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一種類芽孢桿菌的反向篩選標記、基因編輯載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

文檔序號:41948504發(fā)布日期:2025-05-16 14:06閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種類芽孢桿菌的反向篩選標記,其特征在于,類芽孢桿菌屬菌株為paenibacillussp.;所述的反向篩選標記為突變后的編碼類芽孢桿菌苯丙氨酸t(yī)rna合成酶α亞基的phes基因,命名為mphes基因;mphes基因?qū)е铝司幋a的類芽孢桿菌苯丙氨酸t(yī)rna合成酶α亞基發(fā)生了t255s和a309g雙取代突變,phes突變體通過與菌株自身的野生phes蛋白競爭,翻譯過程中將苯丙氨酸類似物對氯苯丙氨酸錯誤地摻入到合成的蛋白質(zhì)中,從而在對氯苯丙氨酸存在條件下,表達phes突變體的菌株死亡,不表達phes突變體的菌株生存。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的類芽孢桿菌的反向篩選標記,其特征在于,所述的mphes基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的類芽孢桿菌的反向篩選標記,其特征在于,所述的mphes基因編碼的phes突變體的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

4.一種用于無痕基因編輯類芽孢桿菌的質(zhì)粒載體,其特征在于,所述質(zhì)粒載體命名為pksp-2質(zhì)粒載體,是以pk18mobsacb為出發(fā)載體,用反向篩選標記mphes基因表達盒替換原始反向篩選標記sacb基因表達盒,再增加第二抗性篩選標記基因表達盒構(gòu)建獲得;第二抗性篩選標記不同于pk18mobsacb中原始的第一抗性篩選標記kanr。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒載體,其特征在于,所述第二抗性篩選標記基因表達盒為氯霉素抗性基因表達盒。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒載體,其特征在于,所述反向篩選標記mphes基因表達盒包括來源于嗜高溫芽孢桿菌屬的強啟動子sgsepromoter,所述sgsepromoter核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒載體,其特征在于,所述pksp-2質(zhì)粒載體核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

8.一種類芽孢桿菌無痕基因編輯的方法,其特征在于,利用權(quán)利要求1所述的反向篩選標記對類芽孢桿菌進行基因編輯,所述基因編輯包括基因的敲除、插入或替換。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的無痕基因編輯的方法,其特征在于,包括如下步驟:

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的無痕基因編輯的方法,其特征在于,步驟s2中,將含有同源臂/含有同源臂和目的基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到類芽孢桿菌后,先通過第二抗性篩選標記進行一次篩選,獲得陽性轉(zhuǎn)化子,再通過對氯苯丙氨酸篩選標記進行二次篩選,獲得基因編輯成功的菌落。


技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及一種類芽孢桿菌的反向篩選標記、基因編輯載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種類芽孢桿菌的反向篩選標記mpheS基因,其編碼的PheS突變體合成的tRNA可以將對氯苯丙氨酸組裝進蛋白導(dǎo)致菌體死亡,從而達到篩選的目的。該反向篩選標記可實現(xiàn)對編輯成功的菌株進行高效篩選,同時也適用于傳統(tǒng)同源打靶技術(shù)。為了進一步提升篩選效率,本發(fā)明還引入了高效驅(qū)動mpheS基因表達的強啟動子sgsEpromoter。本發(fā)明所提供的含所述反向篩選標記和sgsEpromoter序列的基因編輯質(zhì)粒載體,可以用于對類芽孢桿菌無痕、精準基因編輯,有助于深入研究類芽孢桿菌的遺傳特性,充分挖掘該菌的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員:劉洪濤,高玉,熊磊,朱天翔,張志剛,胡海明,胡白飛,鄭軍平
受保護的技術(shù)使用者:湖北中醫(yī)藥大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日:
技術(shù)公布日:2025/5/15
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