本申請(qǐng)涉及核酸提取，具體而言，涉及一種核酸提取試劑、核酸檢測(cè)試劑盒和方法。

背景技術(shù)：

1、長(zhǎng)片段基因組dna分子的制備在生物學(xué)領(lǐng)域，特別是dna測(cè)序和基因組組裝中有著廣泛的需求。smrt長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)對(duì)于單分子測(cè)序長(zhǎng)度可達(dá)60-100kb，而納米孔測(cè)序技術(shù)則可檢測(cè)長(zhǎng)達(dá)mb級(jí)別的單分子dna片段。測(cè)序技術(shù)和光學(xué)圖譜等技術(shù)的發(fā)展，對(duì)簡(jiǎn)單快速地提取長(zhǎng)片段基因組dna分子有了更高的需求。然而，長(zhǎng)片段基因組dna提取時(shí)存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜且易分解的問題。

2、如何提取長(zhǎng)片段基因組dna是核酸制備的難點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)片段基因組dna直擴(kuò)，本申請(qǐng)的第一目的在于提供一種核酸擴(kuò)增試劑盒，包括核酸提取試劑，核酸提取試劑包括以下組分：tris-hcl、nacl、三亞乙基四胺、二硫蘇糖醇和表面活性劑；其中，tris-hcl的工作濃度為0.05～0.2mol/l；nacl的工作濃度為120～140mm；三亞乙基四胺的工作濃度為80～110mm；二硫蘇糖醇的工作濃度為3～6mm；表面活性劑的體積分?jǐn)?shù)為0.1％～0.5％。

2、本申請(qǐng)采用高濃度的氯化鈉、三亞乙基四胺、二硫蘇糖醇和表面活性劑組合使用，使得核酸樣本中的細(xì)胞可快速裂解并釋放高濃度的核酸，釋放的核酸能夠保持一定的穩(wěn)定性，并且滿足后續(xù)長(zhǎng)片段擴(kuò)增子直擴(kuò)的濃度要求；同時(shí)三亞乙基四胺可以快速結(jié)合細(xì)胞中的蛋白雜質(zhì)，如血紅蛋白、細(xì)胞碎片、蛋白等，使其不會(huì)抑制dna聚合酶的活性。

3、在其中一個(gè)實(shí)施例中，核酸提取試劑滿足以下條件(1)～(2)中的至少一種：

4、(1)核酸提取試劑的ph＝7～9；

5、(2)表面活性劑包括triton-x10、np-40、triton?x-100、sds和ctab中的至少一種。

6、在其中一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒還包括長(zhǎng)片段核酸擴(kuò)增試劑，長(zhǎng)片段核酸擴(kuò)增試劑包括長(zhǎng)片段核酸擴(kuò)增引物組。

7、在其中一個(gè)實(shí)施例中，長(zhǎng)片段核酸擴(kuò)增引物組包括hba2引物對(duì)、α3.7引物對(duì)、α4.2引物對(duì)、sea引物對(duì)、thai引物對(duì)和hbb引物對(duì)；

8、hba2引物對(duì)包括如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的序列；

9、α3.7引物對(duì)包括如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示的序列；

10、α4.2引物對(duì)包括如seq?id?no.5和seq?id?no.6所示的序列；

11、sea引物對(duì)包括如seq?id?no.7和seq?id?no.8所示的序列；

12、thai引物對(duì)包括如seq?id?no.9和seq?id?no.10所示的序列；

13、hbb引物對(duì)包括如seq?id?no.11和seq?id?no.12所示的序列。

14、本申請(qǐng)的第二目的在于提供一種核酸檢測(cè)方法，包括將待測(cè)生物樣本和上述核酸擴(kuò)增試劑盒中的核酸提取試劑混合后進(jìn)行直接擴(kuò)增。

15、在其中一個(gè)實(shí)施例中，將待測(cè)生物樣本和所述核酸提取試劑混合時(shí)，對(duì)待測(cè)生物樣本進(jìn)行加熱處理以釋放所述待測(cè)生物樣本中的核酸；

16、可選地，所述加熱溫度為90～95℃，所述加熱時(shí)間為10～20min。

17、在其中一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)待測(cè)生物樣本進(jìn)行加熱處理后還包括：

18、采用長(zhǎng)片段核酸擴(kuò)增試劑對(duì)加熱處理的待測(cè)生物樣本進(jìn)行擴(kuò)增。

19、在其中一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)待測(cè)生物樣本進(jìn)行加熱處理后還包括：

20、對(duì)加熱處理的待測(cè)生物樣本進(jìn)行保存；

21、可選地，保存時(shí)間不超過7天。

22、在其中一個(gè)實(shí)施例中，待測(cè)生物樣本來自于唾液、血液、尿液和組織液中的至少一種。

23、在其中一個(gè)實(shí)施例中，待測(cè)生物樣本為口腔拭子；

24、可選地，一支口腔拭子所需的核酸提取試劑的體積為0.1ml～1ml。

25、在其中一個(gè)實(shí)施例中，長(zhǎng)片段核酸擴(kuò)增試劑用于檢測(cè)待測(cè)生物樣本的hba1/2和hbb基因突變；

26、可選地，hba1/2和hbb基因突變包括缺失型突變和非缺失型突變；

27、可選地，缺失型突變包括hba1/2基因缺失突變，hba1/2基因缺失突變包括--thai、--sea、-α3.7和-α4.2中的至少一種；

28、可選地，非缺失型突變包括hba2基因點(diǎn)突變，hba2基因點(diǎn)突變包括qs、cs和ws中的至少一種；

29、可選地，非缺失型突變包括hbb基因突變，hbb基因突變包括-32(c-a)、-30(t-c)、-29(a-g)、-28(a-g)、cap+40-43(-aaac)、int(t-g)、cd14/15(+g)、cd17(a-t)、cd26(g-a)、cd27/28(+c)、cd31(-c)、cd41/42(-tctt)、cd43(g-t)、cd71/72(+a)、ivs-i-1(g-t，g-a)、ivs-i-5(g-c)和ivs-ii-654(c-t)中的至少一種。

技術(shù)特征：

1.核酸擴(kuò)增試劑盒，其特征在于，包括核酸提取試劑，所述核酸提取試劑包括以下組分：tris-hcl、nacl、三亞乙基四胺、二硫蘇糖醇和表面活性劑；其中，tris-hcl的工作濃度為0.05～0.2mol/l；所述nacl的工作濃度為120～140mm；所述三亞乙基四胺的工作濃度為80～110mm；所述二硫蘇糖醇的工作濃度為3～6mm；所述表面活性劑的體積分?jǐn)?shù)為0.1％～0.5％。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，核酸提取試劑滿足以下條件(1)～(2)中的至少一種：

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括長(zhǎng)片段核酸擴(kuò)增試劑，所述長(zhǎng)片段核酸擴(kuò)增試劑包括長(zhǎng)片段核酸擴(kuò)增引物組。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述長(zhǎng)片段核酸擴(kuò)增引物組包括hba2引物對(duì)、α3.7引物對(duì)、α4.2引物對(duì)、sea引物對(duì)、thai引物對(duì)和hbb引物對(duì)；

5.一種核酸檢測(cè)方法，其特征在于，包括將待測(cè)生物樣本和權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的試劑盒中的核酸提取試劑進(jìn)行混合。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，將待測(cè)生物樣本和所述核酸提取試劑混合時(shí)，對(duì)待測(cè)生物樣本進(jìn)行加熱處理以釋放所述待測(cè)生物樣本中的核酸；

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，對(duì)待測(cè)生物樣本進(jìn)行加熱處理后還包括：

8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)生物樣本來自于唾液、血液、尿液和組織液中的至少一種。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)生物樣本為口腔拭子；

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述長(zhǎng)片段核酸擴(kuò)增試劑用于檢測(cè)待測(cè)生物樣本的hba1/2和hbb基因突變；

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)涉及一種核酸擴(kuò)增試劑盒和核酸檢測(cè)方法，核酸擴(kuò)增試劑盒包括核酸提取試劑，核酸提取試劑包括以下組分：Tris?HCl、NaCl、三亞乙基四胺、二硫蘇糖醇和表面活性劑；其中，Tris?HCl的工作濃度為0.05～0.2mol/L；NaCl的工作濃度為120～140mM；三亞乙基四胺的工作濃度為80～110mM；二硫蘇糖醇的工作濃度為3～6mM；表面活性劑的體積分?jǐn)?shù)為0.1％～0.5％。本申請(qǐng)的核酸擴(kuò)增試劑盒，使得生物樣本中的細(xì)胞可快速裂解并釋放高濃度的核酸，釋放的核酸能夠保持一定的穩(wěn)定性，并且濃度滿足后續(xù)直擴(kuò)步驟的要求；同時(shí)三亞乙基四胺可以快速結(jié)合細(xì)胞中的蛋白雜質(zhì)，使其不會(huì)抑制DNA聚合酶的活性。

技術(shù)研發(fā)人員：楊夢(mèng)婷,賈延凱,楊超
受保護(hù)的技術(shù)使用者：深圳明悅醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/19