本發(fā)明涉及微流控芯片，具體涉及一種用于研究膠質(zhì)瘤car-t療法的動(dòng)態(tài)微流控芯片裝置、制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，占成人惡性腦腫瘤的75%。其標(biāo)準(zhǔn)治療方案包括手術(shù)切除腫瘤、放療和化療。然而，接受常規(guī)治療的膠質(zhì)瘤患者預(yù)后較差。隨著免疫療法的發(fā)展，基于嵌合抗原受體t細(xì)胞（car-t）的免疫療法為膠質(zhì)瘤治療帶來了新的希望。在體外擴(kuò)增并經(jīng)過基因工程改造的car-t細(xì)胞能夠靶向并裂解攜帶相關(guān)腫瘤抗原的細(xì)胞，其中靜脈內(nèi)遞送是最簡(jiǎn)易和常見的給藥方式。盡管car-t細(xì)胞療法在癌癥治療領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展，但在膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中的應(yīng)用仍然受到血腦屏障（bbb）等物理障礙的限制。

2、血腦屏障是一種由腦毛細(xì)血管壁和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，嚴(yán)格調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞運(yùn)輸?shù)街袠猩窠?jīng)系統(tǒng)的能力。因此，car-t細(xì)胞療法的療效特別依賴于治療性免疫細(xì)胞能否有效穿過血腦屏障以誘導(dǎo)大腦抗腫瘤反應(yīng)。血腦屏障的存在使得car-t細(xì)胞在腦組織中的精確靶向輸送和最大化治療效果面臨挑戰(zhàn)。

3、為了體外模擬生理或病理?xiàng)l件下的血腦屏障模型，多種微流控芯片應(yīng)運(yùn)而生。然而，現(xiàn)有的微流控芯片在模擬自然大腦中血腦屏障的復(fù)雜生理特征方面仍存在不足：

4、cn106811408a公開了一種基于微流控芯片的三維血腦屏障模型的建立方法。這種微流控芯片通過膠原通道層的構(gòu)建解決了細(xì)胞間非接觸式共培養(yǎng)中二次接種和消耗時(shí)間長(zhǎng)的問題，但其共培養(yǎng)系統(tǒng)僅包含腦星形膠質(zhì)細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，無法復(fù)現(xiàn)自然血腦屏障的多細(xì)胞、三維復(fù)雜結(jié)構(gòu)特征；

5、cn108823145a公開了一種人腦微血管生成模擬血腦屏障的體外構(gòu)建方法，這種構(gòu)建方法通過在上室與下室之間設(shè)置培養(yǎng)基落差，使得培養(yǎng)基在一定時(shí)間內(nèi)由于存在勢(shì)能差而保持流動(dòng)性，但此種液體壓力依賴勢(shì)能差；

6、cn215162826u公開了一種血腦屏障微流控芯片，這種芯片通過周期性的氣壓控制促使培養(yǎng)液流動(dòng)，以模擬考慮血管內(nèi)的流體環(huán)境，但該裝置培養(yǎng)室之間的微孔薄膜阻礙細(xì)胞間的相互作用，影響血腦屏障模型的屏障功能。

7、利用微流控芯片為技術(shù)平臺(tái)建立病理?xiàng)l件下的血腦屏障模型后，進(jìn)一步應(yīng)用于疾病治療還具有巨大發(fā)展?jié)摿?，然而利用微流控芯片體外模擬car-t細(xì)胞治療中血腦屏障和腫瘤細(xì)胞生理狀況的研究尚處于空白。因此有必要開發(fā)一種用于血腦屏障-膠質(zhì)瘤car-t細(xì)胞療法的動(dòng)態(tài)微流控芯片裝置，以實(shí)現(xiàn)car-t細(xì)胞療法更準(zhǔn)確的體外評(píng)估，為car-t細(xì)胞在腦組織中的精確靶向輸送和治療效果的最大化奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的第一個(gè)目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種用于研究膠質(zhì)瘤car-t療法的動(dòng)態(tài)微流控芯片裝置的制備方法，該方法制備出能夠?qū)崿F(xiàn)膠質(zhì)瘤微環(huán)境模擬的微流控芯片。

2、本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種用于研究膠質(zhì)瘤car-t療法的動(dòng)態(tài)微流控芯片裝置，該裝置用于實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤微環(huán)境模擬。

3、本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種用于研究膠質(zhì)瘤car-t療法的動(dòng)態(tài)微流控芯片裝置的應(yīng)用，該應(yīng)用為體外評(píng)估治療膠質(zhì)瘤的car-t細(xì)胞療法提供了一種新的研究手段。

4、本發(fā)明的目的可以通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

5、一種用于研究膠質(zhì)瘤car-t療法的動(dòng)態(tài)微流控芯片裝置的制備方法，包括以下步驟：

6、s1、微流控芯片的制造：采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)微流控芯片的通道，微流控芯片的通道包括血管通道、腦實(shí)質(zhì)通道、腫瘤通道和蛛網(wǎng)膜下腔通道，并通過3d打印技術(shù)制造獲得微流控芯片的母模；使用聚二甲基硅氧烷材料澆注到微流控芯片的母模上進(jìn)行固化，然后脫模并打孔，最終獲得具有所需通道結(jié)構(gòu)的微流控芯片；

7、s2、神經(jīng)組織的重建：準(zhǔn)備星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的懸液；將上述兩種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與可溶性基底膜（bme）水凝膠預(yù)聚物均勻混合，形成凝膠-神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞混合物；將微流控芯片放置在低溫環(huán)境中，隨后將凝膠-神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞混合物注射到腦實(shí)質(zhì)通道中，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中凝膠化，以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的三維培養(yǎng)；

8、s3、血腦屏障的重構(gòu)：準(zhǔn)備人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人周細(xì)胞的懸液；將上述兩種細(xì)胞懸液混合后注入微流控芯片的血管通道中，與已建立的神經(jīng)組織共培養(yǎng)；經(jīng)過一定時(shí)間的共培養(yǎng)后，傾斜微流控芯片，使人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人周細(xì)胞粘附于血管通道與腦實(shí)質(zhì)通道的交界面上，動(dòng)態(tài)孵育以形成血腦屏障微結(jié)構(gòu)；

9、s4、腦膠質(zhì)瘤微環(huán)境的模擬：配制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液，并將其與可溶性基底膜（bme）水凝膠預(yù)聚物混合，形成凝膠-腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞混合物；將凝膠-腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞混合物注射到微流控芯片的腫瘤通道中；同時(shí)配制成纖維細(xì)胞懸液，注入蛛網(wǎng)膜下腔通道后傾斜微流控芯片，使成纖維細(xì)胞粘附于腫瘤通道與蛛網(wǎng)膜下腔通道的交界面上，動(dòng)態(tài)孵育以形成軟腦膜微結(jié)構(gòu)。

10、作為一種優(yōu)選，在步驟s2中，神經(jīng)組織的重建包括以下步驟：

11、s21、配制神經(jīng)細(xì)胞懸液：使用補(bǔ)充有胎牛血清（fbs）的eagle培養(yǎng)基、emem培養(yǎng)基分別復(fù)蘇和培養(yǎng)永生化人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞系、永生化人腦小膠質(zhì)細(xì)胞系；培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)80~90％時(shí)，分別收集星形膠質(zhì)細(xì)胞懸液和小膠質(zhì)細(xì)胞懸液，然后將收集到的星形膠質(zhì)細(xì)胞懸液和小膠質(zhì)細(xì)胞懸液均勻混合，形成神經(jīng)細(xì)胞混合懸液；

12、s22、接種神經(jīng)細(xì)胞：將上述配制好的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞混合懸液與可溶性基底膜（bme）水凝膠預(yù)聚物均勻混合，形成凝膠-神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞混合物；將微流控芯片放置在冷袋上，再將凝膠-神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞混合物注射到腦實(shí)質(zhì)通道中；注射完成后，將進(jìn)樣后的微流控芯片轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行恒溫凝膠化；

13、s23、培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞：凝膠化后，在不添加fbs的情況下，重新配置eagle培養(yǎng)基和emem培養(yǎng)基，并混合得到無血清神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基；將配制好的無血清神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基分別注入血液通道和蛛網(wǎng)膜下腔通道；在血腦屏障重構(gòu)之前的5天內(nèi)，每日更換一次培養(yǎng)基。

14、作為一種優(yōu)選，在步驟s3中，血腦屏障的重構(gòu)包括以下步驟：

15、s31、配制血腦屏障細(xì)胞懸液：使用ecm培養(yǎng)基、pm培養(yǎng)基分別復(fù)蘇和培養(yǎng)永生化人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系、永生化人腦周細(xì)胞系；培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)80~90％時(shí)，分別收集人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞懸液和人周細(xì)胞懸液懸液，然后將收集到的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞懸液和人周細(xì)胞懸液均勻混合，形成血腦屏障細(xì)胞混合懸液；

16、s32、接種血腦屏障細(xì)胞：將上述配制好的血腦屏障細(xì)胞混合懸液注入血管通道中，使其與在步驟s2中已經(jīng)重建的神經(jīng)組織共培養(yǎng)；共培養(yǎng)4天后，傾斜微流控芯片，使人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人周細(xì)胞粘附于血液通道與腦實(shí)質(zhì)通道的交界面上，模擬體內(nèi)血腦屏障的真實(shí)結(jié)構(gòu)；

17、s33、培養(yǎng)血腦屏障細(xì)胞：在不添加fbs的情況下，重新配置ecm培養(yǎng)基和pm培養(yǎng)基，并混合得到含血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基；將配制好的含血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基注入血液通道，利用流動(dòng)作用去除未成功粘附的細(xì)胞和任何可能存在的碎片；繼續(xù)動(dòng)態(tài)培養(yǎng)3天，在此期間每日更換血液通道中的含血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，以及蛛網(wǎng)膜下腔通道中的無血清神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基。

18、作為一種優(yōu)選，在步驟s4中，神經(jīng)組織的重建包括以下步驟：

19、s41、配制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液：使用補(bǔ)充有5%fbs和1%青霉素/鏈霉素溶液的dmem培養(yǎng)基復(fù)蘇和培養(yǎng)永生化人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系；當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80~90%時(shí)，收集腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液；

20、s42、接種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞：將上述配制好的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液與bme水凝膠預(yù)聚物均勻混合，形成凝膠-腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞混合物；將微流控芯片放置在冷袋上，再將凝膠-腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞混合物注射到腫瘤通道中；注射完成后，將進(jìn)樣后的微流控芯片轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行恒溫凝膠化；凝膠化后，將無血清神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基注入蛛網(wǎng)膜下腔通道，并繼續(xù)培養(yǎng)1~2天，期間每日更換一次培養(yǎng)基，以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)；

21、s43、構(gòu)建軟腦膜：使用補(bǔ)充有2mm/l谷氨酰胺和10%fbs的dmem培養(yǎng)基復(fù)蘇和培養(yǎng)永生化人真皮成纖維細(xì)胞系；當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80~90%時(shí)，收集成纖維細(xì)胞懸液；將成纖維細(xì)胞懸液注入微流控芯片的蛛網(wǎng)膜下腔通道；傾斜微流控芯片，使成纖維細(xì)胞粘附于腫瘤通道與蛛網(wǎng)膜下腔通道的交界面上；繼續(xù)孵育以促進(jìn)成纖維細(xì)胞形成穩(wěn)定的軟腦膜微結(jié)構(gòu)。

22、作為一種優(yōu)選，在步驟s42中，更換培養(yǎng)基包括以下步驟：在蛛網(wǎng)膜下腔通道的輸入端連接軟管，并與自動(dòng)注射泵相連；通過自動(dòng)注射泵注入無血清神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基，模擬體內(nèi)腦脊液的動(dòng)態(tài)流動(dòng)環(huán)境；調(diào)整自動(dòng)注射泵的流速，確保剪切應(yīng)力控制在0.1dyn/cm2以內(nèi)，以真實(shí)再現(xiàn)體內(nèi)腦脊液的流動(dòng)特性。

23、一種用于研究膠質(zhì)瘤car-t療法的動(dòng)態(tài)微流控芯片裝置，包括利用上述方法制備的微流控芯片；微流控芯片包括從左到右依次設(shè)置的血管通道、腦實(shí)質(zhì)通道、腫瘤通道和蛛網(wǎng)膜下腔通道；在血管通道、腦實(shí)質(zhì)通道、腫瘤通道和蛛網(wǎng)膜下腔通道中，均包括一側(cè)設(shè)置有進(jìn)樣口的細(xì)胞培養(yǎng)室；血管通道和蛛網(wǎng)膜下腔通道的細(xì)胞培養(yǎng)室，另一側(cè)分別對(duì)應(yīng)設(shè)置流出口；

24、所述血管通道用于共培養(yǎng)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人周細(xì)胞完成血腦屏障的重構(gòu)以及血流的模擬；

25、所述腦實(shí)質(zhì)通道用于星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的三維培養(yǎng)；

26、所述腫瘤通道用于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的三維培養(yǎng)；

27、所述蛛網(wǎng)膜下腔通道用于單層培養(yǎng)成纖維細(xì)胞完成軟腦膜的重構(gòu)以及流動(dòng)腦脊液的模擬。

28、作為一種優(yōu)選，腫瘤通道的細(xì)胞培養(yǎng)室為半圓狀、圓形或橢圓形結(jié)構(gòu)；蛛網(wǎng)膜下腔通道的細(xì)胞培養(yǎng)室為弧形管腔結(jié)構(gòu)。

29、作為一種優(yōu)選，還包括自動(dòng)注射泵，所述自動(dòng)注射泵的輸出端通過與微流控芯片連接，用于為微流控芯片注射穩(wěn)定流動(dòng)的液體，并定量控制注射液體的流量大小。

30、作為一種優(yōu)選，所述自動(dòng)注射泵包括推注頭、注射器、注射軟管和內(nèi)置驅(qū)動(dòng)電機(jī)的底座；推注頭、注射器和注射軟管依次設(shè)置，血管通道或蛛網(wǎng)膜下腔通道上的進(jìn)樣口通過注射軟管與注射器連接；注射器固定安裝于底座上，驅(qū)動(dòng)電機(jī)通過推注頭與注射器傳動(dòng)連接，從而驅(qū)動(dòng)推注頭帶動(dòng)底座上的注射器進(jìn)行注射。

31、一種如上所述的用于研究膠質(zhì)瘤car-t療法的動(dòng)態(tài)微流控芯片裝置的應(yīng)用，包括以下步驟：

32、s1、car-t細(xì)胞輸注：在血液通道中注入熒光標(biāo)記的car-t細(xì)胞與含血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基混合溶液，模擬靜脈遞送car-t細(xì)胞療法；

33、s2、跨膜遷移觀察：使用共聚焦實(shí)時(shí)成像跟蹤技術(shù)可視化car-t細(xì)胞的捕獲、粘附和外滲過程，并計(jì)算相關(guān)參數(shù)；

34、s3、生物標(biāo)志物檢測(cè)：通過測(cè)定蛛網(wǎng)膜下腔通道流出液中的特定生物標(biāo)志物水平，評(píng)估car-t細(xì)胞的抗腫瘤能力。

35、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

36、1、本發(fā)明通過增加蛛網(wǎng)膜下腔通道，形成了四條通道的設(shè)計(jì)。這種設(shè)計(jì)不僅更全面地模擬了體內(nèi)血腦屏障和腦脊液流動(dòng)環(huán)境，而且能夠更好地反映軟腦膜對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)、擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移的限制作用；并且本發(fā)明通過設(shè)置蛛網(wǎng)膜下腔通道，用于單層培養(yǎng)成纖維細(xì)胞以完成軟腦膜的重構(gòu)，并通過注入無血清神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基來模擬體內(nèi)腦脊液的動(dòng)態(tài)微環(huán)境，增強(qiáng)了模型的復(fù)雜性和真實(shí)性。

37、2、本發(fā)明通過將血管通道設(shè)置為細(xì)長(zhǎng)平行結(jié)構(gòu)，將腫瘤通道設(shè)置成寬胖半圓形，寬胖半圓形的腫瘤通道更能模擬大腦半球，更接近于生理?xiàng)l件下在腦室中膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境，在血管通道的結(jié)構(gòu)便于精確控制血流剪切力的同時(shí)，使腫瘤通道的結(jié)構(gòu)更適合膠質(zhì)瘤細(xì)胞的三維生長(zhǎng)，并利于療效的及時(shí)反饋，有助于提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性和可靠性。

38、3、本發(fā)明利用自動(dòng)注射泵實(shí)現(xiàn)了高度準(zhǔn)確的層流液體輸送，并根據(jù)不同病理?xiàng)l件調(diào)整剪切應(yīng)力范圍；此外，還提供了詳細(xì)的壁面剪切應(yīng)力計(jì)算公式，確保實(shí)驗(yàn)條件接近體內(nèi)真實(shí)情況。

39、4、本發(fā)明的car-t細(xì)胞能夠在不同流體剪切力下的跨膜遷移行為，并通過共聚焦實(shí)時(shí)成像跟蹤技術(shù)可視化這一過程。同時(shí)，引入了腦脊液生物標(biāo)志物檢測(cè)分析，如vegf、hgf、il-6等水平測(cè)定，用以評(píng)估car-t細(xì)胞的抗腫瘤能力。這種方法提供了更加直觀和量化的評(píng)價(jià)手段。

40、5、本發(fā)明構(gòu)建了一個(gè)更為完整且真實(shí)的血腦屏障-膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)系統(tǒng)，特別是在car-t細(xì)胞療法的研究中表現(xiàn)出更高的精度和效率。不僅能夠模擬復(fù)雜的生理和病理環(huán)境，還能為藥物篩選提供可靠的平臺(tái)，從而加速新型抗癌治療策略的發(fā)展。