本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程，具體地涉及通過定向插入增強(qiáng)子實(shí)現(xiàn)植物基因組定點(diǎn)激活的方法。

背景技術(shù)：

1、基因過表達(dá)是植物研究和育種中最重要、應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，通常依賴于轉(zhuǎn)基因技術(shù)。然而，這種方法受到插入到表達(dá)載體中的開放閱讀框(orf)序列的大小的嚴(yán)重限制。而且由于它使用了外源性的強(qiáng)啟動(dòng)子并且會(huì)導(dǎo)致t-dna插入，面臨著許多問題和限制，此外使用這種方法也很難精確的激活特定基因的表達(dá)。基因組編輯技術(shù)開辟了基因研究和植物育種的新途徑，但是主要用于基因敲除；最近，基于dcas9的基因過表達(dá)也已在各種植物中得到驗(yàn)證和使用。然而，基于dcas9激活的體內(nèi)應(yīng)用仍未得到充分探索，因?yàn)椴煌悬c(diǎn)之間的激活效率差異很大。也有研究主要是通過廣泛的隨機(jī)編輯啟動(dòng)子以進(jìn)行靶基因的激活。然而，不同基因啟動(dòng)子之間具有特異性編輯，這限制該技術(shù)的通用性。

2、因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種通用的高效增強(qiáng)植物基因表達(dá)的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的就是提供一種通用的高效增強(qiáng)植物基因表達(dá)的方法。

2、在本發(fā)明的第一方面，提供了一種提高目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平的方法，所述方法包括：

3、(i)對(duì)于待提高表達(dá)的目標(biāo)基因，確定與所述目標(biāo)基因操作性連接的啟動(dòng)子以及所述目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；和

4、(ii)在所述目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)效應(yīng)區(qū)中插入短增強(qiáng)子(ste)元件，從而提高所述目標(biāo)基因在預(yù)定細(xì)胞或植物中轉(zhuǎn)錄水平；

5、其中，所述轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)效應(yīng)區(qū)是所述目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1到-1500bp的區(qū)域。

6、在另一優(yōu)選例中，所述短增強(qiáng)子(ste)元件的插入位置為所述目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1到-800bp的區(qū)域。

7、在另一優(yōu)選例中，所述短增強(qiáng)子(ste)元件的插入位置為所述目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1到-500bp的區(qū)域。

8、在另一優(yōu)選例中，插入短增強(qiáng)子(ste)元件采用基因編輯進(jìn)行。

9、在另一優(yōu)選例中，所述基因編輯采用cas酶。

10、在另一優(yōu)選例中，步驟(ii)中，插入短增強(qiáng)子(ste)元件是在體外對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，或針對(duì)植物的植株進(jìn)行基因編輯。

11、在另一優(yōu)選例中，所述的插入短增強(qiáng)子(ste)元件是對(duì)所述植物的植株，在開花期進(jìn)行基因編輯。

12、在另一優(yōu)選例中，所述植物選自下組：水稻、大豆、番茄、玉米、煙草、小麥、高粱、丹參、苜蓿。

13、在另一優(yōu)選例中，所述植物為水稻。

14、在另一優(yōu)選例中，所述短增強(qiáng)子(ste)元件為具有非回文型結(jié)構(gòu)的且具有啟動(dòng)子激活功能的短核苷酸序列。

15、在另一優(yōu)選例中，所述的短增強(qiáng)子(ste)元件的長(zhǎng)度為30-800bp。

16、在另一優(yōu)選例中，所述短增強(qiáng)子(ste)的長(zhǎng)度為40-600bp。

17、在另一優(yōu)選例中，所述短增強(qiáng)子(ste)的長(zhǎng)度為60-200bp。

18、在另一優(yōu)選例中，所述短增強(qiáng)子(ste)為植物內(nèi)源性短增強(qiáng)子。

19、在另一優(yōu)選例中，所述短增強(qiáng)子(ste)為水稻內(nèi)源性短增強(qiáng)子。

20、在另一優(yōu)選例中，所述短增強(qiáng)子(ste)來源于病毒。

21、在另一優(yōu)選例中，所述短增強(qiáng)子(ste)的序列選自下組：

22、(z1)如seq?id?no:1-4任一所示的多核苷酸；

23、(z2)與核苷酸序列與seq?id?no:1-4任一所示序列的同源性≥95％(較佳地≥98％)，且具有啟動(dòng)子激活功能的多核苷酸；

24、(z3)在如seq?id?no:1-4任一所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1-30個(gè)(較佳地1-20，更佳地1-10個(gè))核苷酸，且具有啟動(dòng)子激活功能的多核苷酸。

25、在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟：

26、(a)提供短增強(qiáng)子(ste)元件；

27、(b)在目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)效應(yīng)區(qū)中選擇插入位點(diǎn)，用定點(diǎn)切割核酸酶對(duì)所述插入位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)切割；

28、(c)在受體植物細(xì)胞中將步驟(a)的短增強(qiáng)子(ste)元件插入到步驟(b)切割后的插入位點(diǎn)中。

29、在另一優(yōu)選例中，所述定點(diǎn)切割是通過將編碼定點(diǎn)切割核酸酶的dna片段轉(zhuǎn)化植物受體，使受體細(xì)胞表達(dá)核酸酶，從而定點(diǎn)切割插入位點(diǎn)。

30、在另一優(yōu)選例中，所述編碼定點(diǎn)切割核酸酶的dna片段為表達(dá)crispr/cas9元件的dna片段。

31、在另一優(yōu)選例中，所述編碼定點(diǎn)切割核酸酶的dna片段通過基因槍或通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體植物，從而進(jìn)行定點(diǎn)切割。

32、在另一優(yōu)選例中，所述短增強(qiáng)子(ste)元件可正向或逆向插入所述插入位點(diǎn)。

33、在另一優(yōu)選例中，所述短增強(qiáng)子(ste)元件通過基因槍或通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體植物，并整合至插入位點(diǎn)中。

34、在另一優(yōu)選例中，所述短增強(qiáng)子(ste)元件通過非末端連接機(jī)制整合至插入位點(diǎn)。

35、在另一優(yōu)選例中，當(dāng)需要獲得較高倍數(shù)的轉(zhuǎn)錄激活效果時(shí)，所述短增強(qiáng)子(ste)元件的插入位置為所述目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1到-100bp的區(qū)域；當(dāng)需要獲得較低倍數(shù)的轉(zhuǎn)錄激活效果時(shí)，所述短增強(qiáng)子(ste)元件的插入位置為所述目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-500到-1500bp的區(qū)域。

36、在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄的短增強(qiáng)子(ste)元件，所述的短增強(qiáng)子(ste)元件為具有非回文型結(jié)構(gòu)的且具有啟動(dòng)子激活功能的短核苷酸序列；并且所述的短增強(qiáng)子(ste)元件的長(zhǎng)度為30-800bp。

37、在另一優(yōu)選例中，所述的ste元件為病毒來源的ste。

38、在另一優(yōu)選例中，所述的ste元件為水稻來源的ste。

39、在本發(fā)明的第三方面，提供了一種基因工程改造的啟動(dòng)子，所述的啟動(dòng)子是在原始啟動(dòng)子中對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)效應(yīng)區(qū)插入有本發(fā)明第二方面所述的短增強(qiáng)子(ste)元件。

40、在本發(fā)明的第四方面，提供了一種重組的表達(dá)盒，所述的表達(dá)盒包括本發(fā)明第三方面所述的基因工程改造的啟動(dòng)子以及與所述啟動(dòng)子操作性連接的目的基因。

41、在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)盒為線性的核酸構(gòu)建物。

42、在本發(fā)明的第五方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發(fā)明第二方面所述的短增強(qiáng)子(ste)元件、本發(fā)明第三方面所述的基因工程改造的啟動(dòng)子、或本發(fā)明第四方面所述的重組的表達(dá)盒。

43、在另一優(yōu)選例中，所述的載體為表達(dá)載體。

44、在另一優(yōu)選例中，所述的載體包括質(zhì)粒。

45、在本發(fā)明的第六方面，提供了一種基因工程化的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第五方面所述的載體；

46、或所述宿主細(xì)胞的基因組中整合有本發(fā)明第二方面所述的短增強(qiáng)子(ste)元件、本發(fā)明第三方面所述的基因工程改造的啟動(dòng)子、或本發(fā)明第四方面所述的重組的表達(dá)盒。

47、在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括植物細(xì)胞。

48、在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為體細(xì)胞。

49、在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括原核生物或真核細(xì)胞。

50、在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括農(nóng)桿菌。

51、在本發(fā)明的第七方面，提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括步驟：

52、(a)提供一轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞或植物愈傷組織，其中所述植物細(xì)胞或所述植物愈傷組織中細(xì)胞含有本發(fā)明第五方面所述的載體；或在所述細(xì)胞的基因組中整合有本發(fā)明第二方面所述的短增強(qiáng)子(ste)元件、本發(fā)明第三方面所述的基因工程改造的啟動(dòng)子、或本發(fā)明第四方面所述的重組的表達(dá)盒；和

53、(b)將所述植物細(xì)胞或植物愈傷組織再生為植株。

54、在本發(fā)明的第八方面，提供了一種試劑盒，所述的試劑盒含有以下試劑：

55、(a)本發(fā)明第二方面所述的短增強(qiáng)子(ste)元件、本發(fā)明第三方面所述的基因工程改造的啟動(dòng)子、本發(fā)明第四方面所述的重組的表達(dá)盒、本發(fā)明第五方面所述的載體；或含所述載體的農(nóng)桿菌；和

56、(b)用于對(duì)啟動(dòng)子中對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)效應(yīng)區(qū)的預(yù)定位置進(jìn)行基因編輯的基因編輯試劑。

57、在另一優(yōu)選例中，所述的基因編輯試劑包括(1)cas酶；和/或(2)對(duì)應(yīng)于所述預(yù)定位置的grna或其編碼序列。

58、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。