本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種用于檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體的引物組合及試劑盒。

背景技術：

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)感染是指病原體侵犯cns引起的急性或慢性炎癥性(或非炎癥性)疾病，包括腦膜炎和(或)腦炎。cns感染病原體主要包括細菌、病毒、真菌、寄生蟲、支原體。病原體侵犯cns可引起感染性病變，嚴重者可能危及生命，并導致嚴重后遺癥(le?govic等,plos?pathog?2022,18(2):e1010234；horiba等,open?forum?infect?dis?2022,9(10):ofac504)。

2、目前cns感染臨床診斷方法主要包括：微生物培養(yǎng)、聚合酶鏈式反應(pcr)、宏基因組測序等?？焖偌皶r地找出引起cns感染的病原體對于充分診斷和治療cns感染至關重要，而微生物培養(yǎng)法耗時較長，且對于接受過抗生素治療的患者檢測靈敏度較低。pcr技術依賴于已知病原體信息且一次只能特異性檢測單一種病原體。無偏倚的宏基因組測序可以覆蓋幾乎所有存在的病原體，但其敏感性嚴重依賴于背景水平，并且測序數(shù)據(jù)量過大、分析時間較長(fu等,microbiol?spectr?2022,10(2):e0027022)。

3、納米孔測序技術是新近發(fā)展的一種單分子高通量測序方法，具有低成本、非標記、長堿基序列讀取、無堿基偏好性、能跨越重復基因組區(qū)域等優(yōu)勢，且能實時獲得序列信息(deamer等,nat?biotechnol?2016,34:518-524；wang等,nat?biotechnol?2021,39:1348–1365)。近幾年得益于納米孔測序芯片及算法的升級，總體測序產(chǎn)量和質(zhì)量都有了很大地提升，實現(xiàn)了＞99％的準確度。如果先對病原體的dna和rna共同提取，接著反轉錄rna，然后多重pcr擴增重點病原體的標記基因，以快速靶向富集目標基因片段，從而極大降低實驗操作復雜性，提高基因序列分析時效性，同時結合納米孔測序設備便攜性特點，中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染分析也因此將迎來全新突破與應用。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種檢測cns感染病原體的引物組合及試劑盒，從而實現(xiàn)cns感染病原體分析。

2、為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體的引物組合，包括如下表1所述的20對特異性引物(序列1～序號20)。

3、作為本發(fā)明的檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體的引物組合的改進：還包括如下表1所述的4對特異性引物(序列21～序號24)和2對通用性引物(序列25～序號26)。

4、表1引物序列

5、 序號 基因名稱 基因id 病原體類型 上游引物序列 下游引物序列 1 hly 987033 nc_003210.1 aaacttcggcgcaatcagtg agcaatgggaactcctggtg 2 ply 66806991 nz_cp020549.1 cccatttctgtcccaagcct tcgagtgttgcttatgggcg 3 ctra 61282337 nz_cp021520.1 tttctgtgccgtttgttggc accgttggaatctctgcctc 4 rpob 888164 nc_000962.3 tcggccagattttggagacc ccgtcactcgatagcacctc 5 ppk 946971 nc_000913.3 caatgaacgcgtgcttcagg caggctggcttccatctcat 6 fucp 72526018 nz_cp007470.1 ccagcggcattatttgccag agtcccataacttcgccttgg 7 pepf 66885711 nz_cp012480.1 tttggagcagctggtgagac gcgaagccggttgcatattg 8 cnn02320 3255447 nc_006683.1 tcgtgcttctcgaatgtccc aggaggaaagatgccacacg 9 orf38 1487706 nc_001348.1 ccgtccccaaatggtgtttg gggctttattggcacgttgg 10 bfrf1 3783699 nc_007605.1 cctcgcccgtgtttgtgata acgagttccttcttccacgg 11 jvgp4 1489518 nc_001699.1 ctcatgtgggaggctgtgac atgtctgggtcccctggaag 12 u36 3289494 nc_001716.2 acgtagactgagacgagcatc acggtagaatgtgtttcagctt 13 l3 2652998 nc_001405.1 ggtggtcaatccgttctggt gtcgtaggtgttggggttgt 14 u90 1497087 nc_000898.1 cattcacatgcgtgggtgat tagctcagtccgttggcaat 15 ul39 1487325 nc_001798.2 gtatcgcatcctgggggttc aactcctcgccgtgaaagtc 16 us3 2703401 nc_001806.2 aaaccttcccacaccacacc tctcgaagatcaccagaccg 17 ul97 3077517 nc_006273.2 atcatcaccacgtccatccg acagacgctccacgttcttt 18 m 1489764 nc_002200.1 tgccactccagaaacatccg tggaaccacacggatgcaat 19 hevagp1 1461111 nc_001612.1 acacaggtgagcagtcatcg attggagcagttgtgggaca 20 poly 1489713 nc_001437.1 caagcacggcatggagaaaca ccagcacctttgagttggagc 21 dpra 83728099 nz_cp030361.1 tccaaagaagcatacggccc atagctcttccgtcggatcg 22 cel7a 18483782 nw_006711176.1 tggactcacgctacgaacag caagccgcaccttgaattgg 23 camvgp5 1489541 nc_001497.2 acgagcaagagaaggccaag gccttcaatgttgcagatcc 24 tmvgp6 1494080 nc_001367.1 actccatctcagttcgtgttct caagttgcaggaccagaggt 25 16s?rrna / / agrgttygatymtggctcag rgytaccttgttacgactt 26 its / / tccgtaggtgaacctgcgg tcctccgcttattgatatgc

6、本發(fā)明還同時提供了一種檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體的試劑盒，包括如上所述的引物組合。

7、作為本發(fā)明的檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體的試劑盒的改進：

8、(1)反轉錄體系：

9、包括m、hevagp1、poly的反轉錄引物組成的反轉錄引物混合物、反轉錄酶、rna酶抑制劑、5×反轉錄緩沖液、dntps；

10、(2)多重pcr擴增體系：

11、24對特異性引物和2對通用性引物組成的多重pcr擴增引物混合物，多重pcr聚合酶、5×pcr擴增緩沖液、5×高gc增強劑(用于保障高gc含量dna模板的擴增性能)、dntps。

12、作為本發(fā)明的檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體的試劑盒的進一步改進：

13、反轉錄體系(rna反轉錄反應體系)中：反轉錄引物混合物中的每個反轉錄引物的終濃度為100nm～1μm(優(yōu)選200nm)；反轉錄酶的終濃度為0.5～15u/20μl(優(yōu)選10u/20μl)；dntps的終濃度為0.2～1mm(優(yōu)選0.5mm)；rna酶抑制劑的終濃度為0.2～2u/μl(優(yōu)選0.4u/μl)；5×反轉錄緩沖液稀釋到1×；

14、多重pcr擴增體系中：多重pcr擴增引物混合物中的每個引物的終濃度為100nm～1μm(優(yōu)選200nm)，多重pcr聚合酶的終濃度為0.5～3u/25μl(優(yōu)選1u/25μl)，5×pcr擴增緩沖液稀釋到所含mg2+的終濃度為0.5mm～3mm(優(yōu)選稀釋至1×，此時mg2+的終濃度為2mm)；5×高gc增強劑稀釋到1×，dntps的終濃度為0.2～1mm(優(yōu)選0.2mm)。

15、作為本發(fā)明的檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體的試劑盒的進一步改進：

16、m、hevagp1、poly的反轉錄引物為其對應的特異性引物。

17、作為本發(fā)明的檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體的試劑盒的進一步改進：

18、多重pcr聚合酶(taq聚合酶)為kapa?dna聚合酶、hieff?dna聚合酶、epiquick?dna聚合酶、hiper?plus?dna聚合酶、primestar?dna聚合酶、phanta?dna聚合酶、neb?q5?dna聚合酶的其中一種；

19、反轉錄酶為primescript反轉錄酶、mmlv反轉錄酶、amv反轉錄酶、bcabest反轉錄酶、induro反轉錄酶的其中一種。

20、本發(fā)明采用多重pcr靶向捕獲方法結合納米孔測序技術，可以消除人源基因等非目標基因序列的干擾，快速簡便地檢測感染cns的多個病原體。

21、本發(fā)明所采用的多重pcr靶向捕獲測序，共含有26個擴增子。這些擴增子序列長度在300-1600bp之間，能夠容納目標病原體的標記基因片段。納米孔測序能完整讀取這些擴增子序列，通過簡單的數(shù)據(jù)分析，快速解碼。納米孔的長讀取測序可以對全長基因進行分析，這是以往測序技術所辦不到的，由于讀取長度增加，比以前的技術提高了分類單元的區(qū)分率。采用多重pcr靶向捕獲方法，具有文庫構建周期短，基因序列捕獲率高，均一性好，比對率高，重復性好，操作簡便等優(yōu)點。

22、本發(fā)明中，為了鑒定感染cns的病原體種類，建立檢測方法的過程，首先是設計特異性的擴增引物組合，用來擴增20個cns感染的常見重點病原體標記基因和4個外源性定量內(nèi)標基因；其次是設計通用性的擴增引物組合，用來擴增細菌16s?rrna基因和真菌its基因。這些引物合成之后，溶解并進行濃度測定，經(jīng)過實驗篩選與驗證，具體如上述表1。

23、上述20個cns感染的常見重點病原體標記基因，具體如下：

24、對hly、ply、ctra、rpob、ppk、fucp、pepf等7個重點細菌的標記基因進行檢測，可以分別鑒定單核細胞增生李斯特菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、結核分枝桿菌、大腸桿菌、流感嗜血桿菌、無乳鏈球菌；對cnn02320基因進行檢測，可以鑒定新型隱球菌；對orf38、bfrf1、jvgp4、u36、l3、u90、ul39、us3、ul97等9個重點dna病毒的標記基因進行檢測，可以分別鑒定水痘-帶狀皰疹病毒、eb病毒、jc病毒、人類皰疹病毒7型、腺病毒、人類皰疹病毒6型、單純皰疹病毒2型、單純皰疹病毒1型、巨細胞病毒；對m、hevagp1、poly等3個重點rna病毒的標記基因進行檢測，可以分別鑒定腮腺炎病毒、腸道病毒、流行性乙型腦炎病毒。

25、對整個16s?rrna基因進行全長測序，包括9個高變片段(v1-v9)，兩側為高度保守區(qū)域，用來協(xié)助確認cns感染細菌種類和補充報告其他細菌種類(calus等，gigascience2018,7(12):giy140)。對整個its基因進行測序，包括its1、its2片段和5.8s?rdna片段，則用來協(xié)助確認cns感染真菌種類和補充報告其他真菌種類(fujita等，j?clin?microbiol2001,39:3617-22)。

26、上述4個外源性定量內(nèi)標基因，具體如下：

27、對dpra、cel7a、camvgp5、tmvgp6等4個基因進行檢測，可以分別鑒定魯伯鹽堿桿菌、里氏木霉、花椰菜花葉病毒、煙草花葉病毒。魯伯鹽堿桿菌是一種在高鹽環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的極端嗜鹽細菌；里氏木霉是生長在木材表面的木霉；花椰菜花葉病毒是一種植物雙鏈dna病毒；煙草花葉病毒是煙草花葉病毒屬中的一種單鏈正義rna病毒。這四種主要存在于環(huán)境和植物中的微生物，是作為內(nèi)部標準品添加進實驗體系中，通過在每個樣本中添加已知數(shù)量的內(nèi)部標準品來定量估計樣本中各微生物群落豐度，比較不同樣本中的微生物群落變化，從而識別真正與疾病發(fā)生相關的微生物類群。

28、本發(fā)明采用dna和rna共同提取的方法，過程中不加入dna酶或rna酶，而加入dna酶和rna酶的抑制劑，所用的水則經(jīng)過焦碳酸二乙酯(depc)處理。為防止rna降解，核酸提取后緊接著將rna反轉錄成cdna，與所提取的dna一起作為pcr模板。這樣可以同時檢測樣本中的細菌、真菌、dna病毒和rna病毒，大幅提高了實驗效率。

29、多重pcr反應之后，通過連接反應引入標簽序列，數(shù)量可以是6～384個，分別標記6～384個樣本，即每個樣本對應唯一一種標簽序列。

30、已經(jīng)用標簽序列標記的各個樣本的多重pcr擴增產(chǎn)物，可以混合在一起，然后用連接反應加上馬達蛋白和測序接頭，形成測序文庫，最后充分利用納米孔測序技術的高通量優(yōu)勢，上機測序，而下機后數(shù)據(jù)分析時又可以根據(jù)標簽拆分成各個樣本。

31、本發(fā)明利用納米孔測序技術，開發(fā)一種新型的分子診斷試劑盒，無需培養(yǎng)病原體，對樣本核酸進行多重pcr擴增(rna則先處理成cdna)，接著測序讀取序列并數(shù)據(jù)分析，從而可以快速分析感染病原體情況，不僅可以降低cns感染綜合檢測成本，還可以加快診斷速度，具備良好的臨床應用潛力。

32、需要說明的是：現(xiàn)有技術如果同時涉及dna和rna的話，大部分還是會將dna和rna分開提取，操作復雜耗時，而本發(fā)明采取共提取方法，提高效率。

33、綜上，本發(fā)明公開了一種檢測cns感染病原體的引物組合及試劑盒。該試劑盒是基于納米孔測序技術使用的，包含經(jīng)過設計、篩選、驗證得到的26對引物。檢測時，使用這些引物混合物，采用多重pcr擴增待測樣本核酸，在反應過程中每對引物擴增一段核苷酸序列或整個基因全長序列，然后運用納米孔測序技術的高通量和長片段讀取特點，獲得這些基因序列，最后通過生物信息學分析判定待測樣本。本發(fā)明試劑盒可以在同一個反應條件下，同時完成對多個基因的擴增與檢測，無需培養(yǎng)病原體，即可鑒定感染cns病原體的種類，具有多指標、快速、特異性強、靈敏度高等特點。