本發(fā)明屬于兩棲類生物工程，具體涉及一種簡化的以牛蛙皮為原料提取制備高純度膠原蛋白的新方法。

背景技術(shù)：

1、膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的主要成分，廣泛分布在生物體中，在動物體內(nèi)占比最高，是含量最高的具有三維高級結(jié)構(gòu)的大分子蛋白。目前，已知的膠原蛋白類型共29種，不同組織中分布著不同類型的膠原蛋白。i型膠原蛋白主要存在于動物體的骨骼、皮膚、韌帶、肌腱、角膜等組織中，是所有膠原蛋白類型中，最常見、含量最高、分布最豐富的一類。

2、膠原蛋白作為擁有三螺旋結(jié)構(gòu)的功能性結(jié)構(gòu)蛋白，具有無毒、低致敏性、良好的生物相容性和可降解性等生物特性，可通過自我組裝和交聯(lián)形成具有一定的抗張強度和穩(wěn)定性的膠原纖維，作為制備具有多種生物學功能的生物材料，廣泛應用于醫(yī)療和生物工程材料等領域。

3、目前，?用于臨床的膠原蛋白類產(chǎn)品主要是陸生動物來源的，但隨著口蹄疫、瘋牛病等人畜共患病的頻繁發(fā)生，使得陸生動物來源膠原蛋白應用的安全性問題不斷被提出和質(zhì)疑。另外，因為動物保護等因素的困擾，大幅度限制了陸生動物來源膠原蛋白的應用范圍。相較陸生動物，水生生物的生存環(huán)境相對潔凈，在病毒攜帶、交叉?zhèn)魅镜蕊L險控制方面要比陸生動物更加安全，具有明顯的優(yōu)勢；另外，應用范圍更加廣泛，因此選用水生動物作為提取天然膠原蛋白的來源是十分可行的。

4、牛蛙屬于兩棲綱、無尾目、蛙科，因其肉質(zhì)細嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，深受消費者的喜愛，已成為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖重要的水產(chǎn)品之一。食用牛蛙將產(chǎn)生大量的蛙皮副產(chǎn)物，其附加值較低，因此建立蛙皮膠原蛋白生產(chǎn)工藝，制備高品質(zhì)蛙皮膠原蛋白，既保護環(huán)境、減少浪費，也提高了牛蛙的附加值。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在提供一種簡化的以牛蛙皮為原料提取膠原蛋白的方法，此方法膠原蛋白提取率高，質(zhì)量好，可以應用于醫(yī)療和生物工程材料領域，具有良好的工業(yè)化前景。

2、技術(shù)方案

3、一種高效提取制備牛蛙皮膠原蛋白的新方法。

4、1）將新鮮牛蛙皮清洗干凈，攪碎、勻漿。

5、2）堿處理同時除去油脂和雜蛋白：將上述1）中的牛蛙皮勻漿用堿溶液攪拌浸泡24-48小時，每隔24小時更換一次堿液；用純水洗滌至中性，過濾。

6、3）酸酶法提取膠原蛋白。將上述2）中堿處理后的牛蛙皮用胃蛋白酶和乙酸溶液提取膠原蛋白，料液比為1:10-1:50（w/v）；胃蛋白酶量為5-50u/g，處理溫度為20-25℃?,處理時間24-48h；離心或過濾，得膠原蛋白提取液。

7、4）堿沉法純化膠原蛋白。將上述3）中酸酶法提取的膠原蛋白用naoh溶液調(diào)節(jié)ph到8-11，靜置沉淀大分子可溶性及含色素的非膠原蛋白。離心或過濾除去沉淀，得到純化的膠原蛋白提取液。

8、5）膜濃縮、冷凍干燥膠原蛋白。將上述4）中得到的純化后的膠原蛋白提取液用膜濃縮儀濃縮、真空冷凍干燥，得到高純度的膠原蛋白粉。

9、更進一步的，1）中所述蛙皮攪碎、勻漿選擇的是切割機、破壁機、膠磨機等。

10、更進一步的，2）中所述堿液為0.1mol/l的naoh溶液，堿液體積與物料質(zhì)量比例為6:1。

11、更進一步的，3）中所述料液比為1:20，乙酸濃度為0.6mol/l，胃蛋白酶量為5u/g，提取溫度為25℃，提取時間為24h。

12、更進一步的，4）中所述naoh溶液濃度為10?mol/l。

13、更進一步的，5）中所述超濾膜濃縮為截留分子量50~100?kda的膜濃縮。

14、更進一步的，5）所述的冷凍干燥為-50℃下冷凍干燥48h。

15、有益效果

16、1）本發(fā)明提供一種高度簡化的以牛蛙皮為原料提取制備膠原蛋白的新方法，本方法能極大程度的除去非膠原蛋白及色素，產(chǎn)品色白質(zhì)優(yōu)，所制得的膠原蛋白保留了膠原蛋白特有的三螺旋結(jié)構(gòu)，保證膠原蛋白的完整結(jié)構(gòu)和活性。

17、2）本發(fā)明，用堿處理同時除去油脂和雜蛋白。傳統(tǒng)的方法是用有機溶劑除去油脂，再用堿溶液除去雜蛋白。本發(fā)明的提取和制備方法將去油脂和去雜蛋白一步完成。即用堿溶液將油脂皂化，皂化后的油脂溶于堿溶液而除去，堿溶液同時也將雜蛋白除去。

18、3）本發(fā)明，用堿沉法除去酶解液中的大分子非膠原蛋白、含色素的蛋白質(zhì)等雜蛋白，可獲得高純度的膠原蛋白。較傳統(tǒng)的鹽析法，簡單、高效。

技術(shù)特征：

1.一種簡化的提取制備牛蛙皮膠原蛋白的新方法，其特征在于：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種簡化的提取制備牛蛙皮膠原蛋白的新方法，其特征在于，步驟2）中所述堿溶液為0.05~0.2mol/l的naoh溶液，堿液體積與物料質(zhì)量比例為5~10?:1（v/w）。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種簡化的提取制備牛蛙皮膠原蛋白的新方法，其特征在于，步驟3）所述料液比為1:10~50（w/v），胃蛋白酶量為5~50?u/g，提取溫度25℃，提取時間24~48h，乙酸濃度為0.2~1.0?mol/l。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種簡化的提取制備牛蛙皮膠原蛋白的新方法，其特征在于，步驟4）中所述堿溶液為10?mol/l的naoh溶液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種簡化的提取制備牛蛙皮膠原蛋白的新方法，其特征在于，步驟5）所述超濾膜為截留分子量50~100?kda的濾膜。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種簡化的提取制備牛蛙皮膠原蛋白的新方法，其特征在于，步驟5）所述的冷凍干燥為-50℃下冷凍干燥48h。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種以牛蛙皮為原料高效提取制備膠原蛋白的新方法。其過程包括以下步驟。1）牛蛙皮經(jīng)除雜、清洗、切碎、勻漿后，用堿溶液攪拌浸泡處理，除去其中的油脂和非膠原蛋白，用純水洗滌至中性。2）用胃蛋白酶和乙酸溶液水解，過濾，得膠原蛋白水解液。3）用堿沉法沉淀除去膠原蛋白水解液中的大分子和含色素的非膠原蛋白，離心或過濾得到膠原蛋白提取液。4）膜濃縮膠原蛋白提取液、冷凍干燥，得到高純度的膠原蛋白粉。

技術(shù)研發(fā)人員：張培,張文龍,劉海,李海航,張琳琳,儲智勇,葉建華,錢曉明
受保護的技術(shù)使用者：中洋生物科技（上海）股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/19