本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料，更具體地說涉及一種用于椎間盤再生的自凝膠透明質(zhì)酸基物理交聯(lián)水凝膠及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、髓核切除術(shù)和椎間盤融合術(shù)一直被認(rèn)為是治療退變性椎間盤的金標(biāo)準(zhǔn)，然而，實(shí)施髓核切除術(shù)和椎間盤融合術(shù)之后椎間盤的生物力學(xué)失穩(wěn)會造成纖維環(huán)或相鄰錐骨的應(yīng)力集中，導(dǎo)致?lián)p傷的椎間盤退變加速，髓核的再突出或相鄰椎間盤突出。如何恢復(fù)受損椎間盤的生物功能仍然是臨床上的一個難題。

2、由于透明質(zhì)酸和髓核組織相似的優(yōu)異的水化能力，透明質(zhì)酸基水凝膠已被廣泛的應(yīng)用于退變性椎間盤的治療。然而，遺憾的是，盡管已經(jīng)構(gòu)建了多種基于透明質(zhì)酸的水凝膠，但它們中的大多數(shù)不適合用于髓核再生。例如，由甲基丙烯?；该髻|(zhì)酸(hama)制備的紫外光交聯(lián)水凝膠易碎且難以通過注射器注射；醛基改性的透明質(zhì)酸(ha-adh)可以通過希夫堿反應(yīng)形成水凝膠，并且對組織表現(xiàn)出良好的粘附性，但過量的醛基可能會誘發(fā)細(xì)胞毒性和生物副作用。此外，還可以在酸性環(huán)境中通過凍融循環(huán)制備透明質(zhì)酸物理凝膠，但由于苛刻的制備條件，透明質(zhì)酸冷凍物理凝膠在細(xì)胞輸送中的應(yīng)用受到限制。

3、目前關(guān)于使用透明質(zhì)酸溶液負(fù)載間充質(zhì)干細(xì)胞治療退變性椎間盤的細(xì)胞療法的研究已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段。然而，植入的外源性干細(xì)胞的失巢凋亡以及低的細(xì)胞存活率對退變性椎間盤的臨床治療療效提出了重大挑戰(zhàn)。在椎間盤退變的早期，椎間盤中的惡劣微環(huán)境因素，如炎癥，缺氧和酸性環(huán)境等均可進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞損傷，比如程序性細(xì)胞死亡、炎癥的加劇和神經(jīng)長入等，進(jìn)一步加劇椎間盤的退變進(jìn)程。并且，透明質(zhì)酸溶液載體的液體狀態(tài)會造成不可避免的細(xì)胞泄露，從而導(dǎo)致骨贅的生成。

4、因此，對于退變性椎間盤的治療，設(shè)計(jì)一種能夠調(diào)節(jié)退變部位的微環(huán)境并確保補(bǔ)充的外源細(xì)胞的活力的細(xì)胞遞送系統(tǒng)至關(guān)重要。并且，為了確保封裝的細(xì)胞能夠準(zhǔn)確的存留在被植入部位，該遞送系統(tǒng)還需要具有適當(dāng)粘彈性和粘附性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，比如現(xiàn)有的椎間盤再生支架材料存在水化能力差，生物活性低，難以適應(yīng)退變性椎間盤微環(huán)境，進(jìn)而難以保證外源性細(xì)胞活性，恢復(fù)椎間盤生物力學(xué)功能的問題。提供了一種自凝膠透明質(zhì)酸基物理交聯(lián)水凝膠及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明制備方法簡單，通過在透明質(zhì)酸上接枝胸腺嘧啶實(shí)現(xiàn)了氫鍵驅(qū)動的自凝膠化的透明質(zhì)酸物理凝膠。物理交聯(lián)保留了透明質(zhì)酸優(yōu)異的水化能力，并且賦予凝膠可注射性和粘附性，無機(jī)納米粒子二氧化錳的摻雜提高了凝膠在惡劣環(huán)境下的適應(yīng)性。通過這種方法制備得到的椎間盤再生支架(hatmn-mscs)能夠有效的提高補(bǔ)充的外源性干細(xì)胞的存活率，恢復(fù)椎間盤的生物力學(xué)功能，通過動物實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了其在椎間盤再生方面的應(yīng)用潛能。

2、本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。

3、一種自凝膠透明質(zhì)酸基物理交聯(lián)水凝膠及其制備方法，按照下述步驟進(jìn)行：

4、步驟1，將透明質(zhì)酸鈉粉末(ha)溶于超純水中，待其完全溶解后，依次加入碳酸二酰肼、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)、1-羥基苯并三唑(hobt)，反應(yīng)24-96h后，將反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移至透析袋中，透析凍干得到酰肼化透明質(zhì)酸(ha-hyd)；

5、其中，透明質(zhì)酸的分子量為2-10w，反應(yīng)體系中透明質(zhì)酸的濃度為5‰-15‰，碳酸二酰肼、透明質(zhì)酸鈉、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)、1-羥基苯并三唑(hobt)的物質(zhì)的量比為(1-5)：(1-3)：1：2；

6、步驟2，將步驟1制備得到的酰肼化透明質(zhì)酸(ha-hyd)溶于超純水中，待其完全溶解后，依次加入胸腺嘧啶-1乙酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)、n-羥基丁二酰亞胺(nhs)，調(diào)節(jié)上述反應(yīng)體系的ph至4-7，反應(yīng)12-72h后，將反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移至透析袋中，透析并凍干得到胸腺嘧啶接枝的透明質(zhì)酸(hat)；

7、其中，反應(yīng)體系中酰肼化透明質(zhì)酸的濃度為5‰-2％，酰肼化透明質(zhì)酸、胸腺嘧啶-1乙酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)、n-羥基丁二酰亞胺(nhs)的質(zhì)量比為(1-5)：(1-3)：1：1；

8、步驟3，將步驟2制備得到的胸腺嘧啶改性的透明質(zhì)酸溶于pbs緩沖液中，渦漩均質(zhì)，室溫靜置后，得到胸腺嘧啶-透明質(zhì)酸水凝膠(hat)，即自凝膠透明質(zhì)酸基物理交聯(lián)水凝膠；

9、其中，胸腺嘧啶-透明質(zhì)酸的濃度為1-20％。

10、在步驟1中，透明質(zhì)酸(ha)的分子量為5w，反應(yīng)體系中透明質(zhì)酸的濃度為8‰，碳酸二酰肼、透明質(zhì)酸鈉、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)、1-羥基苯并三唑(hobt)的物質(zhì)的量比為2：1：1：2，反應(yīng)在25℃下進(jìn)行48h。

11、在步驟2中，反應(yīng)體系中酰肼化透明質(zhì)酸的濃度為1％，反應(yīng)在25℃下進(jìn)行24h，反應(yīng)體系的ph為4.75，酰肼化透明質(zhì)酸、胸腺嘧啶-1乙酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(edc·hcl)、n-羥基丁二酰亞胺(nhs)的質(zhì)量比為2：1：0.1：0.1。

12、在步驟3中，胸腺嘧啶-透明質(zhì)酸的濃度為5％。

13、其中，胸腺嘧啶-透明質(zhì)酸(hat)能夠在沒有交聯(lián)劑的情況下，通過氫鍵驅(qū)動自發(fā)形成物理凝膠；凝膠的儲能模量為40-2000pa；5％的胸腺嘧啶-透明質(zhì)酸(hat)水凝膠的水化能力在0.3、1.1、2.5、4.4、6.9atm的滲透壓下分別為20.79±2.76、17.28±1.36、7.07±0.29、4.73±0.07、3.78±0.31g?h2o/g，黏附強(qiáng)度為1-3kpa。

14、自凝膠透明質(zhì)酸基物理交聯(lián)水凝膠支架，利用上述制備得到的自凝膠透明質(zhì)酸基物理交聯(lián)水凝膠與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合形成自凝膠透明質(zhì)酸基物理交聯(lián)水凝膠支架(hat-mscs)。

15、一種二氧化錳摻雜的自凝膠透明質(zhì)酸基物理交聯(lián)水凝膠及其制備方法，在步驟3中，將步驟2制備得到的胸腺嘧啶改性的透明質(zhì)酸溶于分散有二氧化錳的pbs緩沖液中，渦漩均質(zhì)，室溫靜置后，得到二氧化錳摻雜的胸腺嘧啶-透明質(zhì)酸水凝膠(hatmn)，即二氧化錳摻雜的自凝膠透明質(zhì)酸基物理交聯(lián)水凝膠；

16、其中，分散有二氧化錳的pbs緩沖液中，二氧化錳的濃度為100μg/ml-500μg/ml。

17、在步驟3中，分散有二氧化錳的pbs緩沖液中，二氧化錳的濃度為200μg/ml。

18、二氧化錳摻雜的自凝膠透明質(zhì)酸基物理交聯(lián)水凝膠支架，利用上述制備得到的二氧化錳摻雜的自凝膠透明質(zhì)酸基物理交聯(lián)水凝膠與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞摻雜形成二氧化錳摻雜的自凝膠透明質(zhì)酸基物理交聯(lián)水凝膠支架(hatmn-mscs)。

19、自凝膠透明質(zhì)酸基物理交聯(lián)水凝膠、自凝膠透明質(zhì)酸基物理交聯(lián)水凝膠支架、二氧化錳摻雜的自凝膠透明質(zhì)酸基物理交聯(lián)水凝膠或者二氧化錳摻雜的自凝膠透明質(zhì)酸基物理交聯(lián)水凝膠支架在生物醫(yī)用材料上的應(yīng)用，尤其是用于椎間盤再生的醫(yī)用材料。

20、本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明制備方法簡單，通過在透明質(zhì)酸上接枝胸腺嘧啶實(shí)現(xiàn)了氫鍵驅(qū)動的自凝膠化的透明質(zhì)酸物理凝膠，物理交聯(lián)保留了凝膠的水化能力，并且賦予凝膠可注射性和粘附性，無機(jī)納米粒子二氧化錳的摻雜用于提高凝膠在惡劣環(huán)境下的適應(yīng)性。通過這種方法制備得到的椎間盤再生支架(hatmn-mscs)能夠有效的提高補(bǔ)充的外源性干細(xì)胞的存活率，恢復(fù)椎間盤的生物力學(xué)功能，動物實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)其在椎間盤再生方面的應(yīng)用潛能。