀洗衣產(chǎn)品被通常配制成具有大約為9_11 的PH值。控制pH在建議的使用水平的技術(shù)包括使用緩沖劑、堿、酸等，這些技術(shù)為本領(lǐng)域所公知。適合的低pH清潔組合物通常具有大約為3-5的凈pH，并且通常不含會(huì)在這樣的 PH環(huán)境中水解的表面活化劑。這些表面活化劑包括含有至少一個(gè)環(huán)氧乙烷部分或甚至大約 1-16摩爾環(huán)氧乙烷的烷基硫酸鈉表面活化劑。這些清潔組合物通常包含足量的pH調(diào)節(jié)劑， 如氫氧化鈉、單乙醇胺或鹽酸，來提供凈PH大約為3-5的清潔組合物。這些組合物通常包 含至少一種酸穩(wěn)定的酶。在一些實(shí)施方式中，組合物是液態(tài)的，而在其它的實(shí)施方式中，它 們是固態(tài)的。這種液體組合物的PH值通常測定為凈pH值。這種固體組合物的pH值是通 過測量所述組合物的10%固體溶液得到的pH值，所用溶劑是蒸餾水。在這些實(shí)施方式中， 所有的PH測量都在20°C進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)?shù)鞍酌缸凅w被應(yīng)用于粒狀組合物或液體中時(shí)，希望蛋白酶 變體是包封化的顆粒形式，以在存儲(chǔ)時(shí)保護(hù)蛋白酶變體不與該粒狀組合物的其它成分混 合。另外，包封化也是在清潔過程中控制蛋白酶變體有效性的一種方法。在一些實(shí)施方式 中，包封化強(qiáng)化了蛋白酶變體和/或添加的酶的性能。在這方面，本發(fā)明的蛋白酶變體用 本領(lǐng)域已知的任何適宜包封材料包封化。在一些實(shí)施方式中，包封材料通常至少包裹本發(fā) 明蛋白酶變體的部分催化劑。通常，包封化材料是水溶性的和/或水分散性的。在一些實(shí) 施方式中，包封化材料的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)為0°C或更高。在WO 97/11151中更詳細(xì)地 描述了玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。包封化材料選自下組中碳水化合物、天然或合成樹膠、幾丁質(zhì)、 殼聚糖、纖維素和纖維素衍生物、硅酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蠟和它們 的組合。當(dāng)包封化材料是碳水化合物時(shí)，它通常選自單糖、寡糖、多糖及其組合。通常包封 化材料是淀粉。適合的淀粉在 EP 0922499 ；US4, 977，252 ；US 5，354，559 和 US 5，935，826 中有描述。在一些實(shí)施方式中，包封化材料是一種塑料制成的微球，這些塑料如熱塑性塑 料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及它們的混合物；可使用的可商購的微球 包括以下所提供的EXPANCEL (Stockviksverken，瑞典)，和 PM6545、PM 6550、PM 7220、PM 7228、EXTENDOSPHERES 、LUXSIL 、Q-CEL 和SPHERICEL
(PQ Corp. , Valley Forge，ΡΑ)>。如此處所述，本發(fā)明的蛋白酶變體在衣物洗滌劑中有特殊用途。這些應(yīng)用使酶承 受了各種環(huán)境壓力。本發(fā)明的蛋白酶變體由于它們?cè)诟鞣N條件下的穩(wěn)定性所以比很多現(xiàn)在 應(yīng)用的酶更有優(yōu)勢(shì)。的確，存在涉及洗滌的蛋白酶暴露其中的多種洗滌條件，包括不同洗滌劑配方、洗 滌水容量、洗滌水溫度和洗滌時(shí)間長短。另外，在不同的地理區(qū)域應(yīng)用的洗滌劑配方在洗滌 水中的相關(guān)成分的濃度不同。例如，在洗滌水中，歐洲洗滌劑通常含有大約4500-5000ppm 洗滌劑成分，而日本洗滌劑通常含有大約667ppm洗滌劑成分。在北美尤其在美國，在洗滌 水中洗滌劑通常含有約975ppm的洗滌劑成分。低洗滌劑濃度系統(tǒng)在洗滌水中包含的洗滌劑要少于約SOOppm洗滌劑成分。通常 日本洗滌劑被認(rèn)為是低洗滌劑濃度系統(tǒng)，因?yàn)樵谙礈焖兴鼈兒写蠹s667ppm洗滌劑成 分。中洗滌劑濃度包括在洗滌水中包含約800ppm至約2000ppm之間的洗滌劑成分的 洗滌劑。通常北美洗滌劑被認(rèn)為是中等洗滌劑濃度系統(tǒng)，因?yàn)樵谙礈焖兴鼈兇蠹s含有 975ppm洗滌劑成分。巴西通常在洗滌水中含有大約1500ppm洗滌劑成分。
高洗滌劑濃度系統(tǒng)在洗滌水中包含的洗滌劑要大于約2000ppm洗滌劑成分。通常 歐洲洗滌劑被認(rèn)為是高洗滌劑濃度系統(tǒng)，因?yàn)樵谙礈焖兴鼈兒写蠹s4500-5000ppm洗 滌劑成分。拉丁美洲洗滌劑一般是高泡磷酸鹽增效洗滌劑(high suds phosphatebuilder detergent)，而且由于在洗滌水中含有的洗滌劑成分濃度范圍為1500ppm到6000ppm，所以 在拉丁美洲用的洗滌劑的范圍既落入中等洗滌劑濃度又落入高洗滌劑濃度范圍內(nèi)。如上所 述，巴西通常在洗滌水中含有大約1500ppm洗滌劑成分。但是，其它高泡磷酸鹽增效洗滌劑 地理區(qū)域不局限于其它拉丁美洲國家，在洗滌水中可含有高至大約6000ppm洗滌劑成分的 高洗滌劑濃度系統(tǒng)。根據(jù)上文所述，很明顯，世界范圍內(nèi)通常洗滌溶液中洗滌劑組合物濃度從低于約 800ppm的洗滌劑組合物(低洗滌劑濃度地理區(qū)域，如在日本，約667ppm)到約800ppm和約 2000ppm之間(中等洗滌劑濃度地理區(qū)域，如在美國大約975ppm，和在巴西約1500ppm)，到 高于約2000ppm(高洗滌劑濃度地理區(qū)域，如在歐洲約4500ppm到約5000ppm和在高泡磷酸 鹽增效洗滌劑地理區(qū)域的大約6000ppm)。通常的洗滌溶液濃度是由經(jīng)驗(yàn)決定的。例如，在美國通常一個(gè)洗衣機(jī)容納約 64. 4L洗滌溶液。相應(yīng)地，為了在洗滌溶液中獲得大約975ppm的洗滌劑濃度，必須添加大 約62. 97g洗滌劑組合物到64. 4L的洗滌溶液中。這個(gè)量是消費(fèi)者用與洗滌劑一起提供的 量杯量取到洗滌水中的常用量。作為另外的例子，不同的地理區(qū)域應(yīng)用不同的洗滌溫度。在日本的洗滌水溫度通 常低于在歐洲用的溫度。例如，在北美和日本的洗滌水溫度通常在10-30°C之間(例如大約 20V),而在歐洲洗滌水溫度通常在30-60°C (例如約40V )。作為另外的例子，不同的地理區(qū)域通常有不同的水硬度。水硬度通常按照每加 侖混合Ca27Mg2+微粒數(shù)描述。硬度是水中含有的鈣(Ca2+)和鎂(Mg2+)量的一種量度。在 美國大部分水是硬水，但是硬度不同。中等硬度水(60-120ppm)到硬水(121-181ppm)有 60-181ppm的硬礦物質(zhì)(百萬分率ppm與每美國加侖微粒數(shù)的轉(zhuǎn)換關(guān)系是ppm值除以17. 1 等于每加侖微粒數(shù)的值)。
水每加侖微粒數(shù)百萬分率PPm軟低于1.0低于17輕度硬1. 0-3. 517-60中度硬3. 5-7. 060-120硬7. 0-10. 5120-180
權(quán)利要求
1. 一種枯草蛋白酶變體，包括至少一個(gè)修飾，其中所述修飾選自G100C、S101D、 S101H、Q103D、M124G、L126G、S132H、S161N、Q275Z 和 / 或選自下列中的至少一組修飾 A001T/L096V/G097S/A098D/D099I, A001V/G097S/A098R/D099G, V004M/A098D/D099G, V004M/D099R/G100S/Z100. OIL, V004M/G127C/G128S/P129R, V004M/M119C/D120S, V008I/ A098G/D099R, V008I/A098N, V008I/M119C/D120G, Q010L/G097R/A098C/D099S, K012N/ A098R/D099V, K012R/G097D/A098H/D099G, A013T/S101R/Q103S, A013V/G097N/A098H/ D099G/G160S, A013V/G097S/Z097. 01R/A098R, A013V/G100R/S101G, A013V/N118G/M119I, A013V/P129Z/S1301I/S132G, P014L/N062D/S101R/Q103S, P014S/A098S/D099G, A015T/ V068N/A069G, L016M/G128R/P129R/Z129. 01G, H017Q/G127R/P129G, H017Y/A098R/D099I, H017Y/A098R/D099Z/S101G, H017Y/P129R, H017Y/S130Y/G131S/S132L, Q019H/G128R/ Z128. 01R/P129D, Q019H/Z128. 01G/Z128. 02G, G020D/G097R/A098G/D099C, G020D/P129Z/ S130G/G131R/S132C, N025Y/S101L/Q103N, A029V/G097R/A098S, S033I/T066G/H067R/ V068D/A216E, S038F/A098R/D099S, V044I/G097C/A098D/D099G, V044I/G097R/A098R, V044I/G100S/S101G, A045V/G097C/A098R/D099S, A048V/G097L/A098G/D099S, A048V/ G100R/S101G, A048V/G128S/P129L/Z129. 01G, M050I/A098G, S053F/S130I/S132G, S053T/ D099H/S101Z, E054D/A098R/D099G, T055I/S101R/Q103R, T055S/T066I/Z066.OlG/ Z066.02G, Q059H/D099S/S101G, Q059H/M119S/D120R, Q059K/M119V/V121C, Q059L/P129G, N061D/G128R/P129V/Z129.01G, S063T/G097D/A098R/D099S, G065R/Z101. 01R/Z101. 02G, T066S/H067S, V068C/A069G, V068C/A069G/H238Q, V068G/A069G, V068G/A069G/V150I, V068G/A069S, V068I/A069G/A144V, V068I/G097D/A098G/D099Z/G100R, V068L/A069G, V068L/A0698, V068S/A069G, V068S/A069G/A116T, A069G/T071G, A069G/T071I, L075G/ N076G/N077Z, L075R/N076G/N077Z, N076D/D099R/Z100. 01G,1079F/A098G, V081A/S101R/ Q103V, V081I/G097R/A098G/D099C, V084D/G097S/A098G/D099N, V084I/G127C/P129G, V084I/G127L, A085V/A098G, A085V/G097R/A098S/D099N, A085V/G128S/P129R/Z129. 01G, A085V/N218I, A085V/S101G, A085V/S204P, A085V/Z099. 01H/S101R, P086S/G131D/S132G, P086T/S101D/Q103S/V147I, A088S/S101R/Q103V, A088T/A098R/D099R, A088T/D099G/ Z100. 01G, A088T/G127N/P129R, A088T/G127S/P129R/Q206R/A273S, A088T/P129S/G146D, A088T/S101G, A088T/S130R/G131H/S132N, A088V/G100Z/S101C/Q103R, A088V/P129Z, A092G/S249R, A092G/V093C, A092G/V093I, A092G/V093L, A092L/V093G/K094Z, A092S/ K094V, A092S/V093C, A092S/V093G, A092S/V093S, A092V/V093L, V093I/G128D/P129R, V093I/P129Z, V093R/Z093. 01G/K094R, K094E/V095D, K094S/V1481, L096I/N118R/M119C/ D120G/A151V, Z096. 01D/A098R, Z096. 01H/A098G, Z096. 01N/A098H, Z096. 01R/A098C, Z096. 01R/A098G, Z096. 01R/A098G/V192I, Z096. 01R/A098R, Z096. 01R/A098R/V192A, Z096. 01R/A098S, Z096. 01R/A098S/G157S, Z096. 01R/Z096.02G, Z096. 01R/Z096. 02G/ V147I, Z096.01S/A098G, Z096.01S/A098N, G097C/A098D/D099S, G097C/A098G/D099G, G097C/A098G/D099N, G097C/A098G/D099S, G097C/A098G/D099S/G100Z, G097C/A098G/ D099V, G097C/A098N/D099S, G097C/A098R, G097C/A098R/D099G, G097C/A098R/D099H, G097C/A098R/D099H, G097C/A098R/D099N, G097C/A098R/D099R, G097C/A098R/D099R/ N109D/A114S, G097C/A0998S/D099H/A151V, G097C/A098V/D099S, G097C/Z097. 01G/A098H/T253I, G097C/Z097. 01S/A098G, G097D/A098C, G097D/A098G/D099G, G097D/A098G/D099R, G097D/A098H/D099R, G097D/A098H/D099V, G097D/A098R/D099G, G097D/A098R/D099R, G097D/A098R/D099S, G097D/A098R/D099Z, G097D/G100C/S101R, G097D/G100R/S101G, G097H/A098C/D099G, G097H/A098D/D099N, G097H/A098G, G097H/A098G/D099G, G097H/ A098G/D099R, G097H/A098G/D099Z, G097H/A098G/D099Z/A151V, G097H/A098G/D099Z/ G100R, G097H/A098G/D099Z/G100V, G097H/A098G/D099Z/S101N/G166S, G097H/A098R, G097H/A098R/F099G, G097H/A098R/D099L, G097H/A098R/D099N, G097H/A098S/D099G, G097H/A098S/D099I, G097H/A098S/D099L, G097H/A098S/D099S/K237E, G097L/A098C/ D099S, G097L/A098G/D099S, G097L/A098G/D099S/G100Z, G097L/A098G/D099Z, G097L/ A098H, G097L/A098R/D099N, G097L/A098V, G097N/A098G/D099C, G097N/A098G/D099R, G097N/A098G/D099R/V27 0I, G097N/A098G/D099S, G097N/A098G/D099V, G097N/A098G/ D099V/A151V, G097N/A098G/D099V/S101F, G097N/A098H/D099N, G097N/A098R/D099R, G097N/A098R/D099S, G097N/A098R/D099V, G097N/A098S/D099S, G097R/A098C, G097R/ A098C/D099S, G097R/A098F/A200V, G097R/A098G, G097R/A098G/D099C, G097R/A098G/ D099G, G097R/A098G/D099G/A273T, G097R/A098G/D099S, G097R/A098G/D099S/A133D, G097R/A098G/D099V, G097R/A098H/D099C/S182N, G097R/A098H/D099G, G097R/A098N/ D099G, G097R/A098N/D099Z, G097R/A098R, G097R/A098R/D099C, G097R/A098R/D099G, G097R/A098R/D099S, G097R/A098S/D099C, G097R/A098S/D099G, G097R/A098S/D099L, G097R/A098S/D099R, G097R/A098S/D099S, G097R/A098S/D099V, G097R/A098V/D099G, G097R/Z097. 01H/A098C, G097R/Z097. 01R/A098G, G097R/Z097. 01R/A098G/V147I, G097R/ Ζ097. 01R/A098S, G097R/Z097. OlR, G097R/Z097. 01S/A098G, G097R/Z097. 01S/A098R, G097S/A098C, G097S/A098C/D099G, G097S/A098C/D099H, G097S/A098C/D099L, G097S/ A098C/D099R, G097S/A098C/D099S, G097S/A098C/D099Z, G097S/A098G/D099F, G097S/ A098G/D099G, G097S/A098G/D099G, G097S/A098G/D099S, G097S/A098G/D099Z, G097S/ A098G/D099Z/G100R, G097S/A098H/D099C, G097S/A098H/D099G, G097S/A098N/D099G, G097S/A098R, G097S/A098R/D099C, G097S/A098R/D099G, G097S/A098R/D099L, G097S/ A098R/D099V, G097S/A098R/D099Y, G097S/A098S/D099G, G097S/A098S/D099G/A133V/ A153V/S236Y, G097S/A098S/D099G/A153V, G097S/A098S/D099Z, G097S/Z097. 01D/A098G/ A144T/Q271H, G097S/Z097. 01G/A098V, G097S/Z097. 01S/A098G, G097S/Z097. 01S/A098G/ Α273Τ, G097S/Z097. OlY, G097V/A098R, G097V/A098R/D099G, G097V/A098S/D099S, G097Y/ A098H/D099N, G097Z/A098S/D099H, Ζ097. 01D/A098R/D099G, Ζ097. 01D/A098S/D099L, Ζ097. 01D/A098V/D099G, Ζ097.OlG, Ζ097. 01G/A098G, Ζ097.01G/A098G/D099S, Ζ097. 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OlG/ Z127. 02H/P129D, Z127. 01G/Z127. 02H/P129G, Z127. 01G/Z127. 02H/P129R, Z12. 01H/G128C/ P129C/A230V, Z127. 01H/P129G, Z127. 01H/P129G/V148I, Z127. 01H/P12R, Z127. 01N/G128C/ P129V, Z127.01N/G128S/P129S Z127.01N/G128S/P129V, Z127.01N/P129R, Z127. OlR/ G128S/P129S, Z127.01R/P129G, Z127. 01S/P129D, Z127.01S/P129G, Z127.01S/P129R, G128D/P129G, G128D/P129R/Z129. OlR, G128D/P129S/G154S, G128H/P129C, G128H/P129H/ Z129.OlG, G128H/P129H/Z129. OlR, G128H/P129R, G128H/P129R/Z129. OlG, G128H/P129R/ Z129. OlR, G128H/P129S/Z129.OlG, G128H/P129S/Z129.OlR, G128H/P129S/Z129. OlR/ S248N, G128H/P129Y, G128H/Z128. 01R/P129D, G128H/Z128. 01R/P129S, G128H/Z128. OlR/ P129S/A144T, G128H/Z129. OlR,128N/P129R/Z129.OlG, G128N/P129R/Z129. 01RG128N/ P129S/Z129.OlD, G128N/Z128. 01R/P129S, G128R/P129G, G128R/P129H/Z129. OlG, G128R/ P129L/Z130.OlS, G128R/P129R, G128R/P129R/Z129. OlG, G128R/P129R/Z129. 01G/A216V, G128R/P129S, G128R/P129S/Z129. OlG,128R/P129Z/S130R/S132G, G128R/Z128. 01R/P129D, G128R/Z128. 01R/P129F, G128S/P129C, G128S/P129C/Z129. OlR, G128S/P129D, G128S/ P129D/S248R, G128S/P129D/T244N, G128S/P129G, G128S/P129G/A187V, G128S/P129H/ Z129. OlR, G128S/P129R/L209F, G128S/P129R/Z129. OlG, G128S/P129S/Z129.OlD, G128S/ P129S/Z129. OlR, G128S/P129V, G128Y/P129R/Z129. OlG, Z128.OlG, Z128.01G/P129D, Z128. 01G/P129R, Z128. 01G/P129S/A134T, Z128. 01G/Z128.02G, Z128. 01R/P129D, Z128.01R/Z128. 02G/P129S, Z128.01R/Z128. 02H/P129G/G160S, Z128.01R/Z128. 02R/ P129D, Z128.01Y/Z128. 02H/P129R, P129C/S130C/S132Z, P129D/Z129. 01G/Z129. 02D/ G160D, P129D/Z129. 01G/Z129. 02G, P129G/G131Z, P129G/S130G/Z131. OlG, P129G/S130H/ S132Z, P129G/S130R/S132Z, P129G/V270I, P129G/Z129. OlG, P129G/Z129. 01R/Z129. 02G,P129H/G131Z, P129H/G131Z/S132C, P129H/G131Z/S132H, P129H/S132Z, P129H/Z130. OlD/ Z130. 02S, P129R/G131Z/S132H, P129R/S130D/S132Z, P129R/S130N/G131Z, P129R/S132T, P129R/S132Z, P129R/Z129. OlG, P129R/Z129. 01G/Z129. 02G, P129R/Z129. 01G/Z129. 02G/ A144T, P129R/Z129. 01G/Z129. 02G/G146D, P129R/Z129. 01G/Z129. 02R, P129R/Z129. OlG, P129R/Z129. 01R/Z129. 02G, P129S/G131ZP129S/S130H/S132Z, P129S/Z129. OlC, P129S/ Z129. 01R/Z129. 02S, P129S/Z130. 01N/Z130.02S, P129V/S132Z, P129Z, P129Z/G131R/ S132C, P129Z/S10G,P129Z/S130G/G131H/S132H,P129Z/S130G/G131V,P129Z/S130H,P129Z/ S130H/S132G, P129Z/S130H/S132N, P129Z/S130L, P129Z/S130R, P129Z/S130R/G131C, P129Z/S130R/G131C, P129Z/S130R/G131D/S132C, P129Z/S130R/G131H/A144E, P129Z/ S130R/G131H/S132D, P129Z/S130R/G131R/S132D, P129Z/S130R/L267M, P129Z/S130R/ S132C, P129Z/S130R/S132G, P129Z/S130V/S132G, P129Z/S130Z/G131N/S132G, S130D/ G131C/S132D, S130D/G131R, S130D/G131R/S132D, S130D/G131Z, S130D/G131Z/S132H, S130F/G131N/S132V, S130F/G131S/S132V, S130F/S132V, S130G/G131D/S132C, S130G/ G131H/S132D, S130G/G131S/S132I, S130G/S132G, S130H/G131C/S132G, S130H/G131H/ S132R, S130H/G131R/S132C, S130H/G131S, S130H/G131S/S132C, S130H/S132Z, S130I/ G131S/S132H, S130I/S132G, S130N/G131S/S132C, S130R/G131R/S132C, S130R/G131S/ S132C/S161N, S130R/S132G, S130R/S132G/S183N, S130R/S132Z, S130V/G131D/S132I, S130V/G131H/S132C, S130V/S132N, S130V/S132Z, S130Y/G131H/S132C, S130Y/S132G, S130Z/G131H/S132H, G131H/S132L/W241R, G131N/S132C, G131S/S132G, G131Y/S132G 和 A142V/G211V，其中所述位置對(duì)應(yīng)于ΒΡΝ，枯草蛋白酶SEQ ID NO 2的位置。
2.一種枯草蛋白酶變體，包括至少一個(gè)修飾，其中所述修飾選自V072G/G097A/ G128A/Y217Q, G097A/G128S/Y217Q, G097A/G128S/P129D/Y217Q, G097A/G128A/A134T/ Y217Q, M124V/L126A/Y217Q, G097A/G128A/P129D/Y217Q/A232P, G097A/G128A/P129D/ Y217Q, G097A/G128S/P129V/A134T/Y217Q, G097A/G128S/P129V/Y217Q, V068I/G097A/ G128S/P129D/Y217Q, G097A/S101D/G128S/S204F/Y217Q/S236F/T254P, G097A/S101D/ G128S/Y217Q, G097A/G128A/P129V/Y217Q, G097A/S101D/G128A/Y217Q, G097A/S101D/ G128S/P129D/Y217Q, G097A/S101D/G128A/A134T/Y217Q, G097A/Z099. 01S/A114S/G128S/ Y217Q, G097A/S101D/G128A/P194L/Y217Q, G097A/Z099. 01S/G128S/Y217Q, G097A/ S101D/G128A/P129D/Y217Q, Q019R/G097A/Z099. 01S/G128S/P129D/Y217Q, G097A/G100S/ G128S/Y217Q, G097A/S101D/G128S/P129V/Y217Q, G097A/Z099. 01S/G128A/A134T/Y217Q, G097A/G100S/I107V/G128S/P129D/Y217Q, G097A/G100S/G128S/Y217Q/A230V, G097A/ G100S/G128A/Y217Q/K237N, G097A/Z099. 01S/G128S/P129D/Y217Q, G097A/G100S/G128S/ P129D/Y217Q, Z096.01D/G097A/A098R/G128A/Y217Q, G097A/Z099.01S/I122S/N123G/ G128A/Y217Q, G097A/Z099. 01S/1122S/N123G/G128A/Y217Q/T220A/A232T, P005S/G097A/ Z099.01S/S101D/G128A/Y217Q, G097A/S101D/G128A/P129V/Y217Q, V093Z/K094S/V095C/ L096S/G097A/G128A/Y217Q, G097A/G100S/S101D/G128A/Y217Q/A232P, Z096. 01D/G097A/ A098R/S101D/G128A/Y217Q，和 G097A/Z099. 01S/G100S/G128A/Y217Q，其中所述位置對(duì)應(yīng)于 BPN，的枯草蛋白酶SEQ ID NO 2的位置。
3.一種枯草蛋白酶變體，包括至少兩個(gè)修飾，其中所述修飾選自G097A/G128S/P129T/Y217Q, G097A/G128A/P129S/Y217Q, G097A/G128S/P129C/Y217Q, G097A/G128S/ P129Q/Y217Q, G097A/G128S/P129E/Y217Q, G097A/P129S/Y217Q, G097A/G128S/P129A/ Y217Q, G097A/G128S/P129K/Y217Q, G097A/P129N/Y217Q, G097A/P129E/Y217Q, G097A/ G128S/P129K/G131S/Y217Q, G097A/G128S/P129R/Y217Q, G097A/G128S/P129V/Y217Q, G097A/G128S/P129Y/Y217Q, G097A/G128A/P129R/Y217Q, G097A/G128H/P129S/Y217Q, G097A/G128N/P129S/Y217Q/V270A, G097A/G128S/P129L/Y217Q, G097A/P129R/Y217Q, G097A/P129W/Y217Q, G097A/P129Z/S130A/Y217Q, G097A/G128H/P129R/Y217Q, G097A/ G128H/P129T/Y217Q, G097A/P129G/Y217Q, G097A/G128N/P129A/Y217Q, G097A/G128H/ Y217Q, G097A/G128S/P129W/Y217Q, G097A/P129Z/Y217Q, G097A/G128N/Z128. OlA/ P129S/Y217Q, G097A/G128N/Y217Q, G097A/G128A/P129L/Y217Q, G097A/G128T/P129N/ Y217Q, G097A/G128H/P129A/Y217Q, G097A/G128M/P129R/Y217Q, G097A/G128Q/P129K/ Y217Q, G097A/G128T/P129Q/Y217Q, G097A/G128T/P129H/Y217Q, G097A/G128T/P129R/ Y217Q, G097A/G128D/P129E/Y217Q, G097A/G128T/P129T/Y217Q, G097A/G128T/P129A/ Y217Q, G097A/G128Z/P129Z/Y217Q, G097A/G128S/Z128. 01A/P129S/Y217Q, G097A/G128N/ P129M/Y217Q, G097A/G128N/P129V/Y217Q, G097A/G128E/P129K/Y217Q, G097A/G128N/ Ζ128.01A/P129F/Y217Q, G097A/G128C/P129R/Y217Q, G097A/G128Τ/Ρ129Μ/Υ217Q, G097A/ G128R/Z128. 01A/P129S/Y217Q, G097A/G128S/Z128.01A/P129A/Y217Q, G097A/G128D/ Y217Q, G097A/G128T/P129Y/Y217Q, G097A/G128R/P129S/Y217Q, G097A/G128R/Z128. OlA/ P129T/Y217Q, G097A/G128R/Z128. 01A/P129A/Y217Q, G097A/G128T/P129W/Y217Q, G097A/ G128Y/Z128. 01A/P129R/Y217Q, G097A/G128C/P129D/Y217Q, V084L/G097A/P129Z/Y217Q, G097A/G128R/P129D/Y217Q, G097A/G128A/Z128. 01A/P129H/E195A/Y217Q, G097A/G128S/ Ζ128.01A/P129Y/Y217Q, G097A/G128N/P129L/Y217Q, G097A/G128C/P129H/Y217Q, G097A/ G128T/Z128.01A/P129T/Y217Q, G097A/G128C/Z128.01A/P129A/Y217Q, G097A/G128S/ Ζ128.01A/P129I/Y217Q, G097A/G128S/Z128.01A/P129E/Y217Q/Q271H, G097A/G128S/ Ζ128. 01A/P129L/Y217Q, G097A/G128Y/Z128. 01A/P129S/Y217Q, G097A/G128S/Z128. OlA/ P129M/R186H/Y217Q, G097A/G128E/Z128. 01A/P129D/Y217Q, G097A/G128T/P129L/ Y217Q, G097A/G128F/P129D/Y217Q, G097A/G128V/Z128. 01A/P129R/Y217Q, G097A/G128L/ Ζ128. 01A/P129S/Y217Q, G097A/G128Y/P129T/Y217Q, G097A/G128C/P129Υ/Υ217Q, G097A/ G128C/P129T/Y217Q，其中所述位置對(duì)應(yīng)于ΒΡΝ，枯草蛋白酶SEQ IDNO 2的位置。
4. 一種枯草蛋白酶變體，包括至少兩個(gè)修飾，其中所述修飾選自G097A/G128A/ Y217Q/M222Q, Ml24V/L126A/P129V/Y217Q, G128A/P129V/Y217QG097A/G128A/P129V/Y217Q, N123G/P129V/Y217Q, V30I/Z096. 01D/G097A/A098R/G128A/Y217Q, Z096. 01D/A098R/G128A/ Y217Q, Z096. 01D/A098R/M124V/L126A/Y217Q, G097A/Z098. 01S/G128A/Y217Q, Z096. OlD/ A098R/N123G/Y217Q, Z096.01D/G097A/A098R/G128A/Y217Q/S236F, Z098.01S/M124V/ L126A/Y217Q, Z098.01S/G128A/Y217Q, Z096.01D/G097A/A098R/G128A/Y217Q, V093I/ Z098.01S/M124V/L126A/Y217Q, A073V/Z098. 01S/N123G/Y217Q, G065D/Z098. 01S/G128A/ Y217Q, I011L/Z098. 01S/G128A/Y217Q, L082F/Z096. 01D/A098R/N123G/Y217Q, Z098. OlS/ N123G/A138V/Y217Q,Z098. 01S/m23G/Y217Q，其中所述位置對(duì)應(yīng)于ΒΡΝ，枯草蛋白酶SEQ ID NO 2的位置。
5.一種枯草蛋白酶變體，包括取代Y217L，而且進(jìn)一步包括權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)中定義 的至少一個(gè)修飾，其中所述位置對(duì)應(yīng)于BPN，枯草蛋白酶SEQ ID NO :2的位置。
6.一種枯草蛋白酶變體，包括取代G97A/G128A/Y217Q，而且進(jìn)一步包括權(quán)利要求1_4 任一項(xiàng)中定義的至少一個(gè)修飾，其中所述位置對(duì)應(yīng)于BPN’枯草蛋白酶SEQ ID N0:2的位置。
7.一種清潔組合物，包括至少一種如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的枯草蛋白酶變體。
8.如權(quán)利要求7所述的清潔組合物，其中所述清潔組合物為衣物洗滌劑。
9.如權(quán)利要求8所述的衣物洗滌劑，其中所述衣物洗滌劑是強(qiáng)效液體衣物洗滌劑。
10.如權(quán)利要求7所述的清潔組合物，其中所述清潔組合物為餐具洗滌劑。
11.如權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)所述的清潔組合物，進(jìn)一步包括一種或多種其它酶或酶 衍生物，所述酶或酶衍生物選自下組中半纖維素酶、過氧化物酶、蛋白酶、纖維素酶、木聚 糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角質(zhì)酶、果膠酶、角蛋白酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧 酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、B-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透 明質(zhì)酸酶、軟骨素酶、漆酶和淀粉酶，或它們的混合物。
12.如權(quán)利要求7-11中任一項(xiàng)所述的清潔組合物，進(jìn)一步包括至少一種穩(wěn)定劑。
13.一種清潔組合物，包括至少0. 0001重量百分比的至少一種如權(quán)利要求1-7中任一 項(xiàng)所述的枯草蛋白酶變體，和可選的至少一種適宜的添加劑成分。
14.一種清潔的方法，所述方法包括步驟a)將包括織物的表面和/或物品與如權(quán)利要求7-13中任一項(xiàng)所述的清潔組合物相接 觸；和b)可選地洗滌和/或漂洗所述表面或物品。
15.一種動(dòng)物飼料，包括至少一種如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的枯草蛋白酶變體。
16.一種食物加工組合物，包括至少一種如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的枯草蛋白酶變體。
全文摘要
本發(fā)明提供了枯草蛋白酶變體和包括至少一種此處所述的枯草蛋白酶變體的組合物，以及使用這些變體和組合物的方法。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了適用于衣物清潔應(yīng)用的蛋白酶變體。
文檔編號(hào)A23K1/165GK102112607SQ200980130352
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2009年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月6日
發(fā)明者A·比薩奇科, J·T·小凱利斯, L·G·卡斯康-佩雷拉, V·Y·阿列克謝耶夫 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國公司