本技術(shù)涉及基因分離和植物改良，具體涉及晚疫病抗性基因、生物材料及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、馬鈴薯晚疫病是國際公認的馬鈴薯生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害，其爆發(fā)曾造成史上著名的“愛爾蘭大饑荒”，100多年來各國科學(xué)家持續(xù)不斷地與迅速變異的晚疫病菌作斗爭。由于晚疫病致病菌毒性變異能力強，可能快速克服馬鈴薯大部分的已有品種抗性，馬鈴薯品種抗病性喪失問題日益加劇，嚴(yán)重威脅著馬鈴薯的生產(chǎn)。我國作為世界馬鈴薯生產(chǎn)第一大國，晚疫病的防治大多依賴化學(xué)農(nóng)藥，藥劑的大量使用不但增加生產(chǎn)成本，污染了環(huán)境，還對人民的生命健康構(gòu)成了威脅，而且由于長期大量施用殺菌劑甲霜靈，晚疫病生理小種不斷變異，已逐漸產(chǎn)生了耐藥性。因此，選育和種植持久抗晚疫病品種是防治該病害的有效替代途徑，挖掘新的廣譜抗性基因并適當(dāng)聚合多個抗性基因是當(dāng)前馬鈴薯抗病育種工作的重中之重。

2、馬鈴薯新的廣譜抗性基因發(fā)掘與克隆是晚疫病研究的熱點。在早期的晚疫病抗病育種研究中，最初的抗病基因主要來自于墨西哥六倍體野生種solanum?demissum，其所含的11個(r1-r11)抗晚疫病基因，均為小種專化型的主效抗病基因。但隨著致病疫霉各生理小種的不斷變異，早期的抗病基因已全部失去抗病功能。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)與高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，利用抗病基因圖位克隆結(jié)合比較基因組學(xué)，抗性基因富集測序(renseq)以及病原菌效應(yīng)子組學(xué)等方法，歐美的馬鈴薯育種學(xué)家不斷從各類野生馬鈴薯資源中克隆全新的抗病基因，最著名廣譜抗性基因包括rpi-vnt1.1、rpi-blb1、r8、rpi-amr1等，但能夠克服這些抗病基因的致病疫霉生理小種也隨之涌現(xiàn)，因此亟待繼續(xù)發(fā)掘與克隆馬鈴薯新的廣譜抗性基因。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種新的晚疫病抗性基因、生物材料及應(yīng)用。本發(fā)明提供的晚疫病抗性基因rpi-card1的發(fā)現(xiàn)，為馬鈴薯抗晚疫病育種提供了重要的基因資源。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種rpi-card1核酸分子，其包含如下核苷酸序列中的至少一種：

4、(a1)seq?id?no:1或seq?id?no:2所示的核苷酸序列(基因組序列)；

5、(a2)seq?id?no:3或seq?id?no:4所示的核苷酸序列(編碼區(qū)序列)；

6、(a3)編碼seq?id?no:5或seq?id?no:6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

7、(a4)與所述(a1)和(a2)中任一所示的核苷酸序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核酸分子能夠賦予包含所述核酸分子的植物對由至少一個疫霉屬的種(phytophthora?sp.)的至少一個小種引起的植物疾病的抗性，并且任選地，其中所述核苷酸序列不是天然存在的；

8、(a5)與所述(a3)所示的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述核酸分子能夠賦予包含所述核酸分子的植物對由至少一個疫霉屬的種的至少一個小種引起的植物疾病的抗性，并且任選地，其中所述核苷酸序列不是天然存在的。

9、任選的，上述核酸分子為合成的和/或分離的核酸分子。

10、本發(fā)明通過大量實驗挖掘到了對晚疫病有極強抗性的野生二倍體馬鈴薯solanumcardiophyllum材料，并對其進行全基因組測序分析及進化分析等，發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明候選基因rpi-card1。與已知的許多晚疫病抗性基因不同，上述基因編碼的氨基酸序列中含有一個cc結(jié)構(gòu)域、一個nb-arc結(jié)構(gòu)域，其為cnl基因，該基因被命名為rpi-card1。其在基因組上的兩個等位基因均能介導(dǎo)晚疫病的抗性，分別命名為rpi-card1.1與rpi-card1.2。將上述基因通過遺傳轉(zhuǎn)化的方式在栽培馬鈴薯品種中進行穩(wěn)定表達后，可賦予馬鈴薯對于致病疫霉的抗性。

11、上述(a4)中，具有至少75％序列同一性的核苷酸序列示例性的為具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一性的核苷酸序列，優(yōu)選的為具有97.0％-98.0％、97.5％-98.5％、98.0％-99.0％、98.5％-99.5％、99.0％-100％同一性的核苷酸序列。

12、上述(a5)中，具有至少75％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列示例性的為具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，優(yōu)選的為具有97.0％-98.0％、97.5％-98.5％、98.0％-99.0％、98.5％-99.5％、99.0％-100％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。

13、在一些實施方式中，本發(fā)明相關(guān)核酸分子的天然核苷酸序列可為來源于茄屬不同種和或不同株的變體序列，其人工核苷酸序列可為天然核苷酸序列通過適當(dāng)修飾得到的變體序列，所述修飾包括但不限于不影響目標(biāo)蛋白的生物活性的適當(dāng)核苷酸取代/添加/缺失、n-端氨基酸被截短、適用于宿主細胞偏好的密碼子優(yōu)化、標(biāo)簽的添加、融合等對應(yīng)的核苷酸變體序列。

14、優(yōu)選地，rpi-card1核酸分子包含(a1)-(a3)所示的核苷酸序列及其人工變體序列中的至少一種。

15、本發(fā)明的rpi-card1核苷酸序列包括但不限于包含天然啟動子和含有編碼區(qū)的3'鄰近區(qū)域的核苷酸序列、cdna序列和僅包含編碼區(qū)的核苷酸序列。

16、第二方面，本發(fā)明提供了一種核酸分子組合物，其包含上述核酸分子和另外的抗性(r)基因；

17、任選地，另外的r基因包含但不限于如下基因中的至少一種：rpi-amr3i(登錄號kt373889；wo?2016/182881的seq?id?no:1)、rpi-blb1(也稱為“rb”；登錄號fb764493.1和ay336128.1)、rpi-sto1(登錄號eu884421)、rpi-pta1(登錄號eu884422)、rpi-blb2(登錄號dq122125)、rpi-blb3(登錄號fj536326)、rpi-abpt(登錄號fj536324)、r2-like(登錄號fj536323)、r2(登錄號fj536325)、rpi-edn1.1(登錄號gu563963)、rpi-edn1.2、rpi-snk1.1、rpi-snk1.2、rpi-hjt1.1-rpi-hjt1.3(登錄號gu563971-3)、rpi-bt1(登錄號fj188415)、r1(登錄號af447489)、r3a(登錄號ay849382)、r3b(登錄號jf900492)、rpi-vnt1.1(登錄號fj423044)、rpi-vnt1.2(登錄號fj423045)、rpi-vnt1.3(登錄號fj423046)、rpi-mcq1(登錄號gn043561)、rpi-chc、ph-3(登錄號kj563933)和r8(登錄號ku530153)。

18、對應(yīng)于上文列出的基因或本文其他地方公開的任何基因或蛋白質(zhì)的登錄號的核苷酸序列可從可公開獲得的在線核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)庫，例如genbank和embl數(shù)據(jù)庫(分別可在ncbi.nlm.nih.gov/genbank和ebi.ac.uk于萬維網(wǎng)上獲得)獲得。

19、第三方面，本發(fā)明提供了一種生物材料，所述生物材料為下述(b1)～(b3)中的任一種：

20、(b1)含有上述核酸分子或核酸分子組合物的表達盒或表達盒組合物；

21、(b2)含有上述核酸分子或核酸分子組合物的載體或載體組合物，或，含有(b1)所述表達盒或表達盒組合物的載體或載體組合物；

22、(b3)含有上述核酸分子或核酸分子組合物的宿主細胞，或，含有(b1)所述表達盒或表達盒組合物的宿主細胞，或，含有(b2)所述載體或載體組合物的宿主細胞。

23、任選地，宿主細胞包括細菌或真菌細胞。

24、在本發(fā)明一實施方式中，生物材料為表達盒或表達盒組合物。

25、在本發(fā)明實施方式中，上述核酸分子或核酸分子組合物包括至少兩種核酸分子時，可將其制備成一個表達盒，也可將其制備成由至少兩個表達盒組成的組合物。

26、在本發(fā)明實施方式中，表達盒或表達盒組合物還包括調(diào)控元件，調(diào)控元件包括啟動子、增強子、前導(dǎo)序列、轉(zhuǎn)座子、終止子、標(biāo)記基因中的至少一種。

27、在本發(fā)明實施方式中，表達盒或表達盒組合物還包括可操作地連接的啟動子。

28、任選地，啟動子包括可操作地連接的內(nèi)源啟動子和/或可操作地連接的異源啟動子。

29、任選地，可操作地連接的內(nèi)源啟動子為rpi-hma3基因的天然啟動子，如內(nèi)源啟動子pcard1。

30、在本發(fā)明實施方式中，內(nèi)源啟動子pcard1包含如seq?id?no:7所示的核苷酸序列，和/或，與seq?id?no:7所示的核苷酸序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列。具有至少75％序列同一性的核苷酸序列示例性的為具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。

31、在本發(fā)明實施方式中，可操作地連接的異源啟動子的選擇可取決于許多因素，例如期望的時間安排、定位和表達模式以及對特定生物或非生物刺激的響應(yīng)性。任選地，可操作地連接的異源啟動子包括病原體誘導(dǎo)型啟動子、組成型啟動子、組織優(yōu)選啟動子、傷口誘導(dǎo)型啟動子、化學(xué)調(diào)節(jié)型啟動子中的至少一種。例如，pblb3啟動子(lokossou?a?a等(2009)molecular?plant-microbe?interactions,22(6):630-641.)；核心camv?35s啟動子(odell等(1985)nature?313:810-812)；稻肌動蛋白(mcelroy等(1990)plant?cell2:163-171)；遍在蛋白(christensen等(1989)plant?mol.biol.12:619-632和christensen等(1992)plantmol.biol.18:675-689)；pemu(last等(1991)theor.appl.genet.81:581-588)；mas(velten等(1984)embo?j.3:2723-2730)；als啟動子(美國專利第5,659,026號)等。優(yōu)選適用于在茄屬作物上穩(wěn)定表達同類抗病基因的啟動子。

32、基因表達所需調(diào)控序列的確切性質(zhì)在物種或細胞類型之間可能會有所不同，但一般按需要應(yīng)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯起始的5'非轉(zhuǎn)錄和5'非翻譯序列，例如tata盒、加帽序列、caat序列等等。尤其是，這種5'非轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列將包括啟動子區(qū)域，其包括控制對有效連接的基因進行轉(zhuǎn)錄控制的啟動子序列。調(diào)控序列也可包括增強子序列或所需的上游激活子序列。本發(fā)明表達盒可任選地包括5'前導(dǎo)或信號序列。

33、在本發(fā)明實施方式中，核酸分子的表達可通過操作基因或操縱子在細胞中的拷貝數(shù)來調(diào)節(jié)。

34、在一些實施方案中，核酸分子的表達可通過操作模塊內(nèi)核酸分子的順序來調(diào)節(jié)。

35、在一些實施方案中，核酸分子的表達通過將一個或更多個核酸分子或操縱子整合到染色體上來調(diào)節(jié)。

36、在本發(fā)明另一實施方式中，生物材料為載體或載體組合物。

37、在一些實施方案中，一個或更多個本發(fā)明相關(guān)的核酸分子在表達載體中表達。本文所用的“載體”可是大量核酸中的任何一種，其中可通過限制性酶切和連接來插入所需的一個或更多個序列，以便在不同的遺傳環(huán)境中運送或在宿主細胞中表達。載體通常是由dna組成，也可由rna組成。

38、在本發(fā)明實施方式中，載體包括質(zhì)粒、葉綠體、病毒載體、噬菌體、噬菌粒、黏粒、f黏粒、細菌噬菌體或人工染色體，并且任選地，病毒載體包括腺病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺相關(guān)病毒載體，并且任選地，載體包括細菌人工染色體(bac)、質(zhì)粒、細菌噬菌體p1-衍生的載體(pac)、酵母人工染色體(yac)或哺乳動物人工染色體(mac)。例如載體包括pfastbac1、pyes2、pyes2.1、pesc-ura、pesc-trp、pesc-leu、pesc-his、pgex2t、ptaex3、pusa、pymb0、pht43、pet28b、pij702、pucp19、pymb03、pht43、peaq、pbin307、ppzp、psat、pcamia-1300等。

39、克隆載體能自主復(fù)制或整合在宿主細胞基因組中，其還以一個或更多個限制性內(nèi)切酶位點為特征，可以在該位點以確定的方式切割載體并可將期望的dna序列連接到載體中，從而新的質(zhì)粒保留了它在宿主細胞中復(fù)制的能力。在質(zhì)粒的情況下，期望序列的復(fù)制可隨著質(zhì)粒在宿主細胞(如細菌宿主)中的拷貝數(shù)增加而多次發(fā)生，或僅在宿主通過有絲分裂繁殖前在每個宿主中發(fā)生一次。在噬菌體的情況下，復(fù)制可在裂解期過程中主動發(fā)生或在溶原期過程中被動發(fā)生。

40、表達載體可通過限制性酶切和連接將期望的dna序列插入其中，以使其與調(diào)控序列有效連接中并可表達為rna轉(zhuǎn)錄本。載體還可包含適合用于鑒定細胞是否已被載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的一種或更多種標(biāo)記序列。標(biāo)記包括如編碼提高或降低其對抗生素或其他化合物之抗性或敏感性的蛋白質(zhì)的基因，編碼可通過本領(lǐng)域已知標(biāo)準(zhǔn)方法檢測活性的酶的基因(例如β-半乳糖苷酶、螢光素酶或堿性磷酸酶)，以及對轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細胞、宿主、菌落或菌斑的表型有可見影響的基因(例如綠色熒光蛋白)。優(yōu)選的載體是能夠自主復(fù)制和表達與其有效連接的dna片段中所存在的結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物的載體。

41、在本發(fā)明實施方式中，核酸分子或核酸分子組合物包括至少兩種核酸分子時，可將其制備成一個載體，也可將其制備成由至少兩個載體組成的組合物。

42、在本發(fā)明另一實施方式中，生物材料為宿主細胞。

43、任選地，宿主細胞包括細菌或真菌細胞。

44、第四方面，本發(fā)明還提供了一種啟動子，該啟動子用于驅(qū)動rpi-hma3基因的轉(zhuǎn)錄，該啟動子pcard1包含如seq?id?no:7所示的核苷酸序列，和/或，與seq?id?no:7所示的核苷酸序列具有至少75％序列同一性的核苷酸序列。具有至少75％序列同一性的核苷酸序列示例性的為具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。

45、第五方面，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生宿主細胞的方法，該方法包括用上述核酸分子或核酸分子組合物、表達盒或表達盒組合物、載體或載體組合物中的至少一種轉(zhuǎn)化宿主細胞。

46、第六方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明核酸分子、核酸分子組合物、生物材料中的任一種在增強植物對由至少一個疫霉屬的種的至少一個小種引起的植物疾病的抗性中的應(yīng)用。

47、在本發(fā)明實施方式中，植物包括茄科植物。

48、任選地，茄科植物包括馬鈴薯、番茄、茄子、辣椒、煙草、矮牽牛、粘果酸漿、燈籠果中的至少一種。

49、優(yōu)選地，茄科植物為馬鈴薯和/或番茄。

50、第七方面，本發(fā)明提供了一種增強植物對由至少一個疫霉屬的種的至少一個小種引起的植物疾病的抗性的方法，所述方法包括修飾至少一種植物細胞以包含異源多核苷酸，所述異源多核苷酸包含上述核酸分子或核酸分子組合物。

51、在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，疫霉屬的種是致病疫霉(phytophthorainfestans)。在其他實施方案中，疫霉屬的種是一個能夠在至少一種植物上引起植物疾病的疫霉屬的種。對于本發(fā)明，疫霉的某些種包括但不限于致病疫霉、寄生疫霉(phytophthora?parasitica)、枝干疫霉(phytophthora?ramorum)、番薯疫霉(phytophthora?ipomoeae)、米拉疫霉(phytophthora?mirabilis)、辣椒疫霉(phytophthora?capsici)、由蔥疫霉(phytophthora?porri)、大豆疫霉(phytophthorasojae)、棕櫚疫霉(phytophthora?palmivora)和菜豆疫霉(phytophthoraphaseoli)。

52、在本發(fā)明實施方式中，相對于對照植物(不包含異源多核苷酸的對照植物)，包含所述異源多核苷酸的植物具有增強的對由至少一個疫霉屬的種的至少一個小種引起的植物疾病的抗性。

53、在本發(fā)明實施方式中，修飾至少一種植物細胞以包含異源多核苷酸具體為：將本發(fā)明的核酸分子，核酸分子組合物，或生物材料中的表達盒或表達盒組合物、載體或載體組合物中的至少一種，轉(zhuǎn)化植物細胞中，使植物細胞表達蛋白。

54、在上述方法中，將核酸分子、核酸分子組合物、表達盒、載體轉(zhuǎn)化植物細胞的方法包括但不限于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、基因槍轉(zhuǎn)化、電穿孔、聚乙二醇(peg)轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、熱休克、磷酸鈣沉淀、病毒介導(dǎo)、顯微注射、基因工程編輯技術(shù)。

55、在本發(fā)明具體實施方式中，表達蛋白的方法例如為：(1)構(gòu)建包含本發(fā)明核酸分子或核酸分子組合物的載體；(2)將所得的載體轉(zhuǎn)化植物細胞；(3)將所得的植物細胞進行培養(yǎng)，使基因表達生成蛋白。

56、在本發(fā)明實施方式中，增強植物抗性的方法還包括將所述植物細胞再生成在其基因組中包含所述異源多核苷酸的植物。

57、優(yōu)選地，相對于對照植物對所述植物疾病的抗性，再生植物包含增強的對由至少一個疫霉屬的種的至少一個小種引起的植物疾病的抗性。

58、優(yōu)選地，相對于對照植物，包含所述異源多核苷酸的植物具有增強的對由疫霉屬的某一個種的至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個、十六個或更多個小種引起的植物疾病的抗性。

59、在本發(fā)明實施方式中，與對照植物相比，在其基因組中包含所述異源多核苷酸的植物對由至少一個疫霉屬的種的至少一個小種引起的植物疾病的抗性增強或增加至少25％。例如增強或增加至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％或更多。

60、在一些實施方案中，由至少一個疫霉屬的種的至少一個小種引起的植物疾病為晚疫病。

61、根據(jù)所需的結(jié)果，可將本發(fā)明的異源多核苷酸穩(wěn)定地整合到植物細胞的基因組中或不穩(wěn)定地整合到植物細胞的基因組中。

62、例如，如果期望的結(jié)果是產(chǎn)生具有增強的對由疫霉屬的某一個種的至少一個小種引起的植物疾病的抗性的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物，那么可將異源多核苷酸例如融合至適合于將異源多核苷酸穩(wěn)定整合到植物細胞基因組中的植物轉(zhuǎn)化載體中。在一些實施方案中，可將本發(fā)明的核酸分子或核酸分子組合物(異源多核苷酸)穩(wěn)定地整合到宿主細胞的基因組中。這種穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物能夠通過有性繁殖和/或無性繁殖將異源多核苷酸傳遞給后續(xù)世代的后代植物。

63、在本發(fā)明實施方式中，所述修飾至少一種植物細胞以包含異源多核苷酸的方式包括基因組編輯技術(shù)。

64、在其中不希望將異源多核苷酸穩(wěn)定地整合到植物基因組中的本發(fā)明的其他實施方案中，可以利用瞬時轉(zhuǎn)化方法將異源多核苷酸引入植物的一種或多種植物細胞中。在另一些實施方案中，通過顯微注射、微粒轟擊、病毒載體侵染等方式，或者通過噴霧、灌溉、撒粉等向植物或其部分施用經(jīng)修飾的病毒和/或經(jīng)修飾的病毒核酸，將異源多核苷酸不是穩(wěn)定地整合到宿主細胞的基因組中，使宿主或宿主細胞瞬時表達目的基因。

65、在本發(fā)明實施方式中，所述植物包括任意植物物種，例如單子葉植物、雙子葉植物、針葉類植物。

66、在具體的實施方案中，本發(fā)明的植物包括作物植物，例如玉米、大豆、小麥、水稻、棉花、苜蓿、向日葵、蕓苔(蕓苔屬的某些種，特別是甘藍型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜)、油菜籽(甘藍型油菜)、高粱、黍?qū)?、大麥、黑小麥、紅花、花生、甘蔗、煙草、馬鈴薯、番茄、茄子和辣椒。

67、優(yōu)選地，植物包括茄科植物。

68、優(yōu)選地，茄科植物包括但不限于馬鈴薯、番茄、茄子、辣椒、煙草、矮牽牛、粘果酸漿、燈籠果中的至少一種。

69、在更優(yōu)選實施方案中，茄科植物是馬鈴薯和/或番茄。

70、第八方面，本發(fā)明提供了一種在農(nóng)作物生產(chǎn)中防治由至少一個疫霉屬的種的至少一個小種引起的植物疾病的方法，所述方法包括：

71、修飾至少一種植物細胞以包含異源多核苷酸，所述異源多核苷酸包含上述核酸分子或核酸分子組合物；

72、將所述植物細胞再生成在其基因組中包含所述異源多核苷酸的植物；

73、種植所述植物的幼苗、塊莖或種子，并在有利于所述植物生長和發(fā)育的條件下培育幼苗、塊莖或種子。

74、在本發(fā)明實施方式中，所述方法還包括從所述植物收獲果實、塊莖、葉、種子中的至少一種。

75、第九方面，本發(fā)明提供了一種鑒定植物抗病性的方法，所述方法包括在植物、其植物部分或植物細胞中檢測上述核酸分子或核酸分子組合物的存在。

76、在本發(fā)明實施方式中，植物抗病性包括對由至少一個疫霉屬的種的至少一個小種引起的植物疾病的抗性。

77、在一些實施方案中，由至少一個疫霉屬的種的至少一個小種引起的植物疾病為晚疫病。

78、在一些實施方案中，鑒定植物抗病性的方法可用于培育抵抗由疫霉屬的某些種引起的植物疾病(例如，晚疫病)的茄科植物。這種抗性植物可用于供人或動物消費或其他用途的果實、塊莖、葉和/或種子的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

79、在本發(fā)明實施方式中，檢測所述核酸分子或核酸分子組合物的存在的方法包括：通過檢測完整的核酸分子或核酸分子組合物，或者檢測核酸分子或核酸分子組合物中的至少一個分子標(biāo)記，來檢測所述核酸分子或核酸分子組合物的存在。

80、在本發(fā)明實施方式中，檢測上述核酸分子或核酸分子組合物的存在的方法包括pcr擴增、核酸測序、核酸雜交或用于檢測由所述核酸分子或核酸分子組合物編碼的蛋白或多肽的免疫學(xué)測定法。

81、在一些實施方案中，在鑒定顯示出新賦予的或增強的對由疫霉屬的某一個種的至少一個小種引起的植物疾病的抗性的茄科植物的方法中，檢測茄科植物中rpi-card1核苷酸序列的存在可涉及本領(lǐng)域已知的以下分子生物學(xué)技術(shù)中的一種或多種，所述分子生物學(xué)技術(shù)包括但不限于從植物中分離基因組dna和/或rna，通過pcr擴增來擴增包含本文中的rpi-card1核苷酸序列和/或標(biāo)記的核酸分子，對包含rpi-card1核苷酸序列和/或標(biāo)記的核酸分子進行測序，通過核酸雜交鑒定rpi-card1核苷酸序列、標(biāo)記或rpi-card1核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄物，以及進行用于檢測由rpi-card1核苷酸序列編碼的r蛋白的免疫學(xué)測定。具體的，可以設(shè)計寡核苷酸探針和pcr引物以鑒定本發(fā)明的rpi-card1核苷酸序列，并且此類探針和pcr引物可以用于本文其他地方公開或本領(lǐng)域已知的方法以在植物群體中快速鑒定包含本發(fā)明的rpi-card1核苷酸序列的存在的一株或多株植物。

82、在本發(fā)明的其他實施方案中，檢測rpi-card1核苷酸序列的存在包括使用例如涉及對r蛋白特異的抗體的免疫學(xué)檢測方法檢測由rpi-card1核苷酸序列編碼的r蛋白的存在。

83、第十方面，本發(fā)明提供了一種將上述核酸分子或核酸分子組合物引入植物的方法，所述方法包括：

84、(c1)將第一植物與第二植物雜交，產(chǎn)生后代植物；

85、所述第一植物為在其基因組中包含至少一個拷貝的上述核酸分子或核酸分子組合物的植物；

86、所述第二植物為在其基因組中缺少所述核酸分子或核酸分子組合物的植物；

87、(c2)選擇在其基因組中包含至少一個拷貝的所述核酸分子或核酸分子組合物的后代植物。

88、在本發(fā)明實施方案中，(c2)具體為：

89、在后代植物、其植物部分或其植物細胞中檢測上述核酸分子或核酸分子組合物的存在；

90、選擇在其基因組中包含至少一個拷貝的所述核酸分子或核酸分子組合物的后代植物。

91、在本發(fā)明實施方案中，第一植物和第二植物可以是同一個種或可以是不同的種。植物的第一物種與植物的第二物種的這種雜交被稱為種間雜交，并且可用于將一種或多種目標(biāo)基因從一個物種滲入缺乏該一種或多種目標(biāo)基因的相關(guān)物種，并且通常涉及后代與相關(guān)物種的多代回交以及在每一代選擇包含一種或多種目標(biāo)基因的后代。這種種間雜交、基因滲入和回交方法是本領(lǐng)域熟知的，并且可以用于本發(fā)明的方法。

92、在用于將本發(fā)明的至少一種rpi-card1基因引入在其基因組中缺乏所述至少一種rpi-card1基因的植物中的本發(fā)明的方法中，第一植物或第二植物可以是花粉供體植物。例如，如果第一植物是花粉供體植物，則第二植物是花粉受體植物。同樣地，如果第二植物是花粉供體植物，則第一植物是花粉受體植物。在雜交后，將花粉受體植物在有利于植物生長和發(fā)育的條件下生長，并且生長足夠的時間以使種子成熟或?qū)崿F(xiàn)用于隨后的體外萌發(fā)過程(例如胚胎拯救)的其他想要的生長階段。然后可以收獲種子，并且通過本領(lǐng)域已知的任何方法鑒定包含所述rpi-card1基因的那些種子，所述方法包括例如在本文其他地方描述的用于鑒定顯示出新賦予的或增強的對由疫霉屬的某一個種的至少一個小種引起的植物疾病的抗性的茄科植物的方法。在某些實施方案中，第一植物是包含一種或多種rpi-card1基因的馬鈴薯植物，第二植物是缺乏所述一種或多種rpi-card1基因的馬鈴薯植物。

93、第十一方面，本發(fā)明提供了一種植物或其植物部分，植物為如下植物之一：

94、(d1)包含上述核酸分子、核酸分子組合物、表達盒、載體或宿主細胞中至少一種的植物；

95、(d2)經(jīng)修飾含有上述核酸分子或核酸分子組合物的植物細胞生長形成的植物；

96、(d3)采用上述增強植物對由至少一個疫霉屬的種的至少一個小種引起的植物疾病的抗性的方法生產(chǎn)獲得的植物；

97、(d4)所述(d1)-(d3)中任一植物自交所形成的后代，以及后代生長形成的植物；

98、(d5)所述(d1)-(d3)中任一植物與其它品種雜交所形成的后代，以及后代生長形成的植物；優(yōu)選的，所述雜交采用上述一種將上述核酸分子或核酸分子組合物引入植物的方法。

99、上述植物部分為根、莖、塊莖、葉、花、果實、花粉或種子。

100、本發(fā)明提供的包含核酸分子、核酸分子組合物(異源多核苷酸)的植物，異源多核苷酸包含本發(fā)明的r基因核苷酸序列。優(yōu)選地，這種r基因核苷酸序列編碼本發(fā)明的全長r蛋白，或至少其一個或多個功能部分或一個或多個結(jié)構(gòu)域。

101、本文公開的植物可用于在農(nóng)業(yè)作物生產(chǎn)中，特別是在這種植物疾病普遍并且已知會對農(nóng)業(yè)產(chǎn)量產(chǎn)生負面影響或至少可能產(chǎn)生負面影響的地區(qū)，防治由至少一個疫霉屬的種的至少一個小種引起的植物疾病的方法。

102、在具體的實施方案中，本發(fā)明的植物包括作物植物，例如玉米、大豆、小麥、水稻、棉花、苜蓿、向日葵、蕓苔(蕓苔屬的某些種，特別是甘藍型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜)、油菜籽(甘藍型油菜)、高粱、黍?qū)?、大麥、黑小麥、紅花、花生、甘蔗、煙草、馬鈴薯、番茄、茄子和辣椒。

103、優(yōu)選地，植物包括茄科植物。

104、優(yōu)選地，茄科植物包括但不限于馬鈴薯、番茄、茄子、辣椒、煙草、矮牽牛、粘果酸漿、燈籠果中的至少一種。

105、在更優(yōu)選實施方案中，茄科植物是馬鈴薯和/或番茄。

106、第十二方面，本發(fā)明提供了一種植物或其植物部分，植物包括含有上述核酸分子或核酸分子組合物的轉(zhuǎn)基因植物。

107、第十三方面，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生植物的方法，該方法包括用上述核酸分子或核酸分子組合物、表達盒或表達盒組合物、載體或載體組合物中的至少一種轉(zhuǎn)化植物。

108、本發(fā)明還提供了采用上述用于產(chǎn)生植物的方法制備得到的植物。

109、第十四方面，本發(fā)明提供了一種供人或動物消費的農(nóng)產(chǎn)品，供人或動物消費的農(nóng)產(chǎn)品包括上述植物或其植物部分，或者，供人或動物消費的農(nóng)產(chǎn)品為由上述植物或其植物部分制成的產(chǎn)品。

110、在本發(fā)明的實施方案中，供人或動物消費的農(nóng)產(chǎn)品包括食品和其他農(nóng)業(yè)產(chǎn)品。其他農(nóng)產(chǎn)品包括例如從煙葉生產(chǎn)的煙制品(例如香煙、雪茄、煙斗和嚼煙)以及從馬鈴薯塊莖生產(chǎn)的食品和工業(yè)淀粉產(chǎn)品。此類食品可以被人和其他動物消費或使用，所述動物包括但不限于寵物(例如狗和貓)、牲畜(例如豬、牛、雞、火雞和鴨)以及在淡水和海水養(yǎng)殖系統(tǒng)中生產(chǎn)的動物(例如魚、蝦、對蝦、小龍蝦和龍蝦)。

111、第十五方面，本發(fā)明提供了一種rpi-card1蛋白，其包含如下氨基酸序列中的至少一種：

112、(e1)seq?id?no:5或seq?id?no:6所示的氨基酸序列；

113、(e2)由seq?id?no:1或seq?id?no:2所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；

114、(e3)由seq?id?no:3或seq?id?no:4所示的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；

115、(e4)與seq?id?no:5或seq?id?no:6所示的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的氨基酸序列，其中包含所述氨基酸序列的蛋白能夠賦予包含所述蛋白的植物對由至少一個疫霉屬的種的至少一個小種引起的植物疾病的抗性。

116、上述(e4)中，具有至少75％序列同一性的氨基酸序列示例性的為具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％同一性的氨基酸序列，優(yōu)選的為具有97.0％-98.0％、97.5％-98.5％、98.0％-99.0％、98.5％-99.5％、99.0％-100％同一性的氨基酸序列。

117、在一些實施方式中，上述蛋白的天然氨基酸序列可為來源于茄屬不同種和或不同株的變體序列。上述蛋白的人工變體氨基酸序列可為天然氨基酸序列通過適當(dāng)修飾得到的變體序列，所述修飾包括但不限于不影響目標(biāo)蛋白的生物活性的適當(dāng)氨基酸取代/添加/缺失、n-端的氨基酸被截短、適用于宿主細胞偏好的密碼子優(yōu)化、標(biāo)簽的添加、融合等。

118、優(yōu)選地，rpi-card1的氨基酸序列為(e1)-(e3)所示的氨基酸序列及其人工變體序列中的至少一種。

119、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果為：

120、本發(fā)明rpi-card1基因可賦予馬鈴薯對于致病疫霉造成的晚疫病侵染的廣譜抗性，例如同時對16種不同致病疫霉菌株產(chǎn)生顯著抗性。

121、本發(fā)明在本氏煙葉片中瞬時表達rpi-card1基因可以賦予本氏煙葉片對于晚疫病的抗性。

122、本發(fā)明為馬鈴薯抗晚疫病育種提供了重要的基因資源，克服馬鈴薯品種抗病性喪失問題，為馬鈴薯持久抗病提供新的保障。