本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體的，涉及特異性地靶向gprc5d的單域抗體、該單域抗體構(gòu)建得到的靶向gprc5d的嵌合抗原受體、包含此類嵌合抗原受體的工程化的免疫效應(yīng)細(xì)胞，及其在診斷、預(yù)防和/或治療與gprc5d表達(dá)相關(guān)的疾病中的用途。

背景技術(shù)：

1、多發(fā)性骨髓瘤(multiple?myeloma,mm)是一種克隆漿細(xì)胞異常增殖導(dǎo)致的惡性疾病，被歸類為b細(xì)胞相關(guān)惡性腫瘤，在很多國家是排名第2位的常見血液系統(tǒng)惡性腫瘤，大約可以占到所有癌癥死亡病例人數(shù)的2％。多發(fā)性骨髓瘤臨床常見的癥狀包括骨髓瘤相關(guān)器官功能損傷的表現(xiàn)，即“crab”癥狀(血鈣增高(calcium?elevation)，腎功能損害(renalinsufficiency)，貧血(anemia)，骨病(bone?disease))以及繼發(fā)淀粉樣變性等相關(guān)表現(xiàn)。目前多發(fā)性骨髓瘤的首選治療方式為自體造血干細(xì)胞移植(asct)(參見中國醫(yī)師協(xié)會血液科醫(yī)師分會,中華醫(yī)學(xué)會血液學(xué)分會.中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2022年修訂)[j].中華內(nèi)科雜志,2022,61(5):480-487)。多發(fā)性骨髓瘤的傳統(tǒng)治療，諸如包括化學(xué)療法、放射性療法、干細(xì)胞移植、骨髓移植等，雖然目前的療法通常會使疾病得到緩解，但是幾乎所有患者最終都會復(fù)發(fā)。對于初治的多發(fā)性骨髓瘤患者，常用的一線治療藥物包括蛋白酶體抑制劑、免疫調(diào)節(jié)類藥物及烷化劑類藥物。對于大多數(shù)的患者，常用的一線治療可以使患者的病情穩(wěn)定3-5年，但也有少部分患者在初治時表現(xiàn)為原發(fā)耐藥，病情不能得到有效控制。對于治療有效的大多數(shù)初治患者，經(jīng)過疾病穩(wěn)定期后也會不可避免地進(jìn)入復(fù)發(fā)/難治階段。因此，有相當(dāng)數(shù)量的多發(fā)性骨髓瘤患者，特別是復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤患者仍存在未滿足的醫(yī)療需求。

2、在選擇治療靶點(diǎn)時，與其他的b細(xì)胞惡性腫瘤情況不同的是，在骨髓瘤患者中僅有2％觀察到cd19的表達(dá)，并且骨髓瘤中常見的細(xì)胞外免疫表型標(biāo)志物(cd138、cd38和cd56)都在其他基本細(xì)胞類型上共表達(dá)。目前多發(fā)性骨髓瘤的免疫療法中主要以bcma為靶點(diǎn)，但仍存在相當(dāng)數(shù)量的bcma陰性或bcma低表達(dá)的多發(fā)性骨髓瘤病患，以及采取bcma靶向治療后因抗原免疫逃逸而出現(xiàn)的bcma陰性復(fù)發(fā)的問題。因此，對基于能夠有效用于治療多發(fā)性骨髓瘤的新治療靶點(diǎn)開發(fā)的免疫治療方法仍存在大量未被滿足的需求。

3、gprc5d(g?protein-coupled?receptor,class?c,group?5,member?d)，即g蛋白偶聯(lián)受體家族c組5成員d，是g蛋白偶聯(lián)受體家族的成員，g蛋白偶聯(lián)受體是在人體中有重要的地位的膜蛋白受體，gprc5d作為一個新的g蛋白偶聯(lián)受體藥物靶點(diǎn)，暫未發(fā)現(xiàn)其內(nèi)源性配體，屬于一種孤兒受體?，F(xiàn)有研究顯示，gprc5d在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中特異性地高表達(dá)，幾乎不在正常組織上表達(dá)。gprc5d在漿細(xì)胞譜系上的獨(dú)有表達(dá)也使其有潛力成為為抗骨髓瘤治療的理想靶標(biāo)。研究還表明在bcma抗原丟失導(dǎo)致的腫瘤復(fù)發(fā)模型中，gprc5d靶向的car-t細(xì)胞具有抗腫瘤活性，在緩解bcma逃逸造成的腫瘤復(fù)發(fā)問題上，gprc5d將是一個極具潛力的特異性治療靶點(diǎn)。

4、單域抗體(single-domain?antibody,sdab)由于具有單個單體抗體的可變域而不同于傳統(tǒng)4鏈抗體。例如，駱駝科動物和鯊魚產(chǎn)生天然缺乏輕鏈的抗體，其被稱為僅含重鏈的抗體，或簡稱為重鏈抗體(hcab)。駱駝科動物重鏈抗體的每個臂中的抗原結(jié)合片段具有單個重鏈可變域，被稱為重鏈單域抗體(variabledomain?of?heavy?chain?of?heavy-chain?antibody,vhh)，這類vhh可在無需輕鏈的幫助下，對抗原具有高親和力。駱駝科動物來源的vhh抗體被稱為最小的功能性抗原結(jié)合片段，分子量僅為約15kd，因而又被稱為納米抗體(nanobodies,nbs)。vhh抗體具有可溶性好、穩(wěn)定性高、穿透力強(qiáng)、結(jié)合表位廣的天然優(yōu)勢，自被發(fā)現(xiàn)以來，逐漸受到免疫治療領(lǐng)域研究者的關(guān)注，對其的各類研究日趨成熟。在應(yīng)用方面，針對血液系統(tǒng)惡性腫瘤、自身免疫性疾病、病毒感染等已逐漸進(jìn)入臨床研究階段，在治療惡性腫瘤、自身免疫性疾病、抗感染等方面均表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢。

5、嵌合抗原受體(chimeric?antigen?receptor,car)修飾的t細(xì)胞作為一種免疫治療策略，在腫瘤治療中正在受到廣泛的重視和應(yīng)用，尤其是在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中。嵌合抗原受體是一種重組多肽構(gòu)建體，其原理為通過基因工程修飾，使t細(xì)胞表達(dá)可以特異性識別腫瘤細(xì)胞表面抗原的受體結(jié)構(gòu)(例如，單鏈抗體)，并在該受體與腫瘤細(xì)胞表面抗原特異性結(jié)合后，激活其下游的免疫共刺激因子和t細(xì)胞，從而活化t細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子，對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性殺傷，且不受對靶標(biāo)腫瘤抗原具有特異性的主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibility?complex,mhc)的限制。由于這種過程是以非mhc限制性的方式將t細(xì)胞定向至靶標(biāo)，因此繞過了腫瘤逃逸的主要機(jī)制。car的代表性結(jié)構(gòu)由細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(通常為具有抗原識別功能的單鏈抗體)、鉸鏈區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域四部分組成。目前根據(jù)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是否加入共刺激分子以及數(shù)量，通常將經(jīng)典的car結(jié)構(gòu)分為第一代(無共刺激分子)、第二代(包含一種共刺激分子)和第三代(包含兩種共刺激分子)，截至目前在上市產(chǎn)品和臨床研究階段中應(yīng)用最多的是第二代car結(jié)構(gòu)。由于car-t細(xì)胞制造技術(shù)需要使用結(jié)合活性好、結(jié)合表位高效的單鏈抗體，因此，car-t細(xì)胞療法的關(guān)鍵技術(shù)部分之一在于篩選特異性好、結(jié)合力強(qiáng)、結(jié)合表位有效的高親和力抗體。

6、因此，仍有廣泛需求篩選和開發(fā)改進(jìn)的靶向gprc5d的單域抗體、使用其構(gòu)建的靶向gprc5d的嵌合抗原受體以及工程化的免疫效應(yīng)細(xì)胞。特別是，開發(fā)適合用于更有效以及更高效的car-t細(xì)胞療法的特異性靶向gprc5d的單域抗體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種靶向gprc5d的單域抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明所述的靶向gprc5d單域抗體結(jié)構(gòu)為天然的單鏈結(jié)構(gòu)，具有小分子量、高溶解性、高穩(wěn)定性、低免疫原性、高組織滲透性以及不需要額外的折疊和組裝步驟或連接子優(yōu)化改造的優(yōu)勢，使其成為分子量較大的scfv單鏈抗體的有前途的替代方案，且使用所述單域抗體在構(gòu)建成car-t細(xì)胞后，具備顯著的特異性腫瘤細(xì)胞殺傷能力。

2、根據(jù)本公開的第一方面，提供一種靶向gprc5d的單域抗體。本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)，其中cdr1包含如seq?id?no:1-18所示的任一個氨基酸序列，其中cdr2包含如seq?id?no:19-33所示的任一個氨基酸序列，其中cdr3包含如seq?id?no:34-50所示的任一個氨基酸序列。

3、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)，其中cdr1為如seq?id?no:1-18中任一個所示的氨基酸序列，cdr2為如seq?id?no:19-33中任一個所示的氨基酸序列，cdr3為如seq?id?no:34-50中任一個所示的氨基酸序列。

4、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)，其中cdr1、cdr2和cdr3包含如表1所示的氨基酸序列。

5、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)，其中cdr1、cdr2和cdr3為如表1所示的氨基酸序列。

6、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:1所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:19所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:34所示的氨基酸序列。

7、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:1所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?idno:20所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:35所示的氨基酸序列。

8、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:2所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:21所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:36所示的氨基酸序列。

9、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:3所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:21所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:37所示的氨基酸序列。

10、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:4所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:21所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:37所示的氨基酸序列。

11、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:5所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:21所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:37所示的氨基酸序列。

12、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:2所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:22所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:37所示的氨基酸序列。

13、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:2所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:22所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:38所示的氨基酸序列。

14、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:6所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:22所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:38所示的氨基酸序列。

15、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:7所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:22所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:38所示的氨基酸序列。

16、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:8所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:23所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:39所示的氨基酸序列。

17、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:9所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:24所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:40所示的氨基酸序列。

18、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:10所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:25所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:41所示的氨基酸序列。

19、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:11所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:26所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:42所示的氨基酸序列。

20、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:12所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:26所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:43所示的氨基酸序列。

21、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:13所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:27所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:44所示的氨基酸序列。

22、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:14所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:28所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:45所示的氨基酸序列。

23、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:15所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:29所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:46所示的氨基酸序列。

24、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:15所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:30所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:47所示的氨基酸序列。

25、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:16所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:31所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:48所示的氨基酸序列。

26、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:17所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:32所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:49所示的氨基酸序列。

27、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1為如seq?id?no:18所示的氨基酸序列，其中cdr2為如seq?id?no:33所示的氨基酸序列，其中cdr3為如seq?id?no:50所示的氨基酸序列。

28、本發(fā)明所公開的技術(shù)方案，其中，seq?id?no:1-50所示的具體氨基酸序列信息如表1中所示。

29、表1

30、 seq?id?no： 氨基酸序列 1 giifgssv(cdr1) 2 gltfssya(cdr1) 3 gftfssya(cdr1) 4 grtfsaya(cdr1) 5 glafgsya(cdr1) 6 grtftnya(cdr1) 7 gfafnvya(cdr1) 8 grtfanya(cdr1) 9 ggtfssya(cdr1) 10 gltfssyt(cdr1) 11 grtfssya(cdr1) 12 grtfsnya(cdr1) 13 grtissla(cdr1) 14 grtittyt(cdr1) 15 grtfssys(cdr1) 16 grtasiyr(cdr1) 17 grsfknyg(cdr1) 18 gftfstsv(cdr1) 19 igyggnt(cdr2) 20 vgydgst(cdr2) 21 ispngagt(cdr2) 22 ispngaat(cdr2) 23 inpngaat(cdr2) 24 ispnggat(cdr2) 25 isqngvnt(cdr2) 26 inystgt(cdr2) 27 inwsgrqt(cdr2) 28 isegt(cdr2) 29 itrrgsst(cdr2) 30 ttrrgsdv(cdr2) 31 itwvgsrt(cdr2) 32 ikwsdgrt(cdr2) 33 hswrgtst(cdr2) 34 narrriny(cdr3) 35 narrridy(cdr3) 36 aadqihysrisysrmdy(cdr3) 37 aadqvhysrisysrmdy(cdr3) 38 aadqmhysrisysghnmdy(cdr3) 39 ashqmhysrilysghnmdy(cdr3) 40 aadhvhysrfsysamdy(cdr3) 41 aasprffarsysytaydy(cdr3) 42 aasrglrlltraseyty(cdr3) 43 aasrglrlltraseysy(cdr3) 44 aadtglllstmsqhydy(cdr3) 45 aasrglrrlvtpmnyny(cdr3) 46 aaalvlgptdsqdrypy(cdr3) 47 aaalvlgptdsqdryqy(cdr3) 48 aagfrttlteyts(cdr3) 49 aldaqprrildlkltsaydy(cdr3) 50 vksrgivagplgassvsn(cdr3)

31、本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1、cdr2和cdr3的確定是根據(jù)imgt編號方案、kabat編號方案、abm編號方案、chothia編號方案或contact編號方案。

32、本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)；其中cdr1、cdr2和cdr3的確定是根據(jù)imgt編號方案。

33、本發(fā)明提供的單域抗體或其cdr區(qū)涵蓋由上述編號方案、其他已知編號方案所定義的cdr，以及其他方法所確定的cdr。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，通過任何編號方案或任何方法進(jìn)行確定的cdr區(qū)，只要與本發(fā)明的cdr區(qū)相同，或包含本發(fā)明的cdr區(qū)，則均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

34、本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與表2所示或包含與seq?id?no:51-72所示的任一個氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

35、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:51所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

36、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:52所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

37、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:53所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

38、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:54所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

39、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:55所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

40、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:56所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

41、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:57所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

42、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:58所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

43、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:59所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

44、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:60所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

45、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:61所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

46、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:62所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

47、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:63所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

48、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:64所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

49、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:65所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

50、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:66所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

51、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:67所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

52、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:68所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

53、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:69所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

54、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:70所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

55、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:71所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

56、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含與seq?id?no:72所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

57、本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如表2所示或包含如seq?id?no:51-72所示的任一個氨基酸序列。

58、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:51所示的氨基酸序列。

59、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:52所示的氨基酸序列。

60、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:53所示的氨基酸序列。

61、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:54所示的氨基酸序列。

62、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:55所示的氨基酸序列。

63、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:56所示的氨基酸序列。

64、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:57所示的氨基酸序列。

65、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:58所示的氨基酸序列。

66、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:59所示的氨基酸序列。

67、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:60所示的氨基酸序列。

68、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:61所示的氨基酸序列。

69、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:62所示的氨基酸序列。

70、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:63所示的氨基酸序列。

71、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:64所示的氨基酸序列。

72、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:65所示的氨基酸序列。

73、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:66所示的氨基酸序列。

74、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:67所示的氨基酸序列。

75、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:68所示的氨基酸序列。

76、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:69所示的氨基酸序列。

77、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:70所示的氨基酸序列。

78、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:71所示的氨基酸序列。

79、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，包含如seq?id?no:72所示的氨基酸序列。

80、本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如表2所示或如seq?id?no:51-72所示的任一個氨基酸序列。

81、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:51所示的氨基酸序列。

82、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:52所示的氨基酸序列。

83、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:53所示的氨基酸序列。

84、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:54所示的氨基酸序列。

85、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:55所示的氨基酸序列。

86、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:56所示的氨基酸序列。

87、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:57所示的氨基酸序列。

88、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:58所示的氨基酸序列。

89、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:59所示的氨基酸序列。

90、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:60所示的氨基酸序列。

91、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:61所示的氨基酸序列。

92、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:62所示的氨基酸序列。

93、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:63所示的氨基酸序列。

94、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:64所示的氨基酸序列。

95、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:65所示的氨基酸序列。

96、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:66所示的氨基酸序列。

97、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:67所示的氨基酸序列。

98、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:68所示的氨基酸序列。

99、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:69所示的氨基酸序列。

100、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:70所示的氨基酸序列。

101、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:71所示的氨基酸序列。

102、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的靶向gprc5d的單域抗體，為如seq?id?no:72所示的氨基酸序列。

103、本發(fā)明所公開的技術(shù)方案，其中，seq?id?no:51-72所示的具體氨基酸序列信息如表2中所示。

104、表2

105、

106、根據(jù)本公開的第二方面，提供一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包含本發(fā)明所述的靶向gprc5d的單域抗體。

107、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體包含細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含如本發(fā)明所述的靶向gprc5d的單域抗體。

108、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體還可包含下述的一種或多種結(jié)構(gòu)：接頭(例如肽接頭)、信號肽、鉸鏈區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域、共刺激信號結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

109、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體包含：

110、(a)細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，

111、(b)跨膜結(jié)構(gòu)域，和

112、(c)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；

113、其中，所述細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含本公開第一方面所述的靶向gprc5d的單域抗體。

114、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體包含：

115、(a)細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，

116、(b)跨膜結(jié)構(gòu)域，和

117、(c)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；

118、其中，所述細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含靶向gprc5d的單域抗體，所述單域抗體包含cdr1、cdr2和cdr3區(qū)，其中cdr1、cdr2和cdr3區(qū)包含如本公開第一方面所述的靶向gprc5d的單域抗體的cdr1、cdr2和cdr3區(qū)。

119、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體包含：

120、(a)細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，

121、(b)跨膜結(jié)構(gòu)域，和

122、(c)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；

123、其中，所述細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含靶向gprc5d的單域抗體，所述單域抗體包含cdr1、cdr2和cdr3，其中cdr1、cdr2和cdr3為如本公開第一方面所述的靶向gprc5d的單域抗體的cdr1、cdr2和cdr3區(qū)。

124、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體包含：

125、(a)細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，

126、(b)跨膜結(jié)構(gòu)域，和

127、(c)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；

128、其中，所述細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含靶向gprc5d的單域抗體；其中，所述單域抗體包含與seq?id?no:51、seq?id?no:52、seq?id?no:53、seq?id?no:54、seq?id?no:55、seqid?no:56、seq?id?no:57、seq?id?no:58、seq?id?no:59、seq?id?no:60、seq?id?no:61、seqid?no:62、seq?id?no:63、seq?id?no:64、seq?id?no:65、seq?id?no:66、seq?id?no:67、seqid?no:68、seq?id?no:69、seq?id?no:70、seq?id?no:71或seq?id?no:72所示的任一個氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

129、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體包含：

130、(a)細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，

131、(b)跨膜結(jié)構(gòu)域，和

132、(c)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；

133、其中，所述細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含靶向gprc5d的單域抗體；其中，所述單域抗體包含如seq?id?no:51、seq?id?no:52、seq?id?no:53、seq?id?no:54、seq?id?no:55、seqid?no:56、seq?id?no:57、seq?id?no:58、seq?id?no:59、seq?id?no:60、seq?id?no:61、seqid?no:62、seq?id?no:63、seq?id?no:64、seq?id?no:65、seq?id?no:66、seq?id?no:67、seqid?no:68、seq?id?no:69、seq?id?no:70、seq?id?no:71或seq?id?no:72所示的任一個氨基酸序列。

134、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體包含：

135、(a)細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，

136、(b)跨膜結(jié)構(gòu)域，和

137、(c)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；

138、其中，所述細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含靶向gprc5d的單域抗體；其中，所述單域抗體為如seq?id?no:51、seq?id?no:52、seq?id?no:53、seq?id?no:54、seq?id?no:55、seq?idno:56、seq?id?no:57、seq?id?no:58、seq?id?no:59、seq?id?no:60、seq?id?no:61、seq?idno:62、seq?id?no:63、seq?id?no:64、seq?id?no:65、seq?id?no:66、seq?id?no:67、seq?idno:68、seq?id?no:69、seq?id?no:70、seq?id?no:71或seq?id?no:72所示的任一個氨基酸序列。

139、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中跨膜結(jié)構(gòu)域來源于cd8α、cd28、cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd4、cd5、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152、cd154、tcrα、tcrβ、tcrγ、tcrδ、tcrζ、ox40、icos、lag-3、2b4、btla、ctla-4、pd-1或它們的任何組合。

140、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中跨膜結(jié)構(gòu)域來源于cd8α。

141、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中跨膜結(jié)構(gòu)域包含如seq?idno:75所示的氨基酸序列。

142、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中跨膜結(jié)構(gòu)域?yàn)槿鐂eq?idno:75所示的氨基酸序列。

143、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如t細(xì)胞)的主要細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來源于fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b和cd66d或它們的任何組合。

144、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來源于cd3ζ。

145、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含如seq?id?no:77所示的氨基酸序列。

146、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域?yàn)槿鐂eq?id?no:77所示的氨基酸序列。

147、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中所述細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步包含共刺激信號結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，所述共刺激信號結(jié)構(gòu)域來源于mhc?i類分子、btla和toll配體受體。在一些實(shí)施方案中，所述共刺激信號結(jié)構(gòu)域來源于tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd134(ox40)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd83、icam、4-1bb(cd137)、cd276(b7-h3)、cd278(icos)、gitr、light、hvem(lightr)、btla、cd8α、lfa-1、nkg2c、lat、slp-76、dap10、pd-1、trim、zap70配體或它們的任何組合。

148、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中共刺激信號結(jié)構(gòu)域來源于4-1bb(cd137)。

149、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中共刺激信號結(jié)構(gòu)域包含如seq?id?no:76所示的氨基酸序列。

150、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中共刺激信號結(jié)構(gòu)域?yàn)槿鐂eqid?no:76所示的氨基酸序列。

151、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體還進(jìn)一步包含位于細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域c端和跨膜結(jié)構(gòu)域n端之間的鉸鏈區(qū)。

152、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中鉸鏈區(qū)來源于cd8α、cd28、cd137、igg4、igg1或它們的任何組合。

153、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中鉸鏈區(qū)來源于cd8α。

154、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中鉸鏈區(qū)包含如seq?id?no:74所示的氨基酸序列。

155、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中鉸鏈區(qū)為如seq?id?no:74所示的氨基酸序列。

156、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體還進(jìn)一步包含位于嵌合抗原受體多肽n端的信號肽。

157、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中信號肽來源于hla-a、cd8α、cd4、cd33、cd137、gm-csfrα、igg1、igκ、il-2或它們的任何組合。

158、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中信號肽來源于hla-a。

159、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中信號肽來源于cd8α。

160、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中信號肽包含如seq?id?no:73所示的氨基酸序列。

161、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，其中信號肽為如seq?id?no:73所示的氨基酸序列。

162、本發(fā)明所公開的技術(shù)方案，其中，seq?id?no:73-77所示的具體氨基酸序列信息如表3中所示。

163、表3

164、

165、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體多肽從n端到c端依次包含：hla-a信號肽或cd8α信號肽、細(xì)胞外抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、cd8α鉸鏈區(qū)、cd8α跨膜結(jié)構(gòu)域、源自4-1bb(cd137)的共刺激信號結(jié)構(gòu)域和源自cd3ζ的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

166、本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與表4所示或包含與seq?id?no:78-99所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

167、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:78所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

168、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:79所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

169、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:80所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

170、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:81所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

171、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:82所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

172、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:83所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

173、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:84所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

174、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:85所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

175、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:86所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

176、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:87所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

177、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:88所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

178、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:89所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

179、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:90所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

180、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:91所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

181、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:92所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

182、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:93所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

183、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:94所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

184、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:95所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

185、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:96所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

186、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:97所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

187、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:98所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

188、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含與seq?id?no:99所示的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

189、本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如表4所示或包含如seq?id?no:78-99所示的氨基酸序列。

190、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:78所示的氨基酸序列。

191、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:79所示的氨基酸序列。

192、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:80所示的氨基酸序列。

193、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:81所示的氨基酸序列。

194、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:82所示的氨基酸序列。

195、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:83所示的氨基酸序列。

196、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:84所示的氨基酸序列。

197、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:85所示的氨基酸序列。

198、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:86所示的氨基酸序列。

199、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:87所示的氨基酸序列。

200、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:88所示的氨基酸序列。

201、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:89所示的氨基酸序列。

202、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:90所示的氨基酸序列。

203、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:91所示的氨基酸序列。

204、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:92所示的氨基酸序列。

205、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:93所示的氨基酸序列。

206、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:94所示的氨基酸序列。

207、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:95所示的氨基酸序列。

208、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:96所示的氨基酸序列。

209、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:97所示的氨基酸序列。

210、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:98所示的氨基酸序列。

211、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，包含如seq?id?no:99所示的氨基酸序列。

212、本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如表4所示或?yàn)槿鐂eq?id?no:78-99所示的氨基酸序列。

213、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:78所示的氨基酸序列。

214、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:79所示的氨基酸序列。

215、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:80所示的氨基酸序列。

216、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:81所示的氨基酸序列。

217、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:82所示的氨基酸序列。

218、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:83所示的氨基酸序列。

219、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:84所示的氨基酸序列。

220、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:85所示的氨基酸序列。

221、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:86所示的氨基酸序列。

222、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:87所示的氨基酸序列。

223、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:88所示的氨基酸序列。

224、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:89所示的氨基酸序列。

225、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:90所示的氨基酸序列。

226、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:91所示的氨基酸序列。

227、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:92所示的氨基酸序列。

228、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:93所示的氨基酸序列。

229、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:94所示的氨基酸序列。

230、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:95所示的氨基酸序列。

231、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:96所示的氨基酸序列。

232、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:97所示的氨基酸序列。

233、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:98所示的氨基酸序列。

234、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的嵌合抗原受體，為如seq?id?no:99所示的氨基酸序列。

235、本發(fā)明所公開的技術(shù)方案，其中，seq?id?no:78-99所示的具體氨基酸序列信息如表4中所示。

236、表4

237、

238、

239、

240、

241、

242、

243、根據(jù)本公開的第三方面，提供一種分離的核酸，所述分離的核酸編碼本發(fā)明所述的嵌合抗原受體。

244、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸是dna形式或rna形式。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的dna包括cdna、基因組dna或人工合成的dna。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的dna是單鏈dna或雙鏈dna。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的dna是編碼鏈dna或非編碼鏈dna。

245、本發(fā)明提供的分離的核酸包含如表5所示或包含如seq?id?no:100-121所示的核酸序列。

246、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:100所示的核酸序列。

247、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:101所示的核酸序列。

248、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:102所示的核酸序列。

249、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:103所示的核酸序列。

250、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:104所示的核酸序列。

251、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:105所示的核酸序列。

252、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:106所示的核酸序列。

253、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:107所示的核酸序列。

254、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:108所示的核酸序列。

255、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:109所示的核酸序列。

256、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:110所示的核酸序列。

257、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:111所示的核酸序列。

258、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:112所示的核酸序列。

259、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:113所示的核酸序列。

260、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:114所示的核酸序列。

261、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:115所示的核酸序列。

262、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:116所示的核酸序列。

263、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:117所示的核酸序列。

264、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:118所示的核酸序列。

265、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:119所示的核酸序列。

266、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:120所示的核酸序列。

267、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的分離的核酸包含如seq?id?no:121所示的核酸序列。

268、本發(fā)明所公開的技術(shù)方案，其中，seq?id?no:100-121所示的具體核酸序列信息如表5中所示。

269、表5

270、

271、

272、

273、

274、

275、

276、

277、根據(jù)本公開的第四方面，提供一種載體，所述載體包含本發(fā)明所述的分離的核酸。

278、在一些實(shí)施方案中，載體適合于在真核細(xì)胞，例如哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制和整合。在一些實(shí)施方案中，載體是病毒載體。病毒載體的實(shí)例包括但不限于腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、牛痘載體、單純皰疹病毒載體及其衍生物。

279、在一些實(shí)施方案中，載體包含在宿主細(xì)胞中。

280、在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為殺傷性細(xì)胞。

281、在一些實(shí)施方案中，所述殺傷性細(xì)胞為t細(xì)胞或nk細(xì)胞。

282、在一些實(shí)施方案中，所述nk細(xì)胞為原代nk細(xì)胞。

283、在一些實(shí)施方案中，所述t細(xì)胞為外周血t淋巴細(xì)胞、臍帶血t淋巴細(xì)胞。

284、根據(jù)本公開的第五方面，提供一種工程化的免疫效應(yīng)細(xì)胞，其包含本發(fā)明所述的嵌合抗原受體或分離的核酸。

285、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的工程化的免疫效應(yīng)細(xì)胞可以選自t細(xì)胞、b細(xì)胞、nk細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、由誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(ipsc)分化而成的免疫效應(yīng)細(xì)胞或它們的任何組合。

286、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的工程化的免疫效應(yīng)細(xì)胞是t細(xì)胞。例如t細(xì)胞可以選自cd4+/cd8+t細(xì)胞、cd4+/cd8-t細(xì)胞、cd4-/cd8+t細(xì)胞、cd4-/cd8-t細(xì)胞、cd4+輔助t細(xì)胞(例如th1和th2細(xì)胞)、cd8+t細(xì)胞(例如細(xì)胞毒性t細(xì)胞)、腫瘤浸潤細(xì)胞、記憶t細(xì)胞、幼稚t細(xì)胞、γδ-t細(xì)胞、αβ-t細(xì)胞、nkt細(xì)胞、dnt細(xì)胞(雙陰性t細(xì)胞)。

287、在一些實(shí)施方案中，t細(xì)胞是cd4+/cd8-t細(xì)胞、cd4-/cd8+t細(xì)胞、cd4+/cd8+t細(xì)胞、cd4-/cd8-t細(xì)胞或其組合。

288、在一些實(shí)施方案中，t細(xì)胞在表達(dá)嵌合抗原受體并結(jié)合靶細(xì)胞(例如gprc5d+腫瘤細(xì)胞)后產(chǎn)生il-2、ifn-γ和/或tnf-α等細(xì)胞因子。在一些實(shí)施方案中，cd8+t細(xì)胞在表達(dá)嵌合抗原受體并與靶細(xì)胞結(jié)合后裂解抗原特異性靶細(xì)胞。

289、在一些實(shí)施方案中，免疫效應(yīng)細(xì)胞是nk細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫效應(yīng)細(xì)胞可以是已建立的細(xì)胞系，例如nk-92細(xì)胞。

290、在一些實(shí)施方案中，免疫效應(yīng)細(xì)胞可以是從干細(xì)胞分化而來，例如ipsc。

291、根據(jù)本公開的第六方面，提供一種藥物組合物，其包含本發(fā)明所述的gprc5d單域抗體、嵌合抗原受體、工程化的免疫效應(yīng)細(xì)胞和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體。

292、賦形劑和/或載體通常也稱為輔料。藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體包括但不限于填充劑、粘合劑、崩解劑、包衣劑、吸附劑、抗粘附劑、助流劑、抗氧化劑、調(diào)味劑、著色劑、甜味劑、溶劑、共溶劑、緩沖劑、螯合劑、表面活性劑、潤濕劑、防腐劑、乳化劑、包覆劑、等滲劑、吸收延遲劑、穩(wěn)定劑和張力調(diào)節(jié)劑、稀釋劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠意識到，藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體在所采用的劑量和濃度下對接受者無毒或基本上無毒，在藥理學(xué)和/或生理學(xué)上和本發(fā)明的活性成分相容，例如不影響其存活力或功效。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物可含有用于改善、維持或保留例如組合物的ph、滲透性、粘度、澄清度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩(wěn)定性、溶解或釋放速率、吸收或滲透的物質(zhì)?？梢曨A(yù)期的施用途徑、遞送方式和所需的劑量來確定最佳的藥物組合物。藥學(xué)上可接受的賦形劑的其他示例描述于remington和gennaro，remington’spharmaceuticalsciences(第18版，1990)中。

293、本發(fā)明的藥物組合物在一些實(shí)施方案中，以無菌制劑的形式提供。通過經(jīng)無菌過濾膜過濾來實(shí)現(xiàn)滅菌。在組合物凍干時，可在凍干、復(fù)溶、稀釋之前或之后使用此方法進(jìn)行滅菌。無菌制劑例如等滲水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液等。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物，其中藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或載體包括但并不限于：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、多元醇中的一種或多種。用于腸胃外施用的組合物可以凍干形式或在溶液中儲存。例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。腸胃外組合物通常放在具有無菌進(jìn)入孔的容器中，例如具有注射針可刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶。或者，可選擇組合物用于吸入或通過消化道(諸如經(jīng)口)遞送。所述藥學(xué)上可接受的組合物的制備在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。其它藥物組合物也將為本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，包括在持續(xù)或控制釋放遞送配制物中包含抗體或工程化的免疫效應(yīng)細(xì)胞的配制物。用于配制多種其它持續(xù)或可控傳遞方式的技術(shù)(諸如脂質(zhì)體載劑、生物易蝕微?；蚨嗫字榱：头e存注射)也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。藥物組合物一經(jīng)配制，就以溶液、懸浮液、凝膠、乳液、粘性組合物、固體、晶體或以凍干粉末的形式儲存于無菌小瓶中。所述配制物可儲存成即用形式或在施用前復(fù)溶經(jīng)處理使用的形式。

294、藥物組合物可以以任何方便的方式進(jìn)行使用，包括通過噴霧法、注射、吞咽、輸液、植入或移植。本發(fā)明的藥物組合物可通過例如經(jīng)口、經(jīng)鼻、通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)(腦實(shí)質(zhì)內(nèi))、腦室內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、動脈內(nèi)、門靜脈或病灶內(nèi)途徑注射，還可以通過持續(xù)釋放系統(tǒng)或通過植入裝置進(jìn)行施用。在一些實(shí)施方案中，通過胃腸外完成施用。胃腸外遞送方法包括局部、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、子宮內(nèi)、陰道內(nèi)、舌下或鼻內(nèi)施用。

295、將采用的含有本發(fā)明靶向gprc5d的單域抗體或工程化的免疫效應(yīng)細(xì)胞的藥物組合物的治療有效量將取決于例如治療程度和目標(biāo)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，用于治療的適當(dāng)劑量水平將部分取決于所遞送的分子、適應(yīng)癥、施用途徑和患者情況(體重、體表或器官大小)和/或狀況(年齡和一般健康狀況)而變化。在某些實(shí)施方式中，臨床醫(yī)生可滴定劑量并改變施用途徑來獲得最佳的治療效果。

296、給藥頻率將取決于所用配制物中靶向gprc5d的單域抗體或工程化的免疫效應(yīng)細(xì)胞的藥物動力學(xué)參數(shù)。臨床醫(yī)生典型地施用藥物組合物直到達(dá)到實(shí)現(xiàn)所需效果的劑量。藥物組合物因此可作為單次劑量施用，或隨時間以作為兩次或多次劑量(可含有或不含有相同量的所需分子)施用，或通過植入裝置或?qū)Ч芤赃B續(xù)輸液的方式施用。

297、根據(jù)本公開的第七方面，本發(fā)明提供一種如前所述的靶向gprc5d的單域抗體、嵌合抗原受體、工程化的免疫效應(yīng)細(xì)胞、或藥物組合物在制備用于診斷、預(yù)防和/或治療疾病或病癥的藥物中的用途。

298、本發(fā)明還提供一種治療與gprc5d表達(dá)相關(guān)的疾病的受試者的方法，包括向所述受試者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明所述的工程化的免疫效應(yīng)細(xì)胞或藥物組合物。因此，本發(fā)明提供了一種本發(fā)明所述的靶向gprc5d的單域抗體、嵌合抗原受體、工程化的免疫效應(yīng)細(xì)胞、或藥物組合物在制備用于診斷、預(yù)防和/或治療疾病或病癥的藥物中的用途。

299、在一些實(shí)施方案中，所述疾病或病癥包括與gprc5d表達(dá)相關(guān)的疾病或病癥。

300、在一些實(shí)施方案中，所述疾病或病癥是與gprc5d表達(dá)相關(guān)的癌癥、惡性腫瘤、自身免疫性和/或炎性疾病。

301、在一些實(shí)施方案中，所述與gprc5d表達(dá)相關(guān)的疾病或病癥為gprc5d表達(dá)相關(guān)的惡性腫瘤、gprc5d表達(dá)相關(guān)的自身免疫性疾病和/或炎性疾病。

302、在一些實(shí)施方案中，所述疾病或病癥是系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、瓦氏巨球蛋白血癥(waldenstrom’s?macroglobulinemia)、邊緣區(qū)淋巴瘤、彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、原發(fā)性縱隔大b細(xì)胞淋巴瘤、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤、b細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞白血病、濾泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、原發(fā)性眼內(nèi)淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、毛細(xì)胞白血病、前體b淋巴細(xì)胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、高級別b細(xì)胞淋巴瘤和/或多發(fā)性骨髓瘤。

303、在一些實(shí)施方案中，所述疾病或病癥是多發(fā)性骨髓瘤。

304、可采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備本發(fā)明的單域抗體、納米抗體或重鏈抗體，例如本領(lǐng)域熟知的噬菌體展示技術(shù)?；蛘?，本發(fā)明的各種抗體可在其他細(xì)胞系中表達(dá)。可用編碼本發(fā)明各種抗體的序列轉(zhuǎn)化合適的哺乳動物宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化可采用任何已知的方法進(jìn)行，例如包括將多核苷酸包裝在病毒(或病毒載體中)并用病毒(或載體)轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞。所用的轉(zhuǎn)化程序取決于將轉(zhuǎn)化的宿主。用于將異源多核苷酸引入哺乳動物細(xì)胞中的方法為本領(lǐng)域所熟知，包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、將多核苷酸包封在脂質(zhì)體中和將dna直接微注射至核中等?？捎糜诒磉_(dá)的宿主哺乳動物細(xì)胞系為本領(lǐng)域所熟知，例如可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)獲得的多種永生化細(xì)胞系，包括但不限于中國倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞、hela細(xì)胞、幼倉鼠腎(bhk)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(cos)、人肝細(xì)胞癌(hepg2)細(xì)胞等。尤其優(yōu)選的細(xì)胞系通過確定哪些細(xì)胞系具有高表達(dá)水平并產(chǎn)生具有基本gprc5d結(jié)合特性的抗體來進(jìn)行選擇。

305、可采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備本發(fā)明的嵌合抗原受體，可參見例如park?et?al,trends?bio?technol.,29:550-557,2011；grupp?et?al,n?engl?j?med.,368:1509-1518,2013；han?et?al,j.hematol.oncol.,6:47,2013。

306、本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，由于遺傳密碼的簡并性，可制得極大量的核酸，它們?nèi)烤幋a本發(fā)明的嵌合抗原受體。因此，在已鑒定特定氨基酸序列的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過以不改變編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列的方式簡單地修飾一個或多個密碼子的序列來制得任何數(shù)量的不同的核酸。所以，本發(fā)明還涉及與上述多核苷酸序列雜交且兩個序列之間具有至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％同一性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。

307、本發(fā)明各種嵌合抗原受體的核酸全長序列或其片段通?？梢杂胮cr擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。一種可行的方法是用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。此外，還可將重鏈的編碼序列和表達(dá)標(biāo)簽(如6his)融合在一起，形成融合蛋白。

308、本發(fā)明還涉及包含上述的核酸序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的核酸構(gòu)建物，例如表達(dá)載體和重組載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。載體通常含有用于質(zhì)粒維系和用于克隆與表達(dá)外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些實(shí)施方案中總稱為“側(cè)翼序列”)通常包括一個或多個以下核苷酸序列：啟動子、一個或多個增強(qiáng)子序列、復(fù)制起點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止序列、含有供體和受體剪接位點(diǎn)的完全內(nèi)含子序列、編碼用于多肽分泌的前導(dǎo)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、聚腺苷酸化序列、用于插入編碼將要表達(dá)的抗體的核酸的多連接子區(qū)和可選標(biāo)記元件。

309、一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。本發(fā)明所涉及的生物分子(核酸、多肽等)包括以分離的形式存在的生物分子。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明多肽(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可將該dna序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的dna分子(或載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明多肽序列中。

310、在一些實(shí)施方案中，編碼嵌合抗原受體的核酸可操作地連接到組成型啟動子。組成型啟動子允許異源基因(也稱為轉(zhuǎn)基因)在宿主細(xì)胞中組成型表達(dá)。本發(fā)明的示例性組成型啟動子包括但不限于巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動子、人延伸因子-1α(hef1α)啟動子、泛素c(ubic)啟動子、磷酸甘油激酶(pgk)啟動子、猿病毒40(sv40)早期啟動子，以及雞β-肌動蛋白與cmv早期增強(qiáng)子偶聯(lián)(cagg)啟動子。這種組成型啟動子在驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達(dá)方面的效率已在大量研究中進(jìn)行了廣泛比較。例如michael?c.milone等人(molecular?therapy,17(8):1453-1464(2009))比較了cmv、hef1α、ubic和pgk在人類原代t細(xì)胞中驅(qū)動嵌合抗原受體表達(dá)的效率，并得出結(jié)論，hef1α啟動子不僅誘導(dǎo)最高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，而且維持在cd4和cd8人t細(xì)胞中是最佳的。在一些實(shí)施方案中，編碼嵌合抗原受體的核酸可操作地連接到hef1α啟動子。

311、在一些實(shí)施方案中，編碼嵌合抗原受體的核酸可操作地連接至誘導(dǎo)型啟動子。誘導(dǎo)型啟動子屬于調(diào)節(jié)型啟動子。誘導(dǎo)型啟動子可以由一種或多種條件誘導(dǎo)，例如物理?xiàng)l件、誘導(dǎo)劑等。

312、在一些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)工程化哺乳動物細(xì)胞和/或接受藥物組合物的受試者中的內(nèi)源基因的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)條件選自：誘導(dǎo)劑、輻射(例如電離輻射、光)、溫度(例如熱)、氧化還原狀態(tài)、腫瘤環(huán)境和工程化哺乳動物細(xì)胞的活化狀態(tài)。

313、病毒載體技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，并且在sambrook等人的molecular?cloning:alaboratory?manual.cold?spring?harbor?laboratory?press,cold?spring?harbor.(2001)([分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊]，紐約冷泉港的冷泉港實(shí)驗(yàn)室，2001年)以及其他病毒學(xué)和分子生物學(xué)手冊中進(jìn)行過描述。

314、現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)開發(fā)了許多基于病毒的系統(tǒng)用于將基因轉(zhuǎn)移到哺乳動物細(xì)胞中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)將異源核酸插入載體并包裝在逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒中。然后可以在體外或離體分離重組病毒并將其遞送至工程化哺乳動物細(xì)胞。許多逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的。在一些實(shí)施方案中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體是本領(lǐng)域已知的。在一些實(shí)施方案中，使用自滅活慢病毒載體。例如，攜帶免疫調(diào)節(jié)劑(例如免疫檢查點(diǎn)抑制劑)編碼序列的自滅活慢病毒載體和/或攜帶嵌合抗原受體的自滅活慢病毒載體可以用本領(lǐng)域已知的方案包裝。在一些實(shí)施方案中，使用慢病毒載體。使用本領(lǐng)域已知的方法，所得慢病毒載體可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞(例如原代人t細(xì)胞)。

315、可以使用本領(lǐng)域中任何已知的分子克隆方法將核酸克隆到載體中，包括例如使用限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)和一種或多種選擇標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，核酸與啟動子可操作地連接?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)公開了多種用于哺乳動物細(xì)胞中的基因表達(dá)的啟動子，并且本領(lǐng)域已知的任何啟動子都可以用于本發(fā)明。啟動子可進(jìn)一步分為組成型啟動子或調(diào)節(jié)型啟動子，例如誘導(dǎo)型啟動子。

316、用重組dna轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收dna的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用cacl2法處理，所用的步驟為本領(lǐng)域所熟知。另一種方法是使用mgcl2。此外，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的dna轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。

317、獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，以表達(dá)本發(fā)明的核酸分子所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基，例如含血清培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。

318、在上述方法中的多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(hplc)和其它各種液相層析技術(shù)以及這些方法的結(jié)合。

319、本發(fā)明的工程化的免疫效應(yīng)細(xì)胞是通過將嵌合抗原受體引入免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如t細(xì)胞)中來制備的。

320、采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法(如通過轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化等)可以將編碼嵌合抗原受體的核酸序列引入免疫效應(yīng)細(xì)胞。

321、將載體或分離的核酸引入免疫效應(yīng)細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的。所描述的載體可以通過物理、化學(xué)或生物學(xué)方法轉(zhuǎn)移到免疫效應(yīng)細(xì)胞中。

322、將載體引入免疫效應(yīng)細(xì)胞的物理方法包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔等。用于制備包含載體和/或外源核酸的細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域眾所公知的，并且在例如sambrook,j.,fritsch,e.f.and?maniatis,t.(2001)molecular?cloning:alaboratory?manual.cold?spring?harbor?laboratory?press,cold?spring?harbor.以及其他病毒學(xué)和分子生物學(xué)手冊中進(jìn)行過描述。在一些實(shí)施方案中，通過電穿孔方法將載體引入免疫效應(yīng)細(xì)胞中。

323、將載體引入免疫效應(yīng)細(xì)胞的生物學(xué)方法包括使用dna和rna載體。病毒載體已成為將基因插入哺乳動物細(xì)胞(例如人類細(xì)胞)中最廣泛使用的方法。

324、將載體引入免疫效應(yīng)細(xì)胞的化學(xué)方法包括膠體分散系統(tǒng)，例如包括大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球、珠子和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，例如包括水包油乳液、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體。用作體外遞送載體的示例性膠體系統(tǒng)是脂質(zhì)體。

325、在一些實(shí)施方案中，載體還包含選擇標(biāo)記基因或報(bào)告基因以從通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞群中選擇表達(dá)嵌合抗原受體的細(xì)胞。選擇標(biāo)記和報(bào)告基因的兩側(cè)都可以有適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列以在宿主細(xì)胞中表達(dá)。例如，載體可以含有轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、起始序列和用于調(diào)節(jié)核酸序列表達(dá)的啟動子。

326、報(bào)告基因可用于識別可能轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和評估調(diào)節(jié)序列的功能。一般而言，報(bào)告基因是不存在于受體生物體或組織中或不由受體生物體或組織表達(dá)的基因，并且其編碼多肽，該多肽表達(dá)一些容易檢測的特性，例如酶活性。在將dna引入受體細(xì)胞后的合適時間測定報(bào)告基因的表達(dá)。合適的報(bào)告基因可以包括編碼熒光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、分泌型堿性磷酸酶或綠色熒光蛋白的基因(參見kumiko?ui-tei.febs?letters,479:79-82(2000))。合適的表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的并且可以使用已知技術(shù)制備或商業(yè)獲得。確認(rèn)工程化的免疫效應(yīng)細(xì)胞中存在編碼car的核酸的其他方法包括：本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的分子生物學(xué)測試方法，例如southern和northern印跡、rt-pcr和pcr；生化測定方法，例如檢測特定肽的存在或不存在；免疫學(xué)方法，例如elisa。

327、在一些實(shí)施方案中，編碼本文所述的任何car的核酸分子可以通過常規(guī)方法(例如體外轉(zhuǎn)錄)制備，然后通過已知方法例如mrna電穿孔引入免疫效應(yīng)細(xì)胞(參見petermrabinovich.human?gene?therapy,17:1027-1035(2006))。

328、在一些實(shí)施方案中，經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的免疫效應(yīng)細(xì)胞在引入載體或分離的核酸后進(jìn)行離體培養(yǎng)增殖。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的免疫效應(yīng)細(xì)胞以增殖至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或14天。在一些實(shí)施方案中，可以進(jìn)一步評估或篩選經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染的免疫效應(yīng)細(xì)胞以選擇工程化的免疫效應(yīng)細(xì)胞。

329、術(shù)語解釋：

330、除非另有說明，否則本文中所使用的所有術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解的相同。

331、本發(fā)明所用術(shù)語“序列同一性”表示兩個(核苷酸或氨基酸)序列在比對中在相同位置處具有相同殘基的程度，并且通常表示為百分?jǐn)?shù)。優(yōu)選地，同一性在被比較的序列的整體長度上確定。因此，具有完全相同序列的兩個拷貝具有100％同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，可以使用一些算法來確定序列同一性，例如blast(altschul等(1997)nucleicacidsres.25:3389-3402)、blast2(altschul等(1990)j.mol.biol.215:403-410)、smithwaterman(smith等(1981)j.mol.biol.147：195-197)和clustal?w。此外可以使用序列分析軟件進(jìn)行測定，例如使用缺省參數(shù)的計(jì)算機(jī)程序blast，尤其是blastp或tblastn。

332、本發(fā)明所用術(shù)語“來源于”表示兩者之間的關(guān)系，通常是指兩者之間的結(jié)構(gòu)相似性。例如，在來源于cd3ζ的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的情況下，細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域保留足夠的cd3ζ結(jié)構(gòu)，使得其具有所需的功能，即在適當(dāng)條件下產(chǎn)生信號的能力。它沒有暗示或包括對產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的特定過程的限制，例如，它并不意指為了提供細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，必須從cd3ζ序列開始并刪除不需要的序列，或強(qiáng)加突變，以到達(dá)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。

333、本發(fā)明所用術(shù)語“抗體”是指源自免疫球蛋白分子的蛋白質(zhì)或多肽序列，所述蛋白質(zhì)或多肽序列與抗原特異性結(jié)合。包括例如，單克隆抗體(包括完整抗體)、多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、雙抗體和單鏈分子，和能夠表現(xiàn)期望的生物活性的攜帶一個或多個cdr序列的抗體片段或合成多肽，尤其是抗原結(jié)合片段，例如fab，f(ab’)2和fv。在本發(fā)明一些實(shí)施例中，術(shù)語“免疫球蛋白(ig)”和“抗體”可互換地使用。

334、抗體的“可變區(qū)”或“可變結(jié)構(gòu)域”是指抗體的重鏈或輕鏈的氨基末端結(jié)構(gòu)域。重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域可分別稱為“vh”和“vl”。這些結(jié)構(gòu)域通常是抗體的最可變的部分(相對于相同類型的其它抗體)并含有抗原結(jié)合位點(diǎn)。

335、重鏈抗體是源自駱駝科生物或軟骨魚科生物的抗體。相比4鏈抗體，重鏈抗體缺失輕鏈和重鏈恒定區(qū)1(ch1)，僅包含2條由可變區(qū)(vhh)和其他恒定區(qū)組成重鏈，可變區(qū)通過類似鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)與恒定區(qū)相連。駱駝科重鏈抗體的每條重鏈包含1個可變區(qū)(vhh)和2個恒定區(qū)(ch2和ch3)，軟骨魚科重鏈抗體的每條重鏈含有1個可變區(qū)和5個恒定區(qū)(ch1-ch5)。重鏈抗體的抗原結(jié)合片段包括vhh和單鏈重鏈抗體。通過與人igg?fc的恒定區(qū)融合，重鏈抗體可以具有人igg?fc的ch2和ch3。

336、本發(fā)明所用術(shù)語“抗原”或“ag”是指引起免疫應(yīng)答的分子。免疫應(yīng)答可以涉及抗體產(chǎn)生或特定免疫活性細(xì)胞的活化或兩者皆有。技術(shù)人員將理解實(shí)際上包括所有蛋白質(zhì)或肽的任何大分子都可以充當(dāng)抗原。此外，抗原可以源自重組或基因組dna。技術(shù)人員將理解包含編碼引發(fā)免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna都因此編碼“抗原”?？乖梢院铣僧a(chǎn)生或可以源自生物樣品，或者可以是除多肽外的大分子。這種生物樣品可以包括但不限于組織樣品、腫瘤樣品、細(xì)胞或具有其他生物組分的流體。

337、本發(fā)明所用術(shù)語“抗原結(jié)合片段”或“抗體片段”，是指包含完整抗體或其重組變體的至少一部分，一般包含完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)并因此保留結(jié)合抗原的能力?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于：fab、scfv、抗體的重鏈可變區(qū)(vh)、線性抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、納米抗體、抗原的天然配體或其功能性片段等。

338、本發(fā)明所用術(shù)語“功能性變體”或“功能性片段”是指基本上包含親本的氨基酸序列但與該親本氨基酸序列相比含有至少一個氨基酸修飾(例如取代、缺失或插入)的變體，條件是所述變體保留親本氨基酸序列的生物活性。在一些實(shí)施方案中，所述氨基酸修飾是保守型修飾。

339、單域抗體(sdab)可以具有相同或不同的來源，并且具有相同或不同的大小。示例性的sdab包括但不限于來自僅重鏈抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如vhh)、天然沒有輕鏈的結(jié)合分子、單結(jié)構(gòu)域(例如vh或vl)衍生自常規(guī)4鏈抗體、由表達(dá)人類重鏈片段的轉(zhuǎn)基因小鼠或大鼠產(chǎn)生的人類單域抗體，以及非衍生自抗體的工程域和單域支架。本領(lǐng)域已知的或由本發(fā)明公開的任何sdab，包括本發(fā)明公開的單域抗體，可用于構(gòu)建本文所述的car。sdab可以來源于任何物種，包括但不限于小鼠、大鼠、人、駱駝、美洲駝、七鰓鰻、鯊魚、山羊、兔和牛。本發(fā)明的單域抗體還包括來自駱駝科和鯊魚以外的物種的天然存在的單域抗體分子。

340、在本發(fā)明中“單域抗體”、“靶向gprc5d的單域抗體”、“重鏈單域抗體”、“vhh”、“納米抗體”可互換使用，均指特異性識別和結(jié)合于gprc5d的單域抗體。通常，單域抗體含有三個cdr區(qū)和四個fr區(qū)。單域抗體是最小的功能性抗原結(jié)合片段。通常是先獲得天然缺失輕鏈和重鏈恒定區(qū)1(ch1)的抗體后，再克隆抗體重鏈的可變區(qū)，構(gòu)建僅由一個重鏈可變區(qū)組成的單域抗體。

341、本發(fā)明所用術(shù)語“互補(bǔ)性決定區(qū)”或“cdr”是指抗體可變區(qū)內(nèi)的賦予抗原特異性和結(jié)合親和力的氨基酸的序列。一般來說，每個重鏈可變區(qū)中存在三個cdr(例如hcdr1、hcdr2、和hcdr3)，以及每個輕鏈可變區(qū)中存在三個cdr(lcdr1、lcdr2、和lcdr3)。

342、包含抗體或其抗體片段的嵌合抗原受體的部分可以以多種形式存在，例如其中抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域表達(dá)為多肽鏈(包括例如單結(jié)構(gòu)域抗體片段(sdab)、單鏈抗體(scfv)，或例如人或人源化抗體)的一部分，參見harlow?et?al.,1999,in:using?antibodies:alaboratory?manual,cold?spring?harbor?laboratory?press,ny；harlow?et?al.,1989,in:antibodies:a?laboratory?manual,cold?spring?harbor,new?york；houston?et?al.,1988,proc.natl.acad.sci.usa?85:5879-5883；bird?et?al.,1988,science?242:423-426。

343、“抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指嵌合抗原受體的與靶抗原特異性結(jié)合的部分，嵌合抗原受體可以利用其抗原結(jié)合特性將t細(xì)胞和/或其他免疫細(xì)胞定向至所選擇的靶標(biāo)?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域可以典型地包含抗體輕鏈可變區(qū)(vl)和抗體重鏈可變區(qū)(vh)，但是其不必同時包含這兩個可變區(qū)。例如，可包括具有抗原結(jié)合活性的fab片段，fab’片段、單一fv片段例如scfv、單域抗體等。

344、“跨膜結(jié)構(gòu)域”是用于連接嵌合抗原受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?？缒そY(jié)構(gòu)域可以是天然或合成的，也可以源自任何膜結(jié)合蛋白或跨膜蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)域的非限制性實(shí)例包括，tcrα、tcrβ、tcrγ、tcrδ、tcrζ、cd28、cd3ζ、cd3ε、cd3γ、cd3δ、cd45、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152、cd154、ox40、icos、lag-3、2b4、btla、ctla-4、pd-1。

345、“胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”是指蛋白質(zhì)的功能性部分，即足以轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)子功能信號的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的功能性部分。胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)在抗原結(jié)合區(qū)結(jié)合抗原以后的細(xì)胞內(nèi)初級信號傳遞，從而導(dǎo)致免疫細(xì)胞和免疫反應(yīng)的活化。換言之，胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)活化其中表達(dá)car的免疫細(xì)胞的正常的效應(yīng)子功能的至少一種。例如，t細(xì)胞的效應(yīng)子功能可以是細(xì)胞溶解活性或輔助活性，包括細(xì)胞因子的分泌。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合抗原受體包含的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以是t細(xì)胞受體和共受體的細(xì)胞質(zhì)序列，其在抗原受體結(jié)合以后一同起作用以引發(fā)信號傳導(dǎo)，以及這些序列的任何衍生物或變體和具有相同或相似功能的任何合成序列。胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以包含許多免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptor?tyrosine-based?activation?motifs,itam)。胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的非限制性實(shí)例包括但不限于fcrγ、fcrβ、tcrζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd278(icos)、fcεri、dap10、dap12或cd66d。

346、“鉸鏈區(qū)”是指用于連接跨膜結(jié)構(gòu)域和抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何寡肽或多肽。具體地，鉸鏈區(qū)用來為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域提供更大的靈活性和可及性。鉸鏈區(qū)可以包含最多達(dá)300個氨基酸，優(yōu)選10至100個氨基酸并且最優(yōu)選25至50個氨基酸。鉸鏈區(qū)可以全部或部分源自天然分子，例如全部或部分源自cd8或cd28的胞外區(qū)，或全部或部分源自抗體恒定區(qū)。或者，鉸鏈區(qū)可以是對應(yīng)于天然存在的鉸鏈序列的合成序列，或可以是完全合成的鉸鏈序列。

347、car的不同結(jié)構(gòu)域也可以通過肽接頭相互融合。這取決于單域抗體和/或各種域的結(jié)構(gòu)和/或功能特征，car中的每個肽接頭可以具有相同或不同的長度和/或序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獨(dú)立地選擇和優(yōu)化每個肽接頭。在一些實(shí)施方案中，肽接頭由通過肽鍵連接在一起的氨基酸組成，其中氨基酸選自20種天然存在的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，這些氨基酸中的一種或多種可以被糖基化。在一些實(shí)施方案中，肽接頭包含柔性殘基(例如甘氨酸和絲氨酸)，使得相鄰結(jié)構(gòu)域可以相對于彼此自由移動。例如，甘氨酸-絲氨酸雙聯(lián)體可以是合適的肽接頭。

348、肽接頭可以具有任何合適的長度。在一些實(shí)施方案中，肽接頭是至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100個或更多個氨基酸長度。在一些實(shí)施方案中，肽接頭不超過為約100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5個或更少的氨基酸長度。在一些實(shí)施方案中，肽接頭的長度為約1個氨基酸至約10個氨基酸、約1個氨基酸至約20個氨基酸、約1個氨基酸至約30個氨基酸、約5個氨基酸至約15個氨基酸、約10個氨基酸至約25個氨基酸、約5個氨基酸至約30個氨基酸、約10個氨基酸至約30個氨基酸、約30個氨基酸至約50個氨基酸、約50個氨基酸至約100個氨基酸、或約1個氨基酸至約100個氨基酸。

349、肽接頭可以具有天然存在的序列或非天然存在的序列。例如，源自僅重鏈抗體的鉸鏈區(qū)的序列可以用作接頭。參見，例如wo1996/34103。在一些實(shí)施方案中，肽接頭是柔性接頭。示例性柔性接頭包括但不限于甘氨酸聚合物(g)n，甘氨酸-絲氨酸聚合物(例如(gs)n、(gsg)n、(gggs)n和(ggggs)n，其中n是至少1的整數(shù))、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-絲氨酸聚合物和本領(lǐng)域已知的其他柔性接頭。

350、“共刺激信號結(jié)構(gòu)域”可以是來自共刺激分子的細(xì)胞內(nèi)功能性信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其包含所述共刺激分子的整個細(xì)胞內(nèi)部分，或其功能片段?！肮泊碳し肿印笔侵冈趖細(xì)胞上與共刺激配體特異性結(jié)合，由此介導(dǎo)t細(xì)胞的共刺激反應(yīng)(例如增殖)的同源結(jié)合配偶體。共刺激結(jié)構(gòu)域的非限制性實(shí)例包括但不限于以下蛋白質(zhì)的胞內(nèi)區(qū)：mhc?i類分子、tnf受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細(xì)胞因子受體、整聯(lián)蛋白、信號傳導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化分子(slam蛋白)、激活性nk細(xì)胞受體、tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd134(ox40)、cd2、cd3、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd83、cds、icam、cd137(4-1bb)、cd276(b7-h3)、cd278(icos)、gitr、baffr、light、hvem(lightr)、btla、kirds2、slamf7、nkp80(klrf1)、nkp44、nkp30、nkp46、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、itgb7、nkg2d、nkg2c、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(tactile)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a、cd28-ox40、cd28-4-1bb、dap10、pd-1、trim、zap70配體或它們的任何組合。

351、“信號肽”可以使得嵌合抗原受體在細(xì)胞(例如t細(xì)胞)中表達(dá)時，使新生蛋白質(zhì)被引導(dǎo)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并隨后引導(dǎo)至細(xì)胞表面。通常，信號肽的核心可以含有長的疏水性氨基酸區(qū)段，其具有形成單個α-螺旋的傾向。信號肽指導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)穿過膜的轉(zhuǎn)運(yùn)和/或分泌。在信號肽的末端，通常有被信號肽酶識別和切割的氨基酸區(qū)段。信號肽酶可以在移位期間或完成后切割，以產(chǎn)生游離信號肽和成熟蛋白。然后，游離信號肽被特定蛋白酶消化。信號肽也可以被稱為靶向信號、轉(zhuǎn)運(yùn)肽、定位信號或信號序列。例如，信號序列可以是共翻譯或翻譯后信號肽。

352、“免疫效應(yīng)細(xì)胞”是指可以執(zhí)行免疫效應(yīng)功能(例如細(xì)胞毒性細(xì)胞殺傷活性、分泌細(xì)胞因子、誘導(dǎo)adcc和/或cdc)的免疫細(xì)胞。例如，免疫效應(yīng)細(xì)胞可以是t細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、nk細(xì)胞和/或nkt細(xì)胞，或者是衍生自干細(xì)胞，例如成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、祖細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、全能干細(xì)胞或造血干細(xì)胞等的免疫細(xì)胞。當(dāng)免疫效應(yīng)細(xì)胞是t細(xì)胞時，t細(xì)胞可以是任何t細(xì)胞，如體外培養(yǎng)的t細(xì)胞，例如原代t細(xì)胞，或者來自體外培養(yǎng)的t細(xì)胞系例如jurkat、supt1等的t細(xì)胞，或獲得自受試者的t細(xì)胞。受試者的實(shí)例包括人、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉(zhuǎn)基因物種。t細(xì)胞可以從多種來源獲得，包括外周血單核細(xì)胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍血、胸腺組織、來自感染部位的組織、腹水、胸膜積液、脾組織及腫瘤。t細(xì)胞也可以被濃縮或純化。t細(xì)胞可以處于任何發(fā)育階段，包括但不限于，cd4+/cd8+t細(xì)胞、cd4+輔助t細(xì)胞(例如th1和th2細(xì)胞)、cd8+t細(xì)胞(例如細(xì)胞毒性t細(xì)胞)、cd4-/cd8-t細(xì)胞、腫瘤浸潤細(xì)胞、記憶t細(xì)胞、幼稚t細(xì)胞、γδ-t細(xì)胞、αβ-t細(xì)胞等。

353、本發(fā)明所用術(shù)語“患者”、“受試者”、“個體”、“對象”在本文中可互換使用，包括任何生物體，優(yōu)選動物，更優(yōu)選哺乳動物(例如大鼠、小鼠、狗、貓、兔等)，且最優(yōu)選的是人。

354、“治療”指向受試者采用本發(fā)明所述治療方法以達(dá)到至少一種陽性治療效果(例如癌細(xì)胞數(shù)目減少、腫瘤體積減小、癌細(xì)胞浸潤至周邊器官的速率降低或腫瘤轉(zhuǎn)移或腫瘤生長的速率降低)。有效治療患者的治療方法可根據(jù)多種因素(例如患者的疾病狀態(tài)、年齡、體重以及療法激發(fā)受試者的抗癌反應(yīng)能力)調(diào)整。